松材蟲病檢測(cè)技術(shù)及普查方法

松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)及普查方法第1頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)及普查方法第2頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病檢測(cè)技及術(shù)普查方法第3頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病簡(jiǎn)介

松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)松材線蟲病普查方法分類地位第4頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲屬墊刃目(Tylenehida),滑刃科(Aphglenchoididae)傘滑刃屬(Bursaphelenchus)。松材線蟲病第5頁(yè)/共93頁(yè)分布與危害松材線蟲病是由松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus)寄生在松樹體內(nèi)而導(dǎo)致樹木迅速死亡的一種毀滅性病害。美國(guó)早在1934年在路易斯安娜州一個(gè)鋸木廠的長(zhǎng)葉松中分離到的線蟲。1972年日本的真宮和清原確定了松樹萎蔫病的病原為線蟲,并將其命名為松材線蟲(Bursaphelenchuslignicolus)。目前分布于加拿大、墨西哥、日本、韓國(guó)、中國(guó)、葡萄牙、尼日利亞等多個(gè)國(guó)家,其中以日本受害最重。松材線蟲病第6頁(yè)/共93頁(yè)分布與危害我國(guó)自1982年在南京發(fā)現(xiàn)該病以來(lái),目前此病害已分布于江蘇、安徽、廣東、廣西、山東、浙江、湖北、湖南、重慶、福建、貴州、江西、云南、四川、陜西等15個(gè)省份(港澳臺(tái)未統(tǒng)計(jì)在內(nèi)）的部分松林。松材線蟲病對(duì)我國(guó)森林資源、自然景觀和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重破壞。該病已列于我國(guó)森林病蟲害之首。松材線蟲病第7頁(yè)/共93頁(yè)分布與危害該病危害的毀滅性在于致病力強(qiáng),寄主死亡速度快；傳播快,且常常猝不及防；一旦發(fā)生,治理難度大。它不僅給國(guó)民經(jīng)濟(jì)造成巨大損失,也破壞了自然景觀及生態(tài)環(huán)境,對(duì)我國(guó)豐富的松林資源構(gòu)成嚴(yán)重威脅。松材線蟲病寄主松材線蟲的寄主種類均為針葉樹，其中以松屬樹種為主，非松屬樹種很少。據(jù)國(guó)內(nèi)外資料記載，自然條件下感病的松屬樹種有36種，其中我國(guó)有9種:日本赤松(Pinusdensiflora)、日本黑松(P.thunbergii)、馬尾松(P.massoniana)、白皮松(P.bungeana)、第海8頁(yè)岸/共9松3頁(yè)(P.pinaster)寄主濕地松(P.elliottii)、硫球松(P.luchuensis)；非松屬樹種有8種:香脂冷杉(Abiesbalsamea)、歐洲云杉(Piceaexcelsa)、加拿大云杉(P.canadensis)、北美云杉(P.pungens)、歐洲落葉松(Larixeuropaea)、美加落葉松(L.americara)、雪松(Cedrusdaeodara)、大西洋雪松(C.atlantica)等幾十種松杉樹上。(其中第9頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病癥狀和發(fā)病過(guò)程松樹受松材線蟲侵染后,植株迅速枯死是松材線蟲病的重要特點(diǎn)。被松材線蟲侵染后,整個(gè)植株失水,蒸騰作用降低,同時(shí)樹脂分泌急劇減少、停止。無(wú)論是對(duì)自然感病株還是人工接種株的觀察,其外部癥狀都表現(xiàn)出針葉失去光澤,經(jīng)過(guò)短時(shí)間灰綠、黃綠的過(guò)程迅速變?yōu)辄S褐色,乃至紅褐色,同時(shí)第1陸0頁(yè)/續(xù)共93從頁(yè)局部波及整松材線蟲病癥狀和發(fā)病過(guò)程受松材線蟲侵染針葉當(dāng)年不脫落。被松材線蟲侵染后的植株木質(zhì)部往往由于蘭變菌的存在而呈現(xiàn)蘭灰色。一般從出現(xiàn)外部癥狀至死亡約1—1.5個(gè)月。病株在顯示外部癥狀之前9—14天,流脂量就顯著下降到微量或根本無(wú)流脂。病害多在7、8、9月份流行。大多數(shù)病株當(dāng)年死亡,少數(shù)翌年死亡。第11頁(yè)/共93頁(yè)癥狀和發(fā)病過(guò)程根據(jù)癥狀及發(fā)病過(guò)程可以對(duì)松材線蟲病進(jìn)行初步診斷,進(jìn)而可以取樣進(jìn)行線蟲分離。在尚未出現(xiàn)外部癥狀之前可以根據(jù)流脂量的變化進(jìn)行早期診斷。用手搖鉆在高1—1.3m樹干處鉆一直徑1cm的小洞,深至木質(zhì)部,2小時(shí)后觀察流脂情況。健康樹流脂量大,樹脂充溢,而病樹流脂少,甚至無(wú)流脂出現(xiàn)。此外,發(fā)病時(shí)間和死亡速度也是很重要的診斷依據(jù)。當(dāng)然,少數(shù)植株,或在溫度較低地區(qū)的植株也可能當(dāng)年感病,翌年死亡。第12頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病癥狀和發(fā)病過(guò)程松材線蟲病的重要特點(diǎn)是病樹迅速死亡。根據(jù)病樹的死亡時(shí)間，可將該病的癥狀分為三種類型:1.當(dāng)年枯死型:多數(shù)情況下，植株感病后，于當(dāng)年秋季表現(xiàn)全株枯死。在高溫干旱時(shí)，植株從線蟲侵入到枯死只需要3個(gè)月左右，從開始出現(xiàn)癥狀到死亡大約30-45天。典型病害癥狀的第出1出3頁(yè)現(xiàn)/共9，3頁(yè)大體上可分松材線蟲病第14頁(yè)/共93頁(yè)病害初期,植株外觀正常,但樹脂分泌開始減少；樹脂停止分泌,蒸騰作用減弱,樹冠；部分針葉失去光澤、變黃,此時(shí),一般能觀察到天牛或其它甲蟲侵害或產(chǎn)卵的痕跡；多數(shù)針葉變黃,植株開始枯萎,這時(shí),可以發(fā)現(xiàn)甲蟲的蛀屑；整個(gè)樹冠針葉由黃色變?yōu)楹稚蚣t褐色,全株枯死, 針葉當(dāng)年不落。發(fā)病4個(gè)階段的典型病害癥狀第一階段第二階段第15頁(yè)/共93頁(yè)發(fā)病4個(gè)階段的典型病害癥狀第三階段第四階段第16頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病第17頁(yè)/共93頁(yè)癥狀和發(fā)病過(guò)程2、越年枯死型：在溫度較低地區(qū)，有約10%松樹感病后，當(dāng)年不迅速枯死，而是次年春或初夏才枯死。3.枝條枯死型：在不利發(fā)病條件下，植株感病后，在1-2年時(shí)間內(nèi)，并不表現(xiàn)全株枯死現(xiàn)象。一般僅為樹冠上少量枝條枯死，隨時(shí)間推移，枯死枝條逐漸增多，直至全株。松材線蟲病第18頁(yè)/共93頁(yè)生物學(xué)特征松材線蟲由卵發(fā)育為成蟲,期間要經(jīng)過(guò)４齡幼蟲期。雌、雄蟲交尾后產(chǎn)卵,雌蟲可保持30d左右的產(chǎn)卵期,１條雌蟲產(chǎn)卵約100粒。在生長(zhǎng)最適溫度(25℃)條件下約4d１代,發(fā)育的臨界溫度為9.5℃,高于33℃則不能繁殖。由卵孵化的幼蟲在卵內(nèi)即脫皮１次,孵出的幼蟲為２齡幼蟲。 秋末冬初,病死樹內(nèi)的松材線蟲已逐漸停止增殖,并有自然死亡,同時(shí)開始出現(xiàn)另一種類型的３齡幼蟲,稱為分散型３齡蟲,進(jìn)入休眠階段。第二年春季,當(dāng)媒介昆蟲松褐天牛將羽化時(shí),分散型３齡蟲脫皮后形成分散型４齡蟲,特稱為dauerlarvae(DL),即休眠幼蟲(耐久型幼蟲)。松材線蟲病第19頁(yè)/共93頁(yè)生物學(xué)特征這個(gè)階段的幼蟲即分散型３齡、分散型４齡幼蟲在形態(tài)上及生物學(xué)特性上都與繁殖階段不同,如角質(zhì)膜加厚、內(nèi)含物增多、形成休眠幼蟲口針、食道退化。這階段幼蟲抵抗不良環(huán)境能力加強(qiáng),休眠幼蟲適宜昆蟲攜帶傳播。松材線蟲病第20頁(yè)/共93頁(yè)生物學(xué)特征松材線蟲的媒介昆蟲松褐天牛在華東地區(qū)一般為１年１代；廣東１年２－３代,以２代為主。在我們湖北地區(qū)１年１代,春天可見松材線蟲分散型３齡蟲明顯地分布在松褐天牛蛀道周圍,并漸漸向蛹室集中。這主要是由于蛹室內(nèi)含有大量的不飽和脂肪酸,如油酸、亞油酸、棕油酸等對(duì)線蟲產(chǎn)生趨化活性。當(dāng)褐松天牛即將羽化時(shí),分散型３齡蟲脫皮形成休眠幼蟲,通過(guò)松褐天牛的氣門進(jìn)入氣管,隨天牛羽化離開寄主植物。松材線蟲病第21頁(yè)/共93頁(yè)生物學(xué)特征松材線蟲對(duì)二氧化碳有強(qiáng)烈的趨化性,天牛蛹羽化時(shí)產(chǎn)生的二氧化碳是休眠幼蟲被吸引至氣管中的重要原因。在松褐天牛體上的松材線蟲均為休眠幼蟲,多分布于氣管中,以后胸氣管中線蟲量最大。此外也會(huì)附著在體表及前翅內(nèi)側(cè)。１只天?？蓴y帶成千上萬(wàn)條線蟲,據(jù)記載最高可達(dá)280萬(wàn)多條。當(dāng)松褐天牛補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)時(shí),大量的休眠幼蟲則從其啃食樹皮所造成的傷口侵入健康松樹。松材線蟲病第22頁(yè)/共93頁(yè)生物學(xué)特征松褐天牛在產(chǎn)卵期線蟲攜帶量顯著減少,少量線蟲也可從產(chǎn)卵時(shí)所造成的傷口侵入寄主。休眠幼蟲進(jìn)入樹體后即脫皮為成蟲進(jìn)入繁殖階段,大約以4d１代的速度大量繁殖,并逐漸擴(kuò)散到樹干、樹枝及樹根。被松材線蟲侵染了的松樹大抵是松褐天牛產(chǎn)卵的對(duì)象。翌年松褐天牛羽化時(shí)又會(huì)攜帶大量線蟲,并接種到“健樹”上,如此循環(huán),導(dǎo)致松材線蟲的傳播。松材線蟲病第23頁(yè)/共93頁(yè)傳播途徑一是自然傳播。在自然條件下,松材線蟲的擴(kuò)散主要是依靠傳媒天牛的自然活動(dòng)進(jìn)行的。目前認(rèn)為松材線蟲從傳媒天牛傳播到寄主松樹,傳媒天牛攜帶松材線蟲飛出病樹后,在健康松樹上補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)取食時(shí),松材蟲從傳媒天牛氣管爬出,并從天牛取食時(shí)在松枝上造成的傷口侵入到松樹體內(nèi)。自然傳播的速度是較慢的。松材線蟲病第24頁(yè)/共93頁(yè)傳播途徑二是人為傳播。帶有松材線蟲和傳媒天牛的病材、病枝及其加工制品等人為攜帶或運(yùn)輸工具等傳入到另一地區(qū)。這種傳播方式不受自然屏障限制,而且速度快,是最主要、也是最危險(xiǎn)的傳播方式。松材線蟲病第25頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲、松天牛、松樹三者之間的生物聯(lián)系松材線蟲和傳媒天牛以松樹寄主,離開了松樹等寄主植物,松材線蟲和傳媒天牛在自然條件下很難長(zhǎng)久存活,松材線蟲和傳媒天牛共同寄生在松樹體內(nèi),兩者為其共生關(guān)系。松材線蟲、松天牛、松樹三者之間的生物聯(lián)系沒(méi)有松褐天牛等媒介傳播,松材線蟲病很難轉(zhuǎn)移危害,松材線蟲使松樹樹勢(shì)衰弱,流脂減少或停止,提高了傳媒天牛卵及幼蟲的成活率,使傳媒天牛的種群增加,促進(jìn)了松材線蟲病的進(jìn)一步擴(kuò)展；傳媒天牛、松材線蟲不斷地相互促進(jìn),加快了松林的毀滅速度。.帶有傳媒天牛和松材線蟲病死木經(jīng)人為傳播和第2傳6頁(yè)/媒共93天頁(yè)牛遷飛,造成接種28天后的黑松苗和對(duì)照（倒“T”法）第27頁(yè)/共93頁(yè)病害發(fā)展過(guò)程2-(1第)28頁(yè)/共病9病3頁(yè)害發(fā)展過(guò)程2-(2)松材線蟲為害狀（馬尾松）第29頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲為害狀（黑松）第30頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病松天牛的分布及生物學(xué)在亞洲無(wú)論是我國(guó)，還是日本和韓國(guó)，松材線蟲最重要的傳播媒介均為松褐天牛。在日本已發(fā)現(xiàn)9種天牛攜帶松材線蟲，除松天牛外還有:(M.nitens)(白斑墨天牛)、(Acaloleptafraudatrix)(錦天牛的一種)、(Arhopalusrusticus)(褐幽天牛)、(Corymbiasuccedanea)(紅花天牛的一種)、(Uraechabimaculata)(雙斑泥色天牛)、(Spondylisbuprestoides)(短角幽天牛)、(Acanthocinusgriseus)(小灰長(zhǎng)角天牛)。第31頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病第32頁(yè)/共93頁(yè)松天牛的分布及生物學(xué)此外，在北部地區(qū)分布較多的(M.saltuarius)(云杉花黑天牛)與當(dāng)?shù)厮刹木€蟲傳播有關(guān)。在美國(guó)發(fā)現(xiàn)攜帶松材線蟲的天牛有:(M.Carolinensis)(卡墨天牛)、(M.scutellatus)(白點(diǎn)墨天牛)、(M.titilator)(南美松墨天牛)、(M.obtusus)、(M.mutator)和褐幽天牛等。但其中只有松褐天牛是重要的傳播媒介。松褐天牛的各種蟲態(tài)。第33頁(yè)/共93頁(yè)松褐天牛雌蟲（左）和雄蟲（右）第34頁(yè)/共93頁(yè)松褐天牛正在第35頁(yè)/共93頁(yè)取食松樹嫩枝。松樹嫩枝被松褐天牛取食的痕跡。12第36頁(yè)/共93頁(yè)松褐天牛產(chǎn)卵刻槽（下）和羽化孔（上）第37頁(yè)/共93頁(yè)被松褐天牛和松材線蟲為害致死的松樹木段。第38頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第40頁(yè)/共93頁(yè)室內(nèi)檢驗(yàn)a、抽樣和取樣:在調(diào)運(yùn)檢疫時(shí)抽取有上述癥狀的部分檢疫物，抽樣數(shù)量為每批次總件數(shù)的0.5-5.0%，但最低不得少于5件。若無(wú)明顯癥狀時(shí)可隨機(jī)抽樣。在進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)，則選取有松材線蟲病癥狀的樣株，根據(jù)具體情況砍取木段或鉆取木屑進(jìn)行室內(nèi)檢驗(yàn)。松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第41頁(yè)/共93頁(yè)在所選取的樣木（樣品）或樣株上鉆取少量木屑約10g，每樣3個(gè)重復(fù)。取樣時(shí)要注意選取靠近蛀道、蛹室的部位，所取樣品不得帶有樹皮。對(duì)所取樣品標(biāo)號(hào)后帶回實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)。必要時(shí)可將整件樣木(或樣品)帶回實(shí)驗(yàn)室備檢。b、分離線蟲:將各標(biāo)號(hào)樣品分別進(jìn)行線蟲分離。松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第42頁(yè)/共93頁(yè)分離線蟲可采用貝爾曼(Baermann)漏斗法或淺盤法。對(duì)媒介昆蟲進(jìn)行線蟲分離時(shí),可將其用剪刀或尖頭鑷子、解剖針等剪碎或撕碎后同樣采用上述方法進(jìn)行。分離時(shí)若室溫較低(不得低于7℃)可根據(jù)室溫高低將分離用水調(diào)至20—40℃(不得超過(guò)40℃)后浸泡分離材料,3—4小時(shí)線蟲游離出一定數(shù)量后即可鏡檢。一般情況24小時(shí)后鏡檢。松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)貝爾曼(Baermann)漏斗法:將大小適當(dāng)(直徑10—15cm)的漏斗末端接一段長(zhǎng)約10cm的乳膠管后置于漏斗架上，在乳膠管上裝一止水夾。剪大小適當(dāng)紗布兩層鋪在漏斗上。將帶到實(shí)驗(yàn)室的樣段去皮后劈成長(zhǎng)約3—4cm的細(xì)條或鉆取木屑，約取小木條(或木屑)10g置于漏斗上的紗布中，將紗布四角向中間第4蓋3蓋頁(yè)/上共93分頁(yè)離材料，然松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第44頁(yè)/共93頁(yè)注入清水浸沒(méi)。注入清水后要注意使水充滿漏斗和下面的乳膠管,不要產(chǎn)生空隙。鏡檢時(shí),用培養(yǎng)皿在漏斗末端接取線蟲分離液約5—15ml即可。貝爾曼(Baermann)漏斗法分離線蟲第45頁(yè)/共93頁(yè)淺盤法分離線蟲第46頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)淺盤法: 淺盤分離裝置主要由兩只不銹鋼淺盤組成,其中口徑略小的一只底部為粗網(wǎng)篩,放在另一只淺盤上面。將兩層紗布打濕鋪于篩盤上,把樣品劈碎(或木屑)置于篩盤的紗布上,慢慢注入清水,使水浸沒(méi)樣品。分離結(jié)束后,移去篩盤,把大盤內(nèi)的分離液集中于小燒杯內(nèi)。小燒杯內(nèi)的線蟲分離液可第4通7通頁(yè)/過(guò)共93自頁(yè)然沉降或離c、鏡檢:分別將各標(biāo)號(hào)盛有線蟲分離液的培養(yǎng)皿置于解剖鏡下觀察，先確認(rèn)有無(wú)線蟲。對(duì)有線蟲的樣品進(jìn)行活體檢驗(yàn)，觀察它的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)。然后盡量選擇幾條成熟、特征易觀察的線蟲，用針或吸管移至載玻片上的水滴中，使之沉底。將此載玻片在酒精燈火焰上方往返幾次，約5—6秒至蟲體突然伸直時(shí)停止，加蓋玻片后在顯微鏡下觀察。根據(jù)形態(tài)特征予以鑒別，以確定其是否為松材線蟲。分別記錄檢驗(yàn)結(jié)果。記錄第4的8頁(yè)/主共93要頁(yè)內(nèi)容和形式可批號(hào)樣號(hào)檢

驗(yàn)

日期（年、月、日）干枯藍(lán)變松天牛棲居痕跡有無(wú)線蟲（+、

–）備注檢驗(yàn)人第49頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲檢驗(yàn)記錄表松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第50頁(yè)/共93頁(yè)（3）鑒定a、線蟲的培養(yǎng):鑒定需要相當(dāng)數(shù)量的雌雄成蟲，但在檢驗(yàn)時(shí)分離到的線蟲往往是處于休眠階段的分散型3令蟲；有時(shí)雖可見雌雄成蟲，但數(shù)量較少；而從媒介昆蟲分離到的線蟲則只能是被稱為休眠幼蟲(DL)的分散型4令蟲，因此，需將上述情況的線蟲進(jìn)行培養(yǎng)，以獲得大量雌雄成蟲供鑒定。松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)真菌上的單異活體培養(yǎng):通常用于培養(yǎng)松材線蟲的真菌為灰葡萄孢(Botrytiscinerea)或多毛孢(Pestalotiasp.)。此外用鐮刀菌(Fusanumsp.)培養(yǎng)松材線蟲效果亦佳。將真菌菌種接至馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)平板或試管斜面上，在25℃條件下經(jīng)過(guò)4至5天，待菌絲鋪滿平板或斜面后即將經(jīng)過(guò)表面消毒的線蟲用吸管接到菌絲上。之后，在28℃條件下培養(yǎng)10—15天即可繁殖出大量線蟲。用少量清水將線蟲充分洗至小燒杯內(nèi)備用。第51頁(yè)/共93頁(yè)樣木保溫保濕培養(yǎng):將樣木劈開、鋸成小段，置于燒杯中，加少量清水，使木段下端浸在水中，木段上端用濕紗布覆蓋，在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3—4天，倒取杯底水液，亦可獲得較多的雌雄成蟲。接種線蟲的表面消毒:分離后獲得的線蟲懸浮液離心(1500轉(zhuǎn)/分)2—3分鐘濃縮至離心管底部，吸去上清液，用無(wú)菌滴管將底部線蟲液約2ml移至另一無(wú)菌離心管內(nèi)，加入2ml雙倍濃度的消毒液，輕輕振第5蕩2頁(yè)/混共93勻頁(yè)，一定時(shí)間后松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)松材線蟲表面消毒常用的消毒劑有:(a)3%雙氧水，處理10分鐘；(b)1%升汞，處理5分鐘；(c)0.002%放線菌酮和0.1%硫酸鏈霉素混合液，處理5分鐘；(d)硫酸鏈霉素(1000ppm)、金霉素(30ppm)和匹瑪霉素(pimafucin,0.63ppm)混合液，處理5分鐘等。培養(yǎng)后的大量雌雄成蟲則可通過(guò)形態(tài)觀察進(jìn)行鑒定。而對(duì)于新發(fā)生區(qū)還需要作進(jìn)一步的鑒定工作。第53頁(yè)/共93頁(yè)（2）臨時(shí)玻片的制作a、殺死和固定:將盛有線蟲懸浮液的小燒杯置于65℃水浴中2分鐘殺死線蟲，經(jīng)離心濃縮后即用三羥基乙胺福爾馬林固定液(TAF)固定。b、制片:在潔凈的載玻片上滴1小滴水，水滴大小以加蓋玻片后恰好充滿蓋玻片下的空間為宜。在解剖鏡下挑選經(jīng)固定后的雌雄成蟲各兩條，擺在水滴中并使其沉沒(méi)，從水滴的一側(cè)緩緩加上蓋玻片，避免出現(xiàn)氣泡，用熔化的蠟燭或指甲第54油頁(yè)/封共封93片頁(yè)。（3）蟲體測(cè)計(jì)第55頁(yè)/共93頁(yè)根據(jù)德曼氏(DeMan)公式分別測(cè)量蟲體上各個(gè)特征器官的長(zhǎng)短和位置,用不同的符號(hào)來(lái)表示,一般雌雄蟲各測(cè)20—60條,取平均值。L=體長(zhǎng)(微米) c=體長(zhǎng)/尾長(zhǎng)(自虹門至尾尖)b=體長(zhǎng)/頭端至食道和腸連接處之長(zhǎng) a=體長(zhǎng)/最大體寬V(%)=(頭端至肛門之長(zhǎng)/體長(zhǎng))×100St=口針長(zhǎng)度（微米）sp=交合刺長(zhǎng)度(微米)松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第56頁(yè)/共93頁(yè)（4）鑒定標(biāo)準(zhǔn)分類地位:松材線蟲BursaphelenchusxylophtIlus(SteineretBukrer)NickJe屬滑刃科(Aphelenchoididae)，傘滑刃屬(Bursaphelenchus)。它與滑刃屬(Aphelenchoides)的線蟲很相似。在形態(tài)上兩個(gè)屬的主要區(qū)別是傘滑刃屬線蟲的雄蟲尾部為一小的交合傘所包裹，而滑刃屬線蟲的雄蟲無(wú)此交合傘。松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)形態(tài)特征:成蟲蟲體細(xì)長(zhǎng)，約lmm。頭部唇區(qū)高，溢縮顯著，口針細(xì)長(zhǎng)，基部略微增厚，使口針基結(jié)清晰。中食道球卵圓形，占體寬的2/3以上，食道腺細(xì)長(zhǎng)葉狀，覆蓋于腸背面。排瀉孔的開口大致和食道與腸交接處平等。半月體在排瀉孔后約2/3體寬處。雌蟲熱殺死后體態(tài)呈開闊“C”形。尾部亞圓錐形，末端鈍圓，少數(shù)有微小的尾尖突(第不57頁(yè)超/共過(guò)93頁(yè)2微米)。松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第58頁(yè)/共93頁(yè)卵巢1個(gè),前伸,卵呈單行排列,陰門開口于蟲體中后部約73%處,開口處有后伸的寬的陰門前唇(陰門蓋)覆蓋。后子宮囊長(zhǎng),約為陰肛距的2/3。雄蟲熱殺死后體呈“J”形,尾端尖細(xì),側(cè)觀呈爪狀,向腹部彎曲,為卵形交合傘所包裹(腹面觀)。交合刺大,弓狀,成對(duì),喙突顯著,交合刺遠(yuǎn)端膨大如盤狀。松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第59頁(yè)/共93頁(yè)繁殖型幼蟲蟲體前部和成蟲相似。無(wú)生殖器官。蟲體后部則因腸內(nèi)積聚大量顆粒狀內(nèi)含物,以致呈暗色,結(jié)構(gòu)模糊。幼蟲尾部亞圓錐形,末端圓,或有難以看清的極短的尾尖突分散型3令蟲和繁殖型3令蟲比較,角質(zhì)膜顯著增厚,內(nèi)含物顯著增多,腸內(nèi)積聚類脂小滴。分散型4令蟲(DL)除角質(zhì)臘增厚、內(nèi)含物增多外,它沒(méi)有口針,食道退化,頭圈丘形,尾端明顯指狀,體表覆有保護(hù)性膠粘物。幼蟲尾部亞圓錐形,末端圓,或有難以看清的極短的尾尖突。松材線蟲的形態(tài)特征A.雌蟲 B.雄蟲C.雄蟲尾部 D.雄蟲尾部腹面觀,端生的交合傘 E.雌蟲陰門 F—H.雌蟲尾部第60頁(yè)/共93頁(yè)25413松材線蟲的主要形態(tài)1、雌蟲唇區(qū)（×14526） 2、雌蟲尾尖突（×10304） 3、雌蟲唇片（×14663）4、陰門（×16085） 5.第61交頁(yè)/合共9刺3頁(yè)（×9815）雌蟲陰門上覆以陰門蓋第62頁(yè)/共93頁(yè)雄蟲交合刺弓狀,尾部向腹面彎曲,尾端包有第63頁(yè)/共93頁(yè)（5）與擬松材線蟲（B.mucronatus）在形態(tài)上的主要區(qū)別第64頁(yè)/共93頁(yè)擬松材線蟲與松材線蟲雖然在致病力上相差懸殊，但在形態(tài)以及生物學(xué)諸方面卻很相似，且由于擬松材線蟲分布更為廣泛，因此在檢驗(yàn)時(shí)常?？梢姡阼b定過(guò)程中易混淆。兩者從形態(tài)上的鑒別主要依據(jù)雌蟲尾形的不同，擬松材線蟲雌蟲尾部呈圓錐形，尾端指狀，有明顯的尾尖突，長(zhǎng)約3.8至5.7微米。其幼蟲尾部與成蟲相似，尾尖突略短。對(duì)同樣有尾尖突的松材線蟲個(gè)體則以雌蟲尾尖突長(zhǎng)短來(lái)區(qū)分:尾尖突長(zhǎng)約1微米(不超過(guò)2微米)的為松材線蟲；尾尖突長(zhǎng)擬松材線蟲的形態(tài)特征第65頁(yè)/共93頁(yè)A.雌蟲B.雄蟲C.雌蟲前端 D.E.雌蟲的尾部 F.雄蟲尾部 G.雄蟲尾部腹面觀，端生的交合傘 H、I.三齡幼蟲的尾部J.休眠幼蟲的尾部K.休眠幼蟲的前端擬松材線蟲雌蟲尾部圓錐形,末端有明顯的指第66頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲雌蟲尾部亞第67頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病檢測(cè)技術(shù)第68頁(yè)/共93頁(yè)對(duì)于疫區(qū)來(lái)講,通過(guò)形態(tài)觀察基本上可以確定,但是在非疫區(qū)則需要作進(jìn)一步的鑒定。此外,由于取樣時(shí)間不同,樣木部位不同,其線蟲密度也有很大區(qū)別,這就導(dǎo)致有時(shí)分離到的線蟲數(shù)量很少,或找不到成蟲,無(wú)法確定其是否為松材線蟲,也需要作進(jìn)一步的鑒定。表二松材線蟲與擬松材線蟲尾形及尾尖突比較表第69頁(yè)/共93頁(yè)a、永久玻片標(biāo)本的制作:將2—3ml線蟲水懸液置于43℃烘箱中12分鐘殺死；加在同一烘箱中預(yù)熱的福爾馬林-甘油-蒸餾水(8:2:90)混合液固定24小時(shí)；加同樣預(yù)熱的苦味酸飽和液2滴后仍在同一烘箱內(nèi)緩慢脫水?；旌弦翰粩嗟?fù)]發(fā)，需及時(shí)添加放在同一烘箱內(nèi)的混合液。為避免揮發(fā)過(guò)快，在盛線蟲的玻皿上要加蓋，或?qū)⒉Ｃ笾糜谂囵B(yǎng)皿中。這個(gè)過(guò)程一般需6至8周。制片時(shí)選擇特征顯著的雌雄成蟲及幼蟲各1條置于載玻片的純甘油滴中央擺好并使其沉底。將3根粗細(xì)和線蟲體寬差不多的玻璃纖維呈三角形排列在甘油滴的外緣，甘油滴的量以加蓋玻片后不外溢為宜。用中性樹膠或硬甘油明膠凍封片兩次，待第一次封片劑完全第70頁(yè)/共93頁(yè)相對(duì)長(zhǎng)久保存的目的。2.利用指示劑在被檢木木屑的有機(jī)溶劑提取液中的顏色反應(yīng)進(jìn)行快速檢疫通過(guò)國(guó)家林業(yè)局森防總站對(duì)我國(guó)江蘇、安徽、浙江、廣東4個(gè)疫區(qū)5種松樹的試驗(yàn)結(jié)果表明:利用指示劑1號(hào)進(jìn)行快速檢疫檢驗(yàn)，其準(zhǔn)確率達(dá)黑松96%；馬尾松為89%；赤松為100%；火炬松為92%；濕地松為59%。除濕地松（采自江蘇）外，均已達(dá)到檢疫檢驗(yàn)所要求的準(zhǔn)確程度，可操作性強(qiáng)，顏色反應(yīng)直觀，準(zhǔn)確率高，簡(jiǎn)便快速，整個(gè)操作過(guò)程不超過(guò)15分鐘，且多個(gè)樣品可同時(shí)進(jìn)行。1)取樣數(shù)量每第批71頁(yè)總/共件93頁(yè)數(shù)的0.5%~5.0%用電鉆鉆取木屑第72頁(yè)/共93頁(yè)2.樣木乙醇提取液的制備配制70%~80%的乙醇溶液樣木乙醇提取液的制備將鉆取的木屑分別按標(biāo)記裝入各大試管中，倒入70%~80%的乙醇溶液，乙醇在試管中的高度約為木屑高度的1.5~2倍，管口用脫脂棉緊密封塞。立即將試管置于水浴鍋或保溫瓶中的80℃~90℃的熱水中，并使管中液體小沸10min。然后取出試管于冷水中冷卻后備用。顯色取與試樣對(duì)應(yīng)數(shù)量的指形管，對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào)。分別取上述冷卻后各試管中的上清液約2~3ml置入相應(yīng)指形管中。然后用滴管分別滴第73頁(yè)/共93頁(yè)4.顏色比較（1）指示劑1號(hào)對(duì)幾種松樹病、健木乙醇提取液的顏色比較表第74頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病普查方法第75頁(yè)/共93頁(yè)調(diào)查組織與責(zé)任縣級(jí)負(fù)責(zé)組織普查人員,確定責(zé)任區(qū),具體實(shí)施調(diào)查,樣本初步鑒定。市級(jí)負(fù)責(zé)參加重點(diǎn)區(qū)域調(diào)查,復(fù)檢可疑樣本,抽查核實(shí)縣級(jí)普查結(jié)果, 并對(duì)可疑新疫點(diǎn)進(jìn)行復(fù)查。松材線蟲病普查方法1.3省級(jí)負(fù)責(zé)督察與技術(shù)指導(dǎo)，新疫情發(fā)生區(qū)樣本檢測(cè)、認(rèn)定及疫情上報(bào)。2 調(diào)查范圍各級(jí)組織普查單位所在地行政轄區(qū)內(nèi)所有松林。重點(diǎn)是:交通沿線、風(fēng)景區(qū)、廠礦、松木制品生產(chǎn)和 使用單位（木材加工點(diǎn)、木材市場(chǎng)、建筑工地、倉(cāng)庫(kù)、駐軍營(yíng)房、電視機(jī)及配件廠、紡織機(jī)廠、通訊站、電站、電視塔、光纜和電第76頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病普查方法第77頁(yè)/共93頁(yè)纜架設(shè)設(shè)區(qū)）等人為活動(dòng)頻繁地區(qū)附近的松林,特別是與疫區(qū)比鄰地帶、曾從有疫情分布的國(guó)家或地區(qū)調(diào)入松木及松木制品（如電纜盤、墊木、設(shè)備包裝及鋪墊材料等）的地方。3調(diào)查時(shí)間每年春季 3-4 月和秋季 9-10 月份開展兩次全面普查。松材線蟲病普查方法第78頁(yè)/共93頁(yè)調(diào)查內(nèi)容查明發(fā)生分布地點(diǎn)、范圍、樹種、發(fā)生面積、病死樹數(shù)量，確定疫情分布邊界，繪制疫情分布示意圖、疫情分布詳圖。統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)松材線蟲病癥狀:針葉逐漸變?yōu)辄S綠、黃褐、紅褐色，整松材線蟲病普查方法第79頁(yè)/共93頁(yè)株萎蔫枯死或部分枝條萎蔫枯死，針葉當(dāng)年不脫落；樹干部多數(shù)有松褐天牛產(chǎn)卵刻槽、侵入孔；樹脂分泌減少、甚至停止，材質(zhì)干枯有藍(lán)變。病株率:在發(fā)病面積內(nèi)，按病株數(shù)除以松樹總數(shù)乘以 100 計(jì)算，即:病株率=病株數(shù)/松樹總株數(shù) ×100。危害程度純林以病株率為指標(biāo)，輕微一病株率低于中等一病株率O1％--1％、嚴(yán)重—病株率高于1％。松材線蟲病普查方法5.3.2混交林用發(fā)病范圍涉及的小班面積、比例、病死樹數(shù)量幾個(gè)指標(biāo)表示。發(fā)生面積純林以小班為單位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，無(wú)小班區(qū)劃的以實(shí)際面積統(tǒng)計(jì)；混交林折合成純松林面積統(tǒng)計(jì)。疫情發(fā)生點(diǎn):有疫情發(fā)生的鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）、國(guó)有林場(chǎng)。疫情發(fā)生第8區(qū)0頁(yè)/:共93疫頁(yè)情發(fā)生點(diǎn)所在松材線蟲病普查方法第81頁(yè)/共93頁(yè)調(diào)查準(zhǔn)備各級(jí)組織、實(shí)施普查的單位結(jié)合當(dāng)?shù)貙?shí)際制定具體實(shí)施方案。有關(guān)資料及常用工具和儀器行政區(qū)劃圖、森林資源分布圖。松林區(qū)的小班卡片。發(fā)生區(qū)松材線蟲病疫情分布現(xiàn)狀圖。周邊地區(qū)疫情發(fā)生情況、與疫區(qū)交往情況資料。松材線蟲病普查方法第82頁(yè)/共93頁(yè)調(diào)查表格望遠(yuǎn)鏡、手搖鉆(鉆頭直徑10-15㎜)或電鉆、鋸、斧或砍刀、塑料袋、標(biāo)簽、記號(hào)筆,生物顯微鏡、解剖鏡、玻璃漏斗、乳膠管、止水夾、離心機(jī)、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿等。調(diào)查方法踏查根據(jù)松林分布的特點(diǎn)和到當(dāng)?shù)卦L問(wèn)鄉(xiāng)鎮(zhèn)林業(yè)員、農(nóng)戶等,初步了解本地松樹死亡情況松材線蟲病普查方法第83頁(yè)/共93頁(yè)設(shè)計(jì)具體踏查路線在踏查中,發(fā)現(xiàn)可疑松樹,應(yīng)以林業(yè)小班為單位作進(jìn)一步詳查。抽樣抽樣對(duì)象的選取對(duì)發(fā)現(xiàn)的枯死、瀕死松樹首先排除其它死亡原因（如人畜破壞、森林火災(zāi)、凍害、水漬及其它病蟲害等）。查找是否表現(xiàn)松材線蟲病典型外部癥狀。松材線蟲病普查方法抽取尚未完全枯死或剛枯死不久的優(yōu)勢(shì)木（針葉呈黃綠或黃褐色，尚未完全枯萎，樹皮尚未脫落，材質(zhì)尚未腐朽）。抽樣時(shí)可考慮以下因素:a）7-8月份病植株陸續(xù)表現(xiàn)感病的外部癥狀，9-10月份為發(fā)病高峰期（出現(xiàn)典型病死樹最多），從出現(xiàn)初期外部癥狀至整株死亡約2周。b）在林分中一般是優(yōu)勢(shì)木先發(fā)病。第84頁(yè)/共93頁(yè)松材線蟲病普查方法第85頁(yè)/共93頁(yè)C）由于環(huán)境條件、接種線蟲量、抗性差異等原因,一些松樹僅部分枝條表現(xiàn)感病外部癥狀,這種現(xiàn)象在混交林中表現(xiàn)的尤其明顯。d）瀕死樹的針葉在小枝上下垂倒掛,當(dāng)年