如何在CAR-T臨床制備與應用中優(yōu)化療效

目前，CAR-T療法已經(jīng)在血液惡性腫瘤方面取得了成果，但在實體瘤上還面臨著相當大的挑戰(zhàn)。這種對實體瘤療效不佳的原因可能包括已知的腫瘤特異性抗原數(shù)量有限、T細胞在到達腫瘤部位之前的持久性和適應性有限、實體瘤滲透性差和免疫抑制腫瘤微環(huán)境（TME）而影響CAR-T療效的參數(shù)也有很多，包括靶點、CAR結構、劑量等。CAR-T和其他過繼性療法（ACT）的早期研究和臨床試驗主要集中在細胞劑量上，而沒有描述T細胞的特定表型。不過，T細胞療法通常由眾多在參數(shù)上不同的異質(zhì)細胞組成，如記憶分化特征、活化和耗竭狀態(tài)、細胞因子釋放特征等。這些變量中的任何一個都會影響T細胞的功能，包括靶向和遷移到腫瘤的能力、細胞因子釋放、細胞溶解活性等。一、CAR-T療法優(yōu)化方向1.1記憶T細胞潛能CAR-T治療效果的一個關鍵參數(shù)是轉(zhuǎn)移性T細胞的記憶潛能。在抗原刺激后，初始T細胞（NaiveTcell，TN）迅速分裂（一周內(nèi)高達50000倍）為記憶T細胞和效應T（Teff）細胞，以清除被感染的細胞。其中，記憶T細胞包括幾種亞型：干細胞記憶T（TSCM）細胞、中央記憶T（TCM）細胞和效應記憶T（TEM）細胞，依次分化程度越高，增殖潛力降▲不同表型細胞特性（圖片來源：參考資料1）臨床前研究表明，經(jīng)過基因工程改造能夠特異性靶向腫瘤的T細胞群中，含有較高比例的TN和TCM會增強抗腫瘤功效。在CAR-T細胞療法中也觀察到了相似的趨勢，較高比例的TN、TSCM、TCM細胞在動物模型、患者來源的樣本和臨床試驗中均能夠有效提高抗腫瘤療效，這可能與這些細胞較Teff而言具有更高的增殖潛力有關，這樣能夠保持更好的持久性和達到峰值反應時更高的細胞數(shù)。此外，這些細胞群能夠釋放更高水平的抗腫瘤細胞因子，具有較高的活化標記（如CD28）表達和較低的耗竭標記（如TIGIT、LAG3、PD-1）的表達。一般來說，T細胞的分化在很大程度上是線性和單向的，將T細胞阻滯在早期分化階段可能是誘導更有效和持久的抗腫瘤反應的方法。根據(jù)細胞表面標記物以及培養(yǎng)基存在的細胞因子分析可以用于選擇出某種類型的記憶細胞，其中后者可以通過采用在培養(yǎng)基中加入磷酸肌醇3-激酶（PI3K）抑制劑來實現(xiàn)，這也是臨床上最先進的方法之一。BMS研發(fā)代號為bb21217的BCMACAR-T療法采用的就是這個策略，相較于其Abecma產(chǎn)品而言，bb21217富集了更多記憶型CAR-T細胞，有望使得患者達到更好的預期。不過，考慮到在沒有PI3K抑制劑的情況下，BCMACAR-T療法在MM中的總體有效率很高，且Abecma已順利獲批，要將bb21217進行臨床轉(zhuǎn)化以及證明其臨床改善具有挑戰(zhàn)性，故而BMS和2seventyBio宣布不再做進一步開發(fā)。1.2CD4:CD8比率最終T細胞產(chǎn)物的CD4:CD8比率被認為是治療效果的關鍵。CD4+T細胞對于激活和維持細胞毒性T細胞、誘導記憶反應有重要作用；CD8+T細胞的增殖能力較CD4+T強。CD4:CD8比例平衡的CAR-T療法共定位能力增強，總體抗腫瘤反應增強。這種協(xié)同作用可能是由腫瘤部位的CD4+T細胞分泌的Th1細胞因子引發(fā)的。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，平衡的CD4:CD8比例既能夠增加完全緩解率，同時使用的細胞劑量減少5-100倍。Breyanzi就是以固定的CD4:CD8比率制造的，通過交叉試驗比較，該產(chǎn)品的應答率與其他抗CD19CAR-T細胞產(chǎn)品相當，但細胞因子釋放綜合征（CRS）水平較低。1.3優(yōu)化患者預處理方式T細胞輸注之前用淋巴細胞靶向劑如環(huán)磷酰胺（Cy）、氟達拉濱（Flu）、抗CD52抗體或苯達莫司汀進行預處理是ACT增殖和植入的必要條件。目前的預處理標準是Flu和Cy組合，大約從ACT輸注前5天開始。但這些藥物的給藥差異或替代藥物的使用是否會改善CAR-T的活性和毒性仍在研究當中，在一項回顧性分析中，接受tisagenleucel治療的患者以使用Flu和Cy作為對照組，發(fā)現(xiàn)使用苯達莫司汀具有相同效果，但毒性有所改善。此外，預處理還具有其他有益作用，包括對腫瘤微環(huán)境（TME）的直接影響，有可能通過重塑TME與ACT的協(xié)同作用，以獲得更好的T細胞浸潤和更強的抗腫瘤反應。在研發(fā)CAR-T療法的同時，通過優(yōu)化預處理方案或許能夠取得更加理想的效果。1.4優(yōu)化激活信號1/2/3目前的ACT的制造依賴于來自患者的分離的T細胞的離體激活和擴增，T細胞激活需要三個信號：T細胞受體結合（信號1）、與共刺激分子結合（信號2）、引導和擴增T細胞分化和擴增的細胞因子（信號3）。這三種信號都在控制T細胞的表型和功能方面發(fā)揮著至關重要的作用。優(yōu)化ACT的策略包括調(diào)控這三個關鍵信號、調(diào)節(jié)下游信號通路等?？扇苄约有钥贵w和人工抗原呈遞細胞（APC）常用于提供信號1和2。有研究表明，CD3/CD28抗體能夠誘導更高的T細胞受體表達和增強腫瘤殺傷作用；構建人工APC的材料會影響T細胞受體，其大小和形狀會影響CAR-T細胞的生產(chǎn)。此外，還有多種藥物被探索作為刺激分子，如4-1BB刺激能夠延長CD27和CD28表達，能夠優(yōu)先擴增抗原反應性記憶細胞，誘導更多細胞溶解，延長T細胞持久性，與CD3/CD28共刺激聯(lián)合時，可以保留TCM▲信號1和2（圖片來源：參考資料1）除了在培養(yǎng)基中添加可溶性激動性抗體外和使用人工APC外，已經(jīng)開發(fā)出了寡核苷酸適配體，并被證明可以有效激活T細胞，這些適配體提供了一種潛在的更便宜、更容易制備的抗體替代方案，并被開發(fā)用于靶向其他共刺激信號通路。T細胞的擴增和分化可以通過多種細胞因子介導，其中細胞因子受體γ鏈(γc）家族是研究最廣泛的細胞因子之一，包括IL-2、IL-7、IL-15、IL-21等，具有調(diào)節(jié)先天性和適應性免疫系統(tǒng)，共同促進各種免疫細胞群發(fā)展的作用。而非γc細胞因子也已被發(fā)現(xiàn)會影響CAR-T功效。優(yōu)化體外T細胞制造的細胞因子數(shù)量、組合能夠或許是提高CAR-T有效性的一個方1.5調(diào)節(jié)下游信號通路通過控制T細胞激活信號下游的信號通路可以直接調(diào)節(jié)T細胞表型，這一策略主要針對PI3K–AKT–mTOR、Notch、WNT–β-catenin、MAPK/ERK等主要通路和T細胞代謝。阻斷PI3Ks、AKT1/2和mTOR，調(diào)節(jié)mTORC1的PIM激酶都已被證明能夠產(chǎn)生具有TSCM和TCM細胞特性的腫瘤反應性T細胞，增強抗腫瘤毒性。針對信號通路的調(diào)節(jié)，可以在培養(yǎng)基中添加對應物質(zhì)以重編程T細胞代謝，如加入L-精氨酸增強T細胞存活和抗腫瘤活性，添加醋酸鹽可以增強乙?；饔茫赥細胞處于激活狀態(tài)時增強效應器功能。不過在調(diào)節(jié)下游信號通路的途徑中可能會涉及到影響多種細胞功能，且在不同的時間與細胞中發(fā)揮不同的作用，故而直接操作這些途徑來調(diào)節(jié)T細胞表型時還需慎二、臨床供應的三大考量與CAR-T細胞制造過程相關的技術，特別是與激活和擴增相關的技術，仍處于早期開發(fā)階段。通過自動化技術擴大CAR-T的生產(chǎn)是一個迫切的需求，自動化平臺保證了更好的細胞活力、更高的轉(zhuǎn)導效率和更低的細胞亞群變異，減少對技術人員和科學家的依賴，能夠促進商業(yè)化和患者的可及性，同時將生產(chǎn)時間減少30%-40%。此外，開發(fā)端到端的生產(chǎn)系統(tǒng)可以促進建立分散式CAR-T制造。目前的CAR-T療法使用集中生產(chǎn)模式，一個符合生產(chǎn)規(guī)范（GMP）要求的生產(chǎn)基地為多個臨床中心提供服務。盡管這種集中式系統(tǒng)可能會簡化多個患者并行產(chǎn)品的生產(chǎn)，但它也大大增加了物流和配送方面的挑戰(zhàn)。模塊化、小型化和步驟集成，包括但不限于病毒生產(chǎn)、離體T細胞轉(zhuǎn)導、活化和擴增以及質(zhì)量控制，將使在治療中心制造CAR-T的自動化、端到端解決方案成為可能。這種分散化模式可以提高CAR-T的總生產(chǎn)能力，減少CAR-T制備時間擴大CAR-T生產(chǎn)的一個挑戰(zhàn)是在患者材料收集、制造、治療中心的過渡，可能會涉及試驗不同產(chǎn)品標識符、患者信息在制造過程中丟失等問題，這需要建立一個“數(shù)字供應鏈”，減少交付周期并確保CAR-T產(chǎn)品可以精確交付。2.2副作用CAR-T在回輸給患者后，可能會誘導明顯的副作用，包括細胞因子釋放綜合征和免疫效應toxilizumab（IL-6R拮抗劑）和類固醇，像利用anakinra等藥物治療還在探索中?？茖W家正在建立模型和預測算法，以確定可預測治療后細胞因子釋放綜合征和ICANS嚴重程度的2.3可及性CAR-T制備復雜，需要專門的設施和專業(yè)知識，這使得其難以在發(fā)展中國家/地區(qū)實施，并限制了其在低收入人群中的可用性。不同社會經(jīng)濟地位的患者在使用CAR-T治療方面存在巨大差異。在美國，只有7.3%的接受CAR-T療法的患者來自低收入社區(qū)，而非洲、南美洲、印度等幾乎沒有CAR-T試驗。數(shù)字醫(yī)療可以允許這些患者在線接受后續(xù)護理，并能夠與距離患者家更近的中心進行協(xié)調(diào)以減輕距離CAR-T定點治療區(qū)域較遠的低收入家庭的負此外，病毒載體、患者細胞以及制備好的CAR-T產(chǎn)品均需要冷鏈運輸，而中低收入國家缺乏可靠的低溫鏈，其建設需要大量的資金、設備以及專業(yè)技術人員支持，目前仍難以實現(xiàn)，但一些潛在的替代方面正在被開發(fā)，其中一個解決方案是使用干冰，不過其無法真正提供與冷鏈完全相同的性能，不是長遠之計；另一個方案是開發(fā)生物保存和冷凍制劑，這有可能減輕在次優(yōu)條件下運輸或儲存的風險，減少反復凍融對細胞產(chǎn)生的影響。三、總結盡管CAR-T療法已經(jīng)獲批上市取得重大突破，但其仍然有眾多需要優(yōu)化和改進的地方，