羊肚菌菌種鑒定技術(shù)規(guī)程

DB13（網(wǎng)上征求意見稿）本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)定起本文件由河北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件主要起草單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)、河北匯珍食用菌有限公司本文件主要起草人:李守勉、王俊玲、龐立新、李肖、田景花、李國杰、李明、王民樂、張艷明、王田妹、張世青、李梅。本文件為首次發(fā)布。3.6羊肚菌菌種鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了羊肚菌菌種鑒定技術(shù)的術(shù)語和定義、抽樣、菌種質(zhì)量指標(biāo)、菌種質(zhì)量鑒定方法、判定規(guī)則、菌種標(biāo)簽、包裝、運(yùn)輸、貯存及檔案管理等。本文件適用于羊肚菌母種、原種和栽培種（以下簡稱“菌種”）的質(zhì)量檢驗(yàn)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T191包裝儲運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T12728食用菌術(shù)語GB/T30989高通量基因測序技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1284NY/T1742NY/T1846食用菌菌種中雜菌及害蟲的檢驗(yàn)食用菌菌種通用技術(shù)要求食用菌菌種檢驗(yàn)規(guī)程DB13/T5170日光溫室羊肚菌栽培技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義GB/T12728界定的以及下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1羊肚菌morchellaspp.羊肚菌屬（Morchella），因其外表凹陷形似羊肚而得名，是一種著名的食藥兼用菌。3.2萌發(fā)時(shí)間germinationtime適宜環(huán)境條件下，從接種到接種塊在培養(yǎng)基上恢復(fù)生長的時(shí)間。3.3定植率colonizationrate接種塊轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基上后，萌發(fā)的接種塊數(shù)量占總接種塊數(shù)量的比例。3.4菌種純度spawnpurity指某一菌種只含有特定品種的菌絲體。3.5菌種活力spawnvigor指菌種萌發(fā)及吃料能力。菌絲生長量mycelialgrowthincrement菌絲體在培養(yǎng)基質(zhì)中的生長距離。4抽樣菌種的抽樣應(yīng)符合NY/T1846的規(guī)定。5菌種質(zhì)量指標(biāo)5.1感官指標(biāo)樣品的感官指標(biāo)應(yīng)符合表1的要求。表1感官指標(biāo)無無無無無5.2微生物學(xué)及蟲害指標(biāo)應(yīng)符合表2要求。表2微生物學(xué)和蟲害指標(biāo)無無有在溫度20℃條件下培養(yǎng)，平均生長速率應(yīng)大于10定植率(%)6菌種鑒定方法6.5菌種活力檢驗(yàn)6.1感官鑒定應(yīng)符合NY/T1846的規(guī)定。6.2雜菌及害蟲檢驗(yàn)應(yīng)符合NY/T1284的規(guī)定。6.3菌種真實(shí)性鑒定6.3.1菌絲體培養(yǎng)將待鑒定菌種活化，用直徑為6mm的打孔器取厚度為1mm~2mm的菌絲圓片1片，接種于去除瓊脂的PDA液體培養(yǎng)基中，菌絲面向上，20℃避光靜置培養(yǎng)5d～6d，收集菌絲體備用。6.3.2基因組DNA提取采用CTAB法提取羊肚菌菌種菌絲體基因組DNA，提取方法參見附錄A，DNA濃度應(yīng)≥50ng/μL，A260/A280應(yīng)為1.8~2.0。6.3.3PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1/ITS4：TCCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參見附錄B。6.3.4電泳檢測將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳條帶，黑色羊肚菌類群（包括梯棱羊肚菌、六妹羊肚菌、七妹羊肚菌等）條帶大小應(yīng)為800bp，且無其他雜帶，將樣品進(jìn)行雙向測序，測序方法應(yīng)符合GB/T30989的規(guī)定。6.3.5數(shù)據(jù)庫比對將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blastn比對（/），初步分析測序菌株的分類地位。6.3.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建下載已報(bào)道的羊肚菌ITS序列，用Bioedit、Sequence軟件對序列對比調(diào)整后，進(jìn)行最大似然法(maximumlikelihood,ML)構(gòu)建羊肚菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹，確定測序菌株的分類地位。適宜生產(chǎn)的羊肚菌菌種分類地位應(yīng)為六妹羊肚菌、七妹羊肚菌、梯棱羊肚菌等。6.4交配型基因鑒定采用CTAB法提取羊肚菌菌種菌絲體基因組DNA，采用黑脈羊肚菌交配型基因特異性引物MAT1-1、MAT1-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參見附錄B。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄電泳條帶，MAT1-1-1和MAT1-2-1對應(yīng)的條帶大小分別為800bp和500bp，生產(chǎn)用菌種應(yīng)同時(shí)含有MAT1-1-1和MAT1-2-1兩種交配型基因。6.5.1平板繼代培養(yǎng)在直徑為9mm的培養(yǎng)皿PDA培養(yǎng)基中央接種抽檢菌種，接種塊大小約為（直徑）6mm×（厚）1mm~2mm，置于20℃避光培養(yǎng)2d～3d，當(dāng)菌絲生長至距離培養(yǎng)皿邊緣約0.5cm時(shí)，用直徑6mm的打孔器取菌落尖端菌絲的菌絲圓片，轉(zhuǎn)接至新PDA平板培養(yǎng)基中央進(jìn)行繼代培養(yǎng)。6.5.2菌種萌發(fā)檢驗(yàn)菌種塊應(yīng)在繼代培養(yǎng)約6h~12h內(nèi)萌發(fā)。6.5.3定植率測定每個(gè)測試菌種接種50瓶（袋），接種后5d菌絲萌發(fā)且定植的數(shù)量n，定植率X計(jì)算公式如下：X=………………（1）式中：X——定植率，%n——定植的總瓶（袋）數(shù)量m——接種的總瓶（袋）數(shù)6.5.4菌絲生長速率測定在繼代培養(yǎng)1d、2d、3d時(shí)，采用十字交叉法分別測量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長速率。羊肚菌菌絲平均生長速率應(yīng)大于10mm/d。6.5.5菌絲生長勢檢驗(yàn)菌落邊緣整齊，菌絲均勻一致，尖端菌絲健壯、分支清晰。6.5.6菌絲形態(tài)鏡檢繼代培養(yǎng)2d～3d后，采用10×40光學(xué)顯微鏡觀察主干菌絲與二級菌絲分枝的夾角，夾角應(yīng)小于65°,在100倍熒光顯微鏡下觀察菌絲單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核數(shù)量不少于8個(gè)。應(yīng)符合NY/T1846的規(guī)定。6.5.7菌核檢驗(yàn)繼代培養(yǎng)8d～12d后，菌落表面應(yīng)產(chǎn)生白色顆粒狀菌核，繼續(xù)培養(yǎng)菌核數(shù)量會增加，顏色由白色逐漸變成棕褐色；無菌核產(chǎn)生或菌核極少的菌種不宜用于生產(chǎn)。6.5.8菌落顏色檢驗(yàn)繼代培養(yǎng)10d～15d，菌落顏色應(yīng)為白色或淡黃色；菌落顏色呈黑褐色的菌種不宜用于生產(chǎn)。6.6栽培檢驗(yàn)6.6.1場地要求選擇溫度、濕度、光照、通風(fēng)等條件可控的出菇房、智能出菇箱或人工氣候培養(yǎng)箱等。6.6.2栽培方法宜采用塑料筐、塑料袋或床架覆土方式進(jìn)行出菇試驗(yàn)，每個(gè)樣品隨機(jī)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)栽培面積應(yīng)不少于3m2。栽培管理參見DB13/T5170。6.6.3菌種萌發(fā)檢驗(yàn)播種24h菌種應(yīng)萌發(fā)。6.6.4分生孢子檢驗(yàn)菌絲應(yīng)在播種5d～10d產(chǎn)生分生孢子，分生孢子潔白，均勻分布于土壤表面。6.6.5外源營養(yǎng)袋檢驗(yàn)擺放外源營養(yǎng)袋20d～25d，袋內(nèi)應(yīng)長滿羊肚菌菌絲。6.6.6羊肚菌原基檢驗(yàn)澆催菇水后7d~10d，土壤表面應(yīng)分化出大量健壯原基，并應(yīng)有分化為幼菇的趨勢。7判定規(guī)則7.1合格菌種感官檢驗(yàn)、雜菌及害蟲檢驗(yàn)、菌種真實(shí)性鑒定、交配型基因鑒定、菌種活力檢驗(yàn)、栽培檢驗(yàn)均符合要求的菌種為合格菌種。7.2不合格菌種感官檢驗(yàn)、雜菌及害蟲檢驗(yàn)、菌種真實(shí)性鑒定、交配型基因鑒定、菌種活力檢驗(yàn)、栽培檢驗(yàn)，以上任何一項(xiàng)指標(biāo)不符合要求的，為不合格菌種。8菌種標(biāo)簽、包裝、運(yùn)輸、貯存應(yīng)符合GB/T191和NY/T1742的規(guī)定。9檔案管理應(yīng)建立羊肚菌菌種檢驗(yàn)檔案，內(nèi)容應(yīng)包括但不限于感官檢驗(yàn)、雜菌及害蟲檢驗(yàn)、菌種真實(shí)性鑒定、交配型基因鑒定、菌種活力檢驗(yàn)、栽培檢驗(yàn)、菌種標(biāo)簽、包裝、標(biāo)志檢驗(yàn)等內(nèi)容，檔案應(yīng)保存3年以上。（資料性附錄）羊肚菌基因組DNA提取方法羊肚菌基因組DNA提取按照以下步驟進(jìn)行：a）將菌絲體用加液氮充分研磨至粉末狀，稱取0.5g菌絲于2ml離心管中；b）加入750μL裂解液（CTAB2％，pH=8.0），65℃水浴裂解40min，每隔10min顛倒混勻1次；離心10min；d）取500μL上清液轉(zhuǎn)置于新的2mL離心管中，加入等體積CA（氯仿:異戊醇=24∶1緩慢混勻，12000r/min離心15min；e）取350μL上清液于新的1.5mL離心管中，加入等體積CA（氯仿:異戊醇=24∶1），-20℃靜置沉淀2h；f）12000rpm/min離心8min，棄上清液，留下的DNA沉淀中加入70%乙醇，震蕩清洗DNA沉淀，離心棄上清液；重復(fù)該過程2~3次后，放置于超凈工作中晾干沉淀；g）加入100μLTE緩沖液溶解沉淀，加入1.5μLRNaseA，37℃水浴1h，-20℃冷藏保存?zhèn)溆?。（資料性附錄）PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序B.1羊肚菌菌種ITS測序鑒定PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序B.1.1PCR擴(kuò)增體系PCR擴(kuò)增的總體積為50μL，其中10×PCRBuffer5μL，dNTPs5μL，引B.1.2PCR擴(kuò)增程序94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。B.2羊肚菌菌