植物次生代謝產(chǎn)物生物堿的測定 液相色譜質(zhì)譜法征求意見稿

ICSFORMTEXT01.040.11FORMTEXT中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/TFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXFORMTEXTFORMTEXT植物次生代謝產(chǎn)物生物堿測定液相色譜質(zhì)譜法FORMTEXTDeterminationof11alkaloidsinbiologicalhumansamplesFORMTEXT點擊此處添加與國際標(biāo)準(zhǔn)一致性程度的標(biāo)識FORMDROPDOWNFORMTEXTFORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX發(fā)布FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX實施GB/TXXXXX—2017植物次生代謝產(chǎn)物生物堿測定液相色譜質(zhì)譜法范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了植物組織、動物組織、體液（血液、尿液）中東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）測定方法的試驗方法、結(jié)果計算、回收率與精密度、允許差等內(nèi)容。本標(biāo)準(zhǔn)適用于植物組織、動物組織、體液（血液、尿液）中東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素含量的測定。規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3試驗方法樣品經(jīng)提取液超聲提取、離心后，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定和確證，外標(biāo)法定量。4試劑和材料除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。4.1甲醇：色譜純。4.2乙腈：色譜純。4.310%乙腈溶液：10mL乙腈+90mL去離子水，混勻。4.4甲酸：色譜純。4.50.1%甲酸水溶液：準(zhǔn)確移取甲酸（4.4）1.0mL置于1L容量瓶中，用水定容至刻度。4.61%甲酸的乙腈溶液：1mL甲酸（4.4）+99mL乙腈（4.2），混勻。4.7無水硫酸鎂：分析純。4.8乙酸銨：色譜純。4.9氨水：色譜純。4.10100mM乙酸銨溶液：稱取乙酸銨（4.8）3.854g，用去離子水溶解，定容至500mL。4.11乙酸銨-氨水緩沖液（pH≈9）：取100mL100mM乙酸銨溶液（4.10），用氨水（4.9)調(diào)pH值到9±0.5。4.12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素的中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式參見附錄A表A.1，純度均不小于96%。4.13混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（4.12）分別置于50mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（于4℃避光保存，有效期2個月）。分別準(zhǔn)確移取東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素濃度為1mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于4℃避光保存，可使用一周。4.14微孔濾膜：0.22μm，有機(jī)相。5儀器和設(shè)備5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS）：配有電噴霧離子源（ESI）。5.2電子天平：感量為0.0001g和0.01g。5.3離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于9500r/min。5.4超聲波清洗儀。5.5氮吹儀：帶水浴，溫度可調(diào)。5.6渦旋混合器。5.7粉碎機(jī)。5.8離心管：10mL。5.9離心管：50mL。6分析步驟6.1試樣制備植物組織、動物組織樣品用粉碎機(jī)粉碎均勻。6.2試樣提取6.2.1植物組織、動物組織稱取植物組織樣品1g（精確至0.001g）于50mL離心管中，加入5mL去離子水，渦旋混合2min，加入10mL乙腈（4.2），渦旋混合1min，超聲輔助提取10min，加入4g無水硫酸鎂（4.7），迅速振搖1min，9500rpm離心5min。取上清液5mL在45℃水浴中氮吹濃縮至干，用1mL10%乙腈溶液（4.3）復(fù)溶，過微孔濾膜（4.14），待測定。6.2.2體液血液取血液試樣0.5mL于10mL離心管中，加入1mL乙酸銨-氨水緩沖溶液（4.11），渦旋混合1min，加入2mL甲醇（4.1），渦旋混合2min，超聲輔助提取10min，9500rpm離心5min，取上清液；殘渣加入2mL甲醇（4.1）重復(fù)提取一次，合并上清液，45℃水浴中氮吹濃縮至干，用1mL10%乙腈溶液（4.3）復(fù)溶，過微孔濾膜（4.14），待測定。尿液取尿液試樣1mL于10mL離心管中，準(zhǔn)確加入4mL含1%甲酸的乙腈溶液（4.6），渦旋混合1min后，向離心管中加入1.5g無水硫酸鎂（4.7），迅速振搖1min，9500rpm離心5min。取上清液2mL在45℃水浴中氮吹濃縮至干，用1mL10%乙腈溶液（4.3）復(fù)溶，過微孔濾膜（4.14），待測定。6.3儀器參考條件6.3.1液相色譜參考條件色譜柱：C18柱，100mm×2.1mm（內(nèi)徑），2.5μm，或相當(dāng)者；流動相：A：0.1%甲酸水溶液（3.2.6），B：乙腈（3.2.3），梯度洗脫，梯度洗脫程序參見表1；流速：0.30mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2μL。梯度洗脫程序表時間/minA/%B/%0.090102.090106.0752523752523.0190102590106.3.2質(zhì)譜參考條件電離方式：電噴霧電離，正離子模式；噴霧電壓：5.5kV；離子源溫度：500℃；氣簾氣壓力：0.21MPa；霧化氣壓力：0.34MPa；輔助氣壓力：0.34MPa；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，11種生物堿質(zhì)譜參數(shù)參見表2。11種生物堿質(zhì)譜參數(shù)序號No.物質(zhì)名稱Substancename母離子Parention(m/z)去簇電壓Declusteringpotential/V子離子Production(m/z)碰撞能Collisionenergy(V)1東莨菪堿Scopolamine324.270138.3*30156.3252番木鱉堿Brucine395.180244.250324.3*453烏頭堿Aconitine646.380586.3*47554.5524次烏頭堿Hypaconitine616.470556.2*45524505新烏頭堿Mesaconitine632.380572.2*45354.2606秋水仙堿Colchicine400.470310.135358.1*327阿托品Atropine290.380124.1*3593.1428士的寧Strychnine335.290184.2*50156.2609喜樹堿Camptothecin349.280305.2*35249.24010毛果蕓香堿Pilocarpine209.37094.9*34163.52911鬼臼毒素podophyllotixin415.380247.3*20397.215注：*定量離子6.4混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備取相應(yīng)的空白樣品，按照6.1.2步驟進(jìn)行處理，用得到的空白樣品提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（4.13）逐級稀釋得到東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、秋水仙堿、阿托品、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿、鬼臼毒素濃度為5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度由低到高進(jìn)行檢測，以定量離子峰面積對質(zhì)量濃度作圖，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。6.5測定步驟將試樣溶液注入液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀中，得到11種生物堿的質(zhì)譜響應(yīng)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測液中11種生物堿的濃度。樣品溶液中各組分的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣測定。6.6定性判定在相同條件測定樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如果樣品溶液中檢出的色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中的某種組分峰的保留時間一致（變化范圍在±2.5%），并且所選擇的兩對子離子的質(zhì)荷比一致，樣品溶液中定性離子相對豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中定性離子的相對豐度進(jìn)行比較時，相對偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在該組分。11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖參見附錄B圖B.1。表3定性確定時相對離子豐度的最大允許偏差相對離子豐度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≤10%允許的相對偏差±20%±25%±30%±50%6.7空白試驗除不加試樣外，均按上述測定條件和步驟進(jìn)行。7.結(jié)果計算7.1植物組織、動物組織結(jié)果按式（1）計算，計算結(jié)果保留小數(shù)點后兩位。

（1）QUOTEXi=Ci×V×K式中：Xi—樣品中待測組分含量，g/kg；Ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測試液中某種組分的濃度，μg/L；V—定容體積，mL；K—稀釋倍數(shù)；m—樣品質(zhì)量，g。7.2體液結(jié)果按式（2）計算，計算結(jié)果保留小數(shù)點后兩位。QUOTEXi=Ci×V×KvQUOTEXi=Ci×V×KvQUOTEXi=Ci×V×Kv式中：Xi—樣品中待測組分含量，g/L；Ci—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的測試液中某種組分的濃度，μg/L；V—定容體積，mL；K—稀釋倍數(shù)；v—樣品體積，mL。8精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。9其他本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限，植物組織、動物組織：阿托品為0.4μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為0.6μg/kg，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為1.0μg/kg，鬼臼毒素為2.0μg/kg；血漿、尿液：阿托品為0.4μg/L，次烏頭堿、新烏頭堿為0.6μg/L，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為1.0μg/L，鬼臼毒素為2.0μg/L。本標(biāo)準(zhǔn)的方法定量限，植物組織、動物組織：阿托品為1.0μg/kg，次烏頭堿、新烏頭堿為2.0μg/kg，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為4.0μg/kg，鬼臼毒素為5.0μg/kg；血漿、尿液：阿托品為1.0μg/L，次烏頭堿、新烏頭堿為2.0μg/L，東莨菪堿、番木鱉堿、烏頭堿、秋水仙堿、士的寧、喜樹堿、毛果蕓香堿為4.0μg/L，鬼臼毒素為5.0μg/L。

（資料性附錄）

11種生物堿的中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式11種生物堿的中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式參見表A.1。11種生物堿的中文名稱、英文名稱、CAS號、分子式、相對分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)式序號中文名稱英文名稱CAS號分子式相對分子質(zhì)量結(jié)構(gòu)式1東莨菪堿Scopolane\o"25914"51-34-3C17H21NO43032番木鱉堿Brucine357-57-3C23H26N2O4394.53烏頭堿Aconitine302-27-2C34H47NO11645.74次烏頭堿Hypaconitine6900-87-4C33H45NO10615.75新烏頭堿Mesaconitine2752-64-9C33H45NO11631.7表A.1(續(xù))序號中文名稱英文名稱CAS號分子式相對分子質(zhì)量結(jié)構(gòu)式6秋水仙堿Colchicine64-86-8C22H25NO6399.47阿托品Atropine51-55-8C17H23NO3289.48士的寧Strychnine57-24-9C21H23N2O2335.49喜樹堿Camptothecin7689-03-4C20H16N2O4348.310毛果蕓香堿Pilocarpine92-13-7C11H16N2O2208.311鬼臼毒素Podophyllotoxin4354-76-1C22H22O8414.4

（資料性附錄）

11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖11種生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總離子流圖參見圖B.1。1——毛果蕓香堿；2——東莨菪堿；3——士的寧；4——番木鱉堿；5——阿托品；6——.秋水仙堿；7——喜樹堿；8——新烏頭堿；9——次烏頭堿；10