內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座專家講座

內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題（一）匯報人：張宇飛綿羊肺腺瘤病毒研究小組內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第1頁綿羊肺腺瘤病綿羊肺腺瘤病病原是綿羊肺腺瘤病毒（jaagsiektesheepretrovirus，JSRV），其主要臨床癥狀為咳嗽、呼吸困難、虛弱、漸進性消瘦、大量漿液性鼻漏；主要病變?yōu)榉闻茛蛐蜕掀ぜ毎╰ypeⅡ

pneumocytes）和無纖毛細支氣管上皮細胞（claracells）腺泡樣腫瘤性增生。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第2頁綿羊肺腺瘤病毒綿羊肺腺瘤反轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA為線性單股正鏈RNA，全長7642bp。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第3頁該病毒基因組RNA編碼區(qū)內(nèi)有相互重合gag、pro、pol和env基因經(jīng)典結(jié)構(gòu)。gag基因編碼病毒衣殼蛋白（capsidprotein，CA）、核衣殼蛋白（nucleocapsidprotein，NC）和基質(zhì)蛋白（matrixprotein，MA），而gag基因編碼區(qū)第513～1400bp段主要編碼衣殼蛋白，衣殼蛋白組成病毒粒子雙層殼內(nèi)殼，與病毒抗原性相關。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第4頁JSRVpro基因所編碼蛋白以聚合多肽蛋白前體Gag-pro形式表示。pro基因5’端和3’端分別編碼dUTP酶和羧基蛋白酶PR，dUTP酶能夠預防反轉(zhuǎn)錄酶誤裝配三磷酸脫氧尿苷，而PR負責裂解前體多肽蛋白。二者在病毒粒子反轉(zhuǎn)錄、成熟與包裝等病毒生活周期中起關鍵作用。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第5頁pol基因主要編碼病毒反轉(zhuǎn)錄酶（reverse

transcriptase，RT）和整合酶（integrase，IN），RT負責把病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為病毒cDNA，IN負責將前病毒DNA基因組整合至宿主細胞染色體DNA中。env基因主要編碼病毒囊膜蛋白，蛋白質(zhì)部分由二條肽鏈組成，較小一條鏈貫通病毒囊膜，稱為跨膜蛋白（transmembraneprotein，TM），較大鏈經(jīng)過二硫鍵和氫鍵與TM相連，稱為表面蛋白（surfaceprotein，SU）。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第6頁EndogenousRetrovirusesinTrophoblastDifferentiationand

PlacentalDevelopment在滋養(yǎng)層分化和胎盤發(fā)育過程中內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒SarahG.Black1,FredrickArnaud2,3,MassimoPalmarini2,ThomasE.Spencer1

得克薩斯大學

一、序言二、方法三、結(jié)果四、結(jié)論內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第7頁一、序言(Introduction)內(nèi)源性病毒是指病毒在首次感染機體或細胞后，其基因組被整合到宿主細胞DNA中，并成為宿主細胞基因組一部分，即以前病毒形式存在，前病毒DNA可經(jīng)過細胞分裂傳遞給子代細胞。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第8頁內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ERV）ERVs存在于全部脊椎動物基因組中并遵照孟德爾法則遺傳給下一代。ERVs在宿主基因組中大量存在，比如人基因組中大約有8~10%ERVs。一個完整ERVs前病毒和外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒有一樣基因結(jié)構(gòu)。假如ERVs表示產(chǎn)物對宿主有害話，宿主將會毀滅它們。ERVs存在于宿主基因組中，是長久進化結(jié)果。通常因為突變、缺失、重排和甲基化積累給予了ERVs不健全復制機制。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第9頁當代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒當代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是指在物種形成后才整合到宿主基因組中，而且非常靠近含有傳染性外源性逆轉(zhuǎn)錄病毒。這些當代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒包含綿羊肺腺瘤病毒、小鼠乳腺癌病毒、貓白血病病毒、雞白血病病毒。許多當代內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒能夠產(chǎn)生感染性病毒粒子，因為它們?nèi)狈︹g化突變。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第10頁ERVs在過去被認為是垃圾DNA，但最近研究表明ERVs對其宿主有主要生物學作用。因為完整開放閱讀框和轉(zhuǎn)錄活性支持了之一觀點。ERVs大量存在于各種動物生殖道和胎盤內(nèi)。完整ERVsenv基因在胎盤巨核細胞內(nèi)表示且維持了數(shù)千年。此基因表示產(chǎn)物可引發(fā)體外培養(yǎng)細胞發(fā)生融合。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第11頁二、ERVsinthehuman,mouse,andrabbitplacenta在人類、小鼠、兔子和綿羊胎盤內(nèi)反轉(zhuǎn)錄病毒人類小鼠兔子綿羊內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第12頁2.1人類HERV-W、HERV-FRD和ERV-3是3個人類內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒。他們完整env基因在人類胎盤中表示。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第13頁2.1.1HERV-WHERV-W不以完整前病毒存在與人類基因組當中，然而他env基因編碼蛋白叫做syncytin1,在核胞體滋養(yǎng)層細胞中優(yōu)先表示。syncytin1是一個糖蛋白且含有反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜蛋白特點，比如：前導肽、弗林蛋白酶切割位點、融合肽樣序列、公認免疫抑制區(qū)和跨膜區(qū)。這些大量體外信息都暗示了，syncytin1與人類胎盤當中單核滋養(yǎng)層細胞融合成雙核滋養(yǎng)呈細胞相關。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第14頁有些人經(jīng)過轉(zhuǎn)染HERV-W-env誘導了許多細胞系發(fā)生融合，當用抗HERV-W-env抗體處理細胞后細胞融合數(shù)量降低了。經(jīng)過高表示syncytin1和forskolin共同誘導BeWo細胞融合，當抑制滋養(yǎng)層細胞中syncytin1表示時，培養(yǎng)雙核滋養(yǎng)層細胞數(shù)量降低。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第15頁2.1.2HERV-FRDHERV-FRD囊膜蛋白被稱為syncytin2，它結(jié)構(gòu)與syncytin1類似。然而syncytin2要比syncytin1整合到人類基因組上要早得多。當瞬時轉(zhuǎn)染syncytin2時也能引發(fā)細胞融合。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第16頁2.1.3ERV-3ERV-3囊膜蛋白也出現(xiàn)在滋養(yǎng)層當中，但在他開放閱讀框中提前出現(xiàn)了終止密碼子，造成他失去了跨膜區(qū)等多個功效區(qū)。ERV-3囊膜蛋白不能引發(fā)細胞融合即使在BeWo細胞當中高表示ERV-3囊膜基因且同時用forskolin處理，也不能引發(fā)細胞融合。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第17頁ERV-3在滋養(yǎng)層細胞中穩(wěn)定表示，它可誘導滋養(yǎng)層細胞分化、人絨毛膜促性腺激素分泌量增加、形態(tài)改變。研究認為ERV-3-env在許多正常組織中表示，尤其在產(chǎn)生激素器官中包含腎上腺、皮脂腺和睪丸當中表示。他可能在激素分泌過程中飾演了主要角色。但150個健康白種人當中有1.5個人ERV-3-env基因提前終止（理論上沒有功效）。所以人們爭論ERV-3是否含有生物學功效。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第18頁內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第19頁2.2小鼠在小鼠胎盤迷路滋養(yǎng)層細胞中表示兩種內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜蛋白syncytinA和syncytinB。syncytinA和syncytinB是同源基因且高度保守。syncytinA在小鼠滋養(yǎng)層發(fā)育飾演了主要角色，因為缺失syncytinA小鼠胎盤里單核細胞不能融合形成多核細胞而發(fā)生流產(chǎn)。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第20頁２．３兔子最近，Heidmannetetal.發(fā)覺兔子反轉(zhuǎn)錄病毒囊膜基因且命名為syncytin－OryⅠ，他與人類syncytin特征相同。經(jīng)過生物信息學研究發(fā)覺在兔子胎盤中特定表示syncytin－OryⅠ在兔子基因組當中含有完整開放閱讀框。syncytin－OryⅠｍＲＮＡ被發(fā)覺在兔子胎盤連接處即胎兒組織侵入母體子宮兌膜后形成迷路滋養(yǎng)層中高表示。這與syncytin在滋養(yǎng)層形成過程中有主要作用觀點一致！內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第21頁２．４綿羊綿羊基因組當中最少有２７個拷貝ERVs，因為它們與外源性綿羊肺腺瘤（JSRV）非常相同，故命名為enJSRVs。JSRV是綿羊肺腺瘤病原，含有傳染性。JSRV不一樣于其它致癌反轉(zhuǎn)錄病毒是因為他致癌基因是囊膜蛋白。盡管JSRV囊膜蛋白引發(fā)細胞轉(zhuǎn)化過程中與促細胞分裂蛋白激酶（Ras-MEK-MAPK）、RacⅠ和磷酸次黃苷酸３激酶（PI3K-AKT-MTOR）信號轉(zhuǎn)導通路相關，但詳細機制還沒有完全搞清楚。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第22頁２７個enJSRV前病毒中有大部分因為缺失突變造成不完整。然而有５個enJSRV前病毒含有完整開放閱讀框。JSRV和enJSRV相同性非常高，所以enJSRV侵入綿羊基因組當中時間不長，甚至現(xiàn)在還一直在侵入。蒙古綿羊在不一樣妊娠時期（30d、50d、70d、90d、110d和130d）子宮和胚胎組織中都有enJSRVmRNA表示。經(jīng)過統(tǒng)計學分析得出：胎盤組織中enJSRV基因表示于90d時到達高峰，然后開始下降，直至妊娠130d時表示量到達最低；子宮內(nèi)膜組織中enJSRVmRNA表示于30d和50d相對較高；絨毛膜組織中enJSRVmRNA表示于妊娠50d時表示量最低，70d和110d相對較高。（徐萌杰博士論文）內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第23頁３、綿羊胎盤和孕體發(fā)育過程受精卵發(fā)育與運行

因為輸卵管管壁肌肉蠕動及輸卵管粘膜纖毛擺動，受精卵漸漸向子宮腔方向移動，在受精后3～4天抵達宮腔，在運行過程中進行有絲分裂，受精卵抵達輸卵管子宮端時已成為一個實心細胞團，形如桑椹，故稱桑椹胚。桑椹胚一面前行，一面繼續(xù)進行細胞分裂，外層細胞分裂較快，形成囊壁，稱為滋養(yǎng)層，是受精卵接觸母體部分，它將形成胎盤及其它胚外結(jié)構(gòu)。內(nèi)層細胞分裂較慢，形成內(nèi)細胞團，是胚胎發(fā)育始基。此時受精卵稱為囊胚或胚泡。約在受精后7～8天，滋養(yǎng)層細胞與子宮內(nèi)膜接觸時分化出合體細胞。子宮內(nèi)膜被合體細胞蛋白分解酶破壞，囊胚即侵入子宮內(nèi)膜致密層，子宮內(nèi)膜表面快速修復，囊胚即埋于子宮內(nèi)膜中。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第24頁內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第25頁約在受精后9～10天，內(nèi)細胞團很快增殖與分化，分裂成兩層，即外胚層與內(nèi)胚層。兩層細胞分裂都很快，并各形成一空腔，即羊膜腔與卵黃囊，二者之間組織稱為胚盤。第12天使形成卵圓形孕體，且之后開始慢慢變長。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第26頁內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第27頁在胚胎發(fā)育成桑椹胚后，桑椹胚深入發(fā)育，細胞開始出現(xiàn)分化。聚集在胚胎一端，個體較大細胞，稱為內(nèi)細胞團（innercellmass，ICM），未來發(fā)育成胎兒各種組織，而沿透明帶內(nèi)壁擴展和排列，個體較小細胞，稱為滋養(yǎng)層細胞，它們未來發(fā)育成胎膜和胎盤。絨毛膜滋養(yǎng)細胞在妊娠中期可分成兩種類型：合體滋養(yǎng)細胞和細胞滋養(yǎng)細胞。細胞滋養(yǎng)細胞有絲分裂活躍，形成新滋養(yǎng)細胞，新滋養(yǎng)細胞膜消失，融合形成合體滋養(yǎng)細胞。合體滋養(yǎng)細胞是人體正常細胞中唯一含有侵襲能力細胞，類似于腫瘤細胞，含有一定侵襲能力，這種能力對胚泡著床及胎盤形成都有十分主要意義。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第28頁BNC形成綿羊單核滋養(yǎng)外胚層細胞（mononuclear

trophoblasticcell，MTC）從妊娠第14天開始分化、移行，之后經(jīng)過核內(nèi)復制或融合作用形成滋養(yǎng)外胚層巨型雙核細胞（trophoblasticgiant

binucleatedcell，BNC），BNC繼而移行并與子宮內(nèi)膜腔上皮細胞（luminal

epithelium，LE）融合為三核細胞，三核細胞與BNC融合，形成多核合胞體，多核合胞體融聚成多核合胞體小半鞘翅（multinucleatedsyncytiaplaques）（20～25個核），最終形成胎盤子葉。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第29頁在母羊生殖道不一樣組織上皮中大量表示enJSRV。尤其在子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮當中可檢測到enJSRVmRNA和蛋白。有趣是，HYAL2(是JSRV和enJSRV受體)被專一檢測到在胎盤BNC和小半鞘翅中表示。有研究者經(jīng)過在妊娠8天母羊子宮內(nèi)注射嗎啉代，抑制enJSRV囊膜蛋白翻譯。結(jié)果單核滋養(yǎng)層細胞數(shù)量降低且BNC分化也減弱了。這讓許多科學家提出了綿羊多核合胞體形成假說。內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第30頁內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒專題講座第31頁當前，綿羊胎盤和孕體發(fā)育過程中enJSRV和HYAL2所起作用和詳細機制還沒有完全搞清楚。因為enJSRVEnv與exJSRVEnv高度相同。所以人們猜測enJSRVEnv與exJSRVEn