《飼料及飼料原料中嘔吐毒素的快速篩查 膠體金快速定量法-江西省地方標(biāo)準(zhǔn)編制說明》

一、標(biāo)準(zhǔn)制定意義

（一）介紹

嘔吐毒素，又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是一種單端孢霉烯族毒

素，同時也是一種倍半萜烯化合物，分子量為296，易溶于水等極性溶劑中，性質(zhì)較為穩(wěn)定，

是一種無色的針狀結(jié)晶，具有較強的抗熱能力，熔點為151~152℃，在堿性與高壓環(huán)境下可

破壞部分毒素，但一般食物處理工藝，基本不能破壞其毒性。但用蒸餾水或者加入堿性物質(zhì)

的水沖洗染有霉菌的谷物，嘔吐毒素的含量可減少65%~69%，若用0.1mol/L的碳酸鈉溶液

浸泡24~72h，毒素的含量可減少42%~100%。

DON主要由禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌以及擬枝孢鐮刀菌等多種鐮刀菌屬產(chǎn)生，在小麥、

玉米、大麥等谷物和飼料中污染最為嚴(yán)重。國際癌癥研究機構(gòu)公布的評估顯示，嘔吐毒素可

致癌、致畸形、致突變，其毒性具體主要表現(xiàn)在細胞毒性、遺傳毒性和急慢性毒性、免疫毒

性作用幾個方面。近些年，科學(xué)家指出嘔吐毒素與食管癌、腎病等可能有直接關(guān)系。流行病

學(xué)表明，DON也可能影響人類免疫系統(tǒng)。嘔吐毒素與玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1、煙曲

霉毒素、赭曲霉毒素A等其他毒素也存在聯(lián)合污染，相互產(chǎn)生累加作用、拮抗作用、增強

作用以及協(xié)同作用等，將帶來更為嚴(yán)重的食品安全問題，給國民健康帶來一系列威脅，因此

引起了社會各界的高度重視。

（二）背景

據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計，全世界每年谷物產(chǎn)量的25%受到真菌毒素不同程度的

污染。隨著飼料工業(yè)的快速發(fā)展，近年來，中國的飼料也受到霉菌污染的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。自2006

年以來，玉米等飼料原料價格普遍上漲，致使很多飼料企業(yè)及養(yǎng)殖戶使用低質(zhì)飼料原料，加

上近年來氣候的變化，華北、東北地區(qū)降雨量增加，進一步加重了飼料原料中真菌毒素的污

染。而由于飼料原料和配合飼料中多種真菌毒素同時存在，在食用油等產(chǎn)品及牛奶中真菌毒

素污染也比較嚴(yán)重。在世界許多地方，目前真菌毒素已構(gòu)成重要的食品安全問題。

真菌毒素對人類和動物健康可產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，這一認(rèn)識導(dǎo)致了許多國家在近幾十年來

制定了諸多有關(guān)食品和飼料中真菌毒素的法規(guī)，以保護人類的健康，并保障生產(chǎn)者和貿(mào)易商

的經(jīng)濟利益。隨著全球經(jīng)濟一體化的進程，類似真菌毒素等涉及安全衛(wèi)生項目的限量標(biāo)準(zhǔn)，

越來越多地被利用為貿(mào)易保護主義中非關(guān)稅壁壘的重要手段。因此，為了保證食品安全，保

障消費者的健康，為了打破國外的技術(shù)壁壘，同時在合理有利的前提下，更多地樹立我國的

技術(shù)性壁壘，開展飼料中真菌毒素的檢測并建立標(biāo)準(zhǔn)方法是有效的方法之一。目前國內(nèi)應(yīng)用

標(biāo)準(zhǔn)檢測方法大多為儀器方法，所需儀器設(shè)備昂貴，不利于進行廣泛推廣，并且限制了很多

檢測單位高效、廣泛地開展檢測工作。建立符合中國國情的快速檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，具有檢測快

速、簡便、靈敏、成本低等優(yōu)點，為打開市場并占領(lǐng)市場提供了先決條件。

（三）限量標(biāo)準(zhǔn)、檢測方法及研究現(xiàn)狀

1、限量標(biāo)準(zhǔn)

目前，世界各國飼料、谷物等食類中DON限量標(biāo)準(zhǔn)還未統(tǒng)一。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB

13078.3-2007中規(guī)定：犢牛、泌乳期動物以及豬配合飼料中DON允許限量不能超過

1

1.0mg/kg，而家禽、牛配合飼料允許限量較高，不能超過5.0mg/kg，但未制定飼料原料（酒

槽中蛋白飼料參照農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1968-2010不能超過1.0mg/kg）中嘔吐毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。GB

2761-2017中規(guī)定：玉米、玉米面（渣、片）、大麥、小麥、麥片、小麥粉中DON含量均不

得超過1mg/kg。我國要求人類消費品中DON允許限量≤1mg/kg，但現(xiàn)今我國還沒有規(guī)定牛

奶中DON的限量標(biāo)準(zhǔn)，可見我國在毒素污染超標(biāo)程度判定方面尚不完整，還需相關(guān)部門不

斷修訂、完善相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，以此加強安全監(jiān)管。

國外方面，美國規(guī)定人類食用面粉中最高限量為1mg/kg，飼喂豬等動物的谷物中（除

過玉米）DON含量不得超過5mg/kg，且要小于總食用量的40%。歐盟規(guī)定谷粉及玉米粉中

允許限量≤0.75mg/kg，未加工的硬質(zhì)小麥、燕麥中DON含量不得超過1.75mg/kg。加拿大

規(guī)定牛、禽飼料中DON允許含量≤5mg/kg，嬰兒食品中最高限量為1mg/kg。俄羅斯規(guī)定硬

質(zhì)小麥、面粉中最高限量為1mg/kg。奧地利規(guī)定小麥、裸麥中DON最高限量為0.5mg/kg。

在巴西，研磨小麥和麥麩中DON不得超過2mg/kg，面食、餅干中DON不得超過1.75mg/kg。

2、檢測方法及研究現(xiàn)狀

真菌毒素的檢測方法主要有兩種，一是將色譜技術(shù)作為基礎(chǔ)的物理化學(xué)檢測方法，包括

高效液相色譜法（HPLC）和氣相色譜法（GC）等，而薄層層析法（TLC）由于操作過程太

復(fù)雜，國際上近些年使用這種方法檢測真菌毒素的情況越來越少；二是免疫化學(xué)檢測法，主

要指免疫親和柱法（IAC）以及酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。

GC可同時檢測多種真菌毒素且檢測限較低，但仍存在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不理想、測定

時DON需要進行衍生化、上一次進樣待測物品滯留、重復(fù)進樣變異系數(shù)大使得重現(xiàn)性較差

等一系列問題。HPLC法雖可精確進行定性定量測定，但是樣品前處理較為繁瑣、儀器昂貴

而成本高，同時需要專門的技術(shù)操作人員，因而一般用于大型企業(yè)、科研院校和專業(yè)檢測機

構(gòu)的定量分析。ELISA檢測嘔吐毒素，樣品前處理步驟簡單且可實現(xiàn)定量化，但這種生物

學(xué)方法，受環(huán)境因素影響大，所用抗體和酶特別容易發(fā)生變質(zhì)，如今市場上的同一物質(zhì)試劑

盒檢測結(jié)果差異性較大，穩(wěn)定性還有待提高。

相比較而言，膠體金免疫層析法無需大型儀器、所需輔助試劑少、交叉反應(yīng)率低、試紙

條易于保存且可單份測定，避免了分析步驟繁瑣、成本高等缺點，而且因其檢測更快速、操

作更簡單，測試人員無需進行專業(yè)培訓(xùn)，所以更適合食品安全快速檢測行業(yè)的快速檢驗和基

層檢測，尤其是野外和偏遠地區(qū)人員現(xiàn)場應(yīng)用此項技術(shù)十分方便，但是我國目前還沒有針對

飼料原料中嘔吐毒素膠體金免疫層析快速測定的標(biāo)準(zhǔn)方法，嚴(yán)重影響了該技術(shù)的推廣應(yīng)用。

（四）制定標(biāo)準(zhǔn)的必要性和意義

1、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量的需要

嘔吐毒素是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的代謝物，廣泛存在于糧油食品和飼料中。這些產(chǎn)毒真菌分

布于各級食物鏈，即使是在現(xiàn)今擁有先進的農(nóng)業(yè)技術(shù)和食品加工工藝的條件下，在作物種植、

收獲、儲藏和加工過程中，仍然無法避免和防止產(chǎn)毒真菌的危害。隨著我國經(jīng)濟快速發(fā)展，

人民群眾物質(zhì)文化生活水平不斷提高，對食品安全的關(guān)注進一步提高，迫切需要相應(yīng)的檢測

技術(shù)，鑒于傳統(tǒng)檢測方法的專業(yè)性要求高和成本昂貴的缺點，嘔吐毒素快速檢測技術(shù)的研究

及制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

2、實現(xiàn)以人為本，保證廣大群眾生命健康的需要

嘔吐毒素毒性很高，可通過污染谷物和那些來源于被嘔吐毒素污染了的飼料喂飼的動物

2

性食物（如牛奶、肉和蛋）而進入食物鏈，危害人類健康。其具有致癌、致畸形、致突變性，

還具有細胞毒性、遺傳毒性和急慢性毒性、免疫毒性，可能影響人類免疫系統(tǒng)。為了對國家、

人民高度負(fù)責(zé)，保障人民生命安全和農(nóng)村社會穩(wěn)定，研究嘔吐毒素快速檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)

的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。

3、適應(yīng)市場經(jīng)濟和加入WTO新形勢的需要

我國已經(jīng)加入WTO，我國農(nóng)產(chǎn)品已面臨國際和國內(nèi)兩個市場，為我國農(nóng)產(chǎn)品（勞動密

集型）進入國際市場提供了很好的機遇，但國際上十分重視農(nóng)產(chǎn)品的安全問題，而農(nóng)產(chǎn)品易

于被真菌污染，可能存在嘔吐毒素等真菌毒素殘留問題，這已成為影響出口創(chuàng)匯的最大制約

因素。由于毒素殘留超標(biāo)，引起外國拒收，退貨、扣留、索賠、撤消合同等事件經(jīng)常發(fā)生，

給我國農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)者造成很大損失，并影響了我國農(nóng)產(chǎn)品的形象。為了從源頭保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)

量，提高我國農(nóng)產(chǎn)品的競爭力，研究嘔吐毒素快速檢測技術(shù)并制訂相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)是非

常必要的。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定過程

《飼料原料中嘔吐毒素的快速篩查膠體金免疫層析法》標(biāo)準(zhǔn)由江西省獸藥飼料監(jiān)察所、

北京勤邦生物技術(shù)有限公司、雙胞胎（集團）股份有限公司、江西正邦科技股份有限公司負(fù)

責(zé)起草編寫。根據(jù)國家有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂工作的要求，標(biāo)準(zhǔn)起草單位在《飼料原料中嘔吐

毒素的快速篩查膠體金免疫層析法》的起草編制過程中，主要工作包括以下幾個方面：

（1）詳細查閱了國內(nèi)、國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)專業(yè)期刊上發(fā)表過的參考文獻等技術(shù)資料，

并對這些資料進行了詳細的對比，從方法的先進性、可靠性和實用性等幾個方面考慮，選取

了幾個代表性的參考資料作為標(biāo)準(zhǔn)起草中的主要技術(shù)參考文本。

（2）及時購置相關(guān)的實驗試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和其他材料；已將DON與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)

得到具有羧基官能團的半抗原；將DON半抗原與牛血清白蛋白和卵清蛋白分別進行偶聯(lián)得

到免疫原和包被原；已將制備獲得的抗原通過免疫小鼠獲得DON單克隆抗體；建立了膠體

金免疫層析法的反應(yīng)體系，摸索不同條件對方法進行最優(yōu)化，最終確定了最佳的檢測方法。

（3）開展多種飼料原料膠體金快速檢測方法的試驗，包括小麥、大米、黃豆、玉米、

豆粕、花生粕、DDGS，這是方法的重要步驟和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。不同樣品用同一種方法進行試驗

和驗證，確保本檢測方法能夠靈敏、特異、準(zhǔn)確地檢測出飼料原料中DON的含量。如：方

法的靈敏度，按照空白飼料原料樣品及0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg四種濃度

對飼料原料進行添加，確定檢測限；方法的準(zhǔn)確率，通過對經(jīng)驗證的陰陽性樣品進行檢測，

得到本檢測方法的假陰性率和假陽性率，盲樣測定與儀器方法的結(jié)果進行比對，確保本方法

的檢測結(jié)果可靠；方法的特異性，運用本方法對飼料原料中常見的其他真菌毒素進行檢測，

確保本方法能特異性地檢測飼料原料中DON殘留。

（4）在技術(shù)指標(biāo)完成試驗工作之后，嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)的格式，起草編寫標(biāo)準(zhǔn)文本內(nèi)容和

編制說明內(nèi)容。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定依據(jù)

本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》、GB/T

20001.4-2015《標(biāo)準(zhǔn)編寫規(guī)則第4部分：試驗方法標(biāo)準(zhǔn)》的要求而進行編寫的。有關(guān)技術(shù)

3

內(nèi)容是在參考國外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及文獻的基礎(chǔ)上經(jīng)研究、改進和驗證后制定的。

四、標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)內(nèi)容和技術(shù)指標(biāo)的論證

（一）技術(shù)原理

本方法應(yīng)用了競爭抑制免疫層析原理。將氯金酸用還原法制成一定直徑的金溶膠顆粒，

標(biāo)記抗體。硝酸纖維素膜為載體，利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢

向另一端滲移。在移動的過程中，會發(fā)生相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過免疫金的顏色而顯示

出來。樣本中的嘔吐毒素在流動的過程中與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制了抗體和硝

酸纖維素（NC）膜檢測線上嘔吐毒素-BSA偶聯(lián)物的結(jié)合，使檢測線不顯顏色，結(jié)果為陽牲；

反之，檢測線顯紅色，結(jié)果為陰性。

（二）膠體金免疫方法主要材料的制備

1、半抗原的合成及鑒定

DON為小分子物質(zhì)，不具備免疫原性，只有反應(yīng)原性，因此需要與大分子共價結(jié)合后

才能使動物免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，本實驗首先需要合成小分子半抗原與蛋白質(zhì)偶

聯(lián)的人工抗原。

DON小分子半抗原的制備既要保留其基本結(jié)構(gòu)特征，同時又要很好地與大分子蛋白結(jié)

合。本項目通過DON小分子結(jié)構(gòu)改造獲得具有羧基官能團的半抗原，與牛血清白蛋白（BSA）

偶聯(lián)合成免疫原，與卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)合成包被原。

將DON與鄰苯二甲酸酐反應(yīng)得到具有羧基官能團的半抗原，合成路線如下：

半抗原合成的具體步驟：30mg嘔吐毒素、60mg鄰苯二甲酸酐和0.1mL吡啶在5mL

DMSO中的混合液，在80℃下攪拌反應(yīng)15h，蒸除溶劑，柱層析純化得到鄰苯二甲酸單嘔

吐毒素酯，即為DON半抗原。

2、人工抗原的合成及鑒定

（1）免疫原的合成

將DON半抗原與BSA進行偶聯(lián)得到免疫原。

具體操作如下：

4

取8mg半抗原，溶解于0.8mL二甲基甲酰胺（DMF）中；取20mg碳化二亞胺（EDC）

用0.2mL水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取BSA

36mg，使之充分溶解在3mL0.1mol/LCB（pH9.6）中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶

液中，并于室溫下攪拌24h，用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天換3次透析液，得到DON

免疫原。

（2）包被原的合成

將DON半抗原與OVA進行偶聯(lián)得到包被原。

具體操作如下：

取8mg半抗原，溶解于0.8mLDMF中；取20mgEDC用0.2mL水充分溶解后加入半抗

原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；稱取OVA36mg，使之充分溶解在3mL

0.1mol/LCB（pH9.6）中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，

用0.01mol/LPBS4℃透析3d，每天換3次透析液，得到DON包被原。

（3）DON免疫原與包被原的鑒定

一般通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是否為有效偶聯(lián)，因為半抗原與蛋白

在紫外下有不同的特征吸收，當(dāng)偶聯(lián)成功時，偶聯(lián)物的紫外吸收會有二者的迭加效應(yīng)出現(xiàn)，

因此比著單獨的蛋白特征吸收會發(fā)生一定的偏移，可用于檢測偶聯(lián)是否成功。

偶聯(lián)比的測定

用pH7.4的PBS溶液稀釋DON半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白和兩種蛋白與DON

半抗原的結(jié)合物，配制成一定濃度的溶液，然后用紫外分光光度計進行全波長掃描，得到它

們的紫外吸收光譜圖。

根據(jù)公式K=A/CL分別計算出DON半抗原、牛血清白蛋白、卵清蛋白的摩爾消光系數(shù)。

在載體蛋白和DON半抗原的最大波長處檢測偶聯(lián)物的光吸收值，按公式計算兩種物質(zhì)在偶

聯(lián)物中的摩爾濃度比，即偶聯(lián)比：

Ca/Cb=（A偶264×KBSA280-A偶280×KBSA264）/（A偶280×KDON264-A偶264×KDON280）

蛋白含量的測定

將偶聯(lián)物稀釋到適當(dāng)倍數(shù)后，測定280nm和260nm的分光光度值，按公式計算蛋白的

濃度即偶聯(lián)物的濃度：

蛋白質(zhì)（mg/mL）=1.45×OD280-0.74×OD260

免疫原和包被原的鑒定結(jié)果

通過紫外掃描法鑒定半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)是有效偶聯(lián)，根據(jù)DON半抗原、載體蛋

白、偶聯(lián)物在特定波長的摩爾吸光系數(shù)估算半抗原與載體蛋白的結(jié)合比分別為13:1和11:1，

偶聯(lián)效果較好。

3、抗體的制備

（1）動物免疫

用無菌pH7.0的PBS液將合成的免疫原溶解，然后按免疫原（DON半抗原-BSA）與弗

5

氏佐劑（FCA）1:3的比例充分乳化制成油乳劑疫苗。首次免疫用弗氏完全佐劑疫苗，對8~10

周齡Balb/c小鼠進行免疫，頸背部皮下多點注射，免疫劑量為150μg/只。14天后二免，采

用弗氏不完全佐劑（FICA），免疫劑量同上；28天后三免，采用弗氏不完全佐劑，免疫劑量

同上；31天后加強免，不加佐劑，直接采用DON半抗原-BSA免疫。免疫過程見表1。

表1動物免疫過程

免疫過程免疫原免疫劑量/(μg/只)間隔時間

首免DON半抗原-BSA（FCA）150-

二免DON半抗原-BSA（FICA）15014天

三免DON半抗原-BSA（FICA）15014天

加強免（融合前三天）DON半抗原-BSA1003天

（2）單克隆抗體的制備

飼養(yǎng)細胞制備：斷頸處死8~10周齡Balb/c小鼠，浸泡在75%酒精中5min，隨即放入

超凈工作臺內(nèi)，腹部朝上放于平皿內(nèi)或固定于解剖板上。用眼科鑷子夾起小鼠腹部皮膚，用

剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流和污染。然后用剪刀向上下兩側(cè)做鈍性

分離，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mLRPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，

注入小鼠腹腔，輕輕抽回注射器，晃動小鼠腿部和尾部幾次。用原注射器抽回腹腔內(nèi)液體，

注入離心管。如此反復(fù)操作3~4次。1000r/min離心10min，棄上清。用20~50mL完全培養(yǎng)

液重懸細胞，100μL/孔滴加到培養(yǎng)板，置培養(yǎng)箱備用。

脾細胞制備：加強免疫后3天，取免疫Balb/c小鼠一只，眼眶采血后脫臼處死，在75%

酒精中消毒后取脾臟，去除結(jié)締組織，制備脾細胞懸液，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640

至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，加RPMI1640至30mL，計數(shù)待用。

骨髓瘤細胞制備：取3瓶生長狀態(tài)良好的（活細胞數(shù)>95%）骨髓瘤細胞，將之完全吹

下，轉(zhuǎn)移到50mL離心管中，加RPMI1640至30mL，1500~2000r/min離心5min，棄上清，

加RPMI1640至30mL，計數(shù)待用。

細胞混合：脾細胞:骨髓瘤細胞=8:1，混合，1500~2000r/min離心5min。

細胞融合：將混合好的細胞離心，倒干上清，把沉淀細胞塊彈成糊狀，置37℃水浴，

在1min內(nèi)加入1mL融合劑，融合劑為聚乙二醇（PEG）4000，作用2min，并輕輕攪拌細

胞，在隨后4min內(nèi)加入20mL無血清的PEG營養(yǎng)液，1000r/min離心10min，棄上清。用

20~50mL完全培養(yǎng)液重懸細胞，鋪種于含飼養(yǎng)細胞96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μL，置培養(yǎng)

箱中。

上清檢測：待細胞長至孔底的1/2~1/3時，采用間接競爭ELISA法測定細胞上清液，篩

選陽性孔。將陽性細胞在檢測后2天內(nèi)采用有限稀釋法進行亞克隆。10~14天后，再取細胞

上清檢測，最終得到了穩(wěn)定分泌DON的單克隆雜交瘤細胞株，將此細胞株進行擴大培養(yǎng)和

傳代。

老鼠致敏：液體石蠟致敏Balb/c小鼠，6~8周，注射體積500μL/只。10天后可制備腹

水。

注射細胞：收集雜交瘤細胞并用1640洗細胞兩遍，取100到150萬細胞注射于老鼠腹

6

腔，一周后可見老鼠狀態(tài)不活躍并且老鼠的腹腔腫大。

腹水采集：注射細胞一周后對腹腔腫大的老鼠用無菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔

一到兩天采集一次，這樣多次反復(fù)采集直到老鼠自然死亡。

單抗純化：采集到的腹水，用辛酸-飽和硫酸銨法進行純化，純化后的腹水放入-20℃環(huán)

境保存，腹水在使用前經(jīng)過0.01mol/LNaCl于4℃環(huán)境下透析48h，中間每隔6~8h換液一

次。

4、膠體金的制備

（1）玻璃器皿的準(zhǔn)備

用于實驗的所有玻璃器皿在實驗之前需要徹底清潔：將玻璃器皿先用自來水沖洗去除玻

璃器皿表面的灰塵，用酸液浸泡36h后，取出，用自來水洗凈酸液，再用蒸餾水洗3~4次，

再用去離子水把每個玻璃器皿洗三次，烤箱烘干后備用。專用的玻璃器皿用第一次生成的膠

體金穩(wěn)定其表面，棄去后以雙蒸水洗凈，可以減少金顆粒的吸附，玻璃器皿的表面污染會干

擾金顆粒的生成。

（2）檸檬酸三鈉還原法

取0.01%氯金酸水溶液100mL置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高

溫、持續(xù)攪拌的情況下加入1%檸檬酸三鈉水溶液2mL，繼續(xù)勻速攪拌加熱15min，溶液呈透

亮的紅色。室溫冷卻，用去離子水恢復(fù)到原體積，4℃保存。

（3）膠體金的質(zhì)量鑒定

肉眼觀察：用肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好無雜質(zhì)、透明度較

高，說明膠體金質(zhì)量較好，結(jié)果見圖1。

圖1肉眼觀察膠體金顏色

紫外掃描鑒定：取冷卻后的膠體金溶液進行400~600nm紫外掃描，確定最大吸收峰波長，

觀察最大吸收峰的峰形、峰寬，結(jié)果見圖2。其圖譜中最大吸收峰的峰寬較小，說明膠體金

顆粒分布比較均勻，最大吸收峰波長為523nm。

7

圖2膠體金的紫外/可見分光光度計掃描圖

透射電鏡鑒定：透射電鏡下觀察膠體金顆粒的大小是否均勻一致，有無橢圓形及多角形。

拍片放大后測量膠體金顆粒直徑大小，取多個點計算膠體金顆粒的平均直徑。膠體金顆粒的

透射電鏡掃描圖片見圖3。由圖3可知，在透射電鏡下觀察到膠體金顆粒的大小基本一致，沒

有橢圓形、多角形的金顆粒。將照片掃描后轉(zhuǎn)換成電子版圖片，放大后測量膠體金顆粒直徑

大小。隨機挑選10個膠體金顆粒通過計算得到金顆粒平均直徑為(20±0.5)nm。

圖3膠體金電鏡掃描圖片

（4）膠體金溶液的準(zhǔn)備

用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值為7.2。由于金顆粒容易吸附于電極上使之堵

塞，故不能用pH計測定膠體金溶液的pH值，一般使用精密pH試紙。

5、膠體金標(biāo)記抗體的制備

（1）穩(wěn)定膠體金最適抗體用量的選擇

以目測法確定穩(wěn)定膠體金的最適抗體用量。用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金溶液pH為7.2，

分裝9管，每管1mL。待標(biāo)記的抗體溶液用0.01mol/L，pH7.6的磷酸鹽緩沖液作系列稀釋為

50~400μg/mL，分別取0.1mL加入2~8管的膠體金溶液中。第1管加0.1mL三蒸水，混勻。靜

置5min后，在上述1~8管中加入0.1mL10%NaCl溶液，第9管加0.1mL三蒸水，混勻后靜置2h，

觀察結(jié)果。稀釋后抗體和其他試劑操作步驟見表2，結(jié)果見表3和圖4。

8

表2最適蛋白用量操作步驟

管數(shù)

試劑

123456789

抗體加樣量（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10.1

抗體濃度（μg/mL）050100150200250300350400

膠體金（mL）1.01.01.01.01.01.01.01.01.0

搖勻，靜置5min

10%NaCl（mL）0.10.10.10.10.10.10.10.10

搖勻，靜置2h后，觀察結(jié)果

備注：第1管為沒有加入抗體的對照管，其內(nèi)加入0.1mL三蒸水，第9管為沒有加入氯化鈉的對照管，其內(nèi)加

入0.1mL三蒸水。

表3目測法確定穩(wěn)定膠體金最適蛋白用量

管號123456789

蛋白添加量（μg）0510152025303540

終顏色藍灰紅藍紅紅紅紅紅紅紅

圖4膠體金與抗體比例試驗結(jié)果

由表3和圖4可知，未加抗體蛋白（1管）和加入抗體蛋白的量不足以穩(wěn)定膠體金的2管，

呈現(xiàn)由紅變藍的聚沉現(xiàn)象；未加入氯化鈉的9管顏色不發(fā)生變化；而加入抗體蛋白量達到或

超過穩(wěn)定膠體金的最小蛋白用量的3~8管保持紅色不變。其中含抗體蛋白量最低的3號試管即

含穩(wěn)定1mL膠體金所需的最小蛋白用量。在此基礎(chǔ)上再增加20%即為待標(biāo)記抗體蛋白的實際

用量，即穩(wěn)定膠體金的實際蛋白用量為每1mL膠體金溶液中添加12μg抗體蛋白。

（2）膠體金標(biāo)記抗體程序

在磁力攪拌下，用0.1mol/LK2CO3調(diào)節(jié)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入

抗體12μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入DON單克隆抗體，攪拌混勻10min，加入10%BSA使其

在膠體金溶液中的終濃度為1%，靜置10min。12000r/min，4℃離心40min，棄上清液，沉淀

物用體積為初始膠體金體積1/10的金標(biāo)抗體稀釋液（含0.5%的牛血清白蛋白、0.3%的表面活

性劑、10%的蔗糖，pH7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液）重懸，置4℃環(huán)境中備用。

9

（3）膠體金標(biāo)記抗體的鑒定

將羊抗鼠二抗點樣于NC膜上，直接與金標(biāo)抗體作用，可見有明顯的粉紅色斑點，表明

金標(biāo)抗體有活性。

（三）膠體金免疫方法的建立

1、固相載體的選擇

（1）吸水墊的選擇

取厚度為2.59nm，質(zhì)地均勻的Cottonlinters300作為吸水墊組裝試紙條，滴加樣品后

5min觀察吸水墊的情況，樣品吸收速度較快，故選擇Cottonlinters300作為吸水墊。

（2）硝酸纖維素膜的選擇

將抗原適當(dāng)稀釋后通過點樣方式分別包被在milipore135、UnisartCN140和mdi70三種

NC膜上，經(jīng)干燥、組裝試紙條后，置于陰性樣品中測試觀察樣品層析速度和檢測線顯色情

況，結(jié)果見表4。

表4NC膜點樣顯色結(jié)果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

注：＋＋＋，表示著色很深，與背景反差很大；＋＋，表示著色較深或著色很深但與背景反差較??；＋，

表示著色淡或著色較深但與背景反差很小；－，表示沒有著色，或與背景色沒有反差，表5-表18同此注釋。

由表4可知，不同孔徑及廠家的NC膜點樣后，均能顯色，但顯色程度略有不同，milipore

135顯色最深，UnisartCN140和mdi70差別不大。

不同NC膜組裝的試紙條加樣后樣品展開速度和加樣5min后的檢測線顯色結(jié)果見表5。

表5NC膜層析顯色結(jié)果

NC膜型號millipore135UnisartCN140mdi70

試劑展開速度慢較快快

5min后檢測線顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表5可知，milipore135加入樣品后層析速度較慢，5min內(nèi)檢測線顯色最深，UnisartCN

140試劑展開速度較milipore135快，但不及mdi70。UnisartCN140與mdi70上檢測線顯色情

況相差不多，但mdi70背景顏色較淺。所以，綜合層析速度與顯色情況，三種NC膜中，mdi

70更符合試紙條設(shè)計要求。

（3）金釋放墊的選擇

取6613和8964兩種金釋放墊，每墊分別加入5μL的金標(biāo)抗體后干燥，在陰性豆粕樣品中

測試觀察其結(jié)果（檢測線顯色程度以及5~8min金標(biāo)抗體的釋放程度）。結(jié)果見表6。

10

表6金釋放墊選擇結(jié)果

金釋放墊66138964

金標(biāo)抗體釋放情況釋放完全少量殘余

檢測線顯色情況＋＋＋＋＋

由表6可知，8964組裝的試紙條上檢測線較6613組裝的試紙條上檢測線顏色淺，檢測完

成后8964上有少量的金標(biāo)抗體殘余。故選擇6613作為金釋放墊。

（3）樣品墊的選擇

分別取BX-SB06、WFB、QXLM三種不同材質(zhì)材料作為樣品墊組裝試紙條，各滴加100μL

的陰性豆粕樣品，觀察樣品墊對樣品的過濾、吸收，以及樣品在NC膜上的層析和檢測線顯

色情況，結(jié)果見表7。

表7樣品墊選擇結(jié)果

樣品墊型號BX-SB06WFBQXLM

樣品吸收情況吸收完全吸收不完全吸收完全

檢測線顯色情況＋＋＋－＋

由表7可知，WFB對豆粕中各組分吸收能力非常差，作為樣品墊檢測豆粕時檢測線沒

有顯色。BX-SB06和QXLM都可以較大程度地吸收、過濾豆粕的蛋白等物質(zhì)，但QXLM對

于豆粕的層析速度的提高有較大局限性，層析速度較慢，且顯色較淺；而BX-SB06層析速

度相對快速，檢測線顯色明顯。所以，選擇BX-SB06作為樣品墊。

2、層析條件的選擇

（1）包被稀釋液和包被條件的篩選

分別用A、B、C、D四種不同配方的稀釋液將包被原DON半抗原-OVA做一定梯度稀釋，

在NC膜上點樣后烘干，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表8。

表8包被稀釋液篩選結(jié)果

包被原濃度包被液

（mg/mL）ABCD

0.025－＋－－

0.5＋＋＋－＋

1＋＋＋＋＋＋＋＋

2＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表8可知，使用不同的包被稀釋液，試紙條顯色結(jié)果有一定差異，其中包被稀釋液B

在稀釋至0.025mg/mL時，NC膜上點樣著色照樣很深，而其他包被稀釋液在稀釋至

0.025mg/mL時，顏色很淡或不顯色，故選擇包被稀釋液B作為實際用包被稀釋液。

11

用包被稀釋液B將包被原稀釋至1mg/mL，在NC膜上點樣后分別置于37℃烘干和室溫

（18~25℃）下自然干燥，時間設(shè)置為30min、1h、2h、8h、12h，組裝試紙條檢測陰性豆粕

樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表9。

表9包被條件篩選結(jié)果

包被時間

包被條件

30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表9可知，點樣后，包被稀釋液在37℃烘干和室溫（18~25℃）自然干燥的不同包被時

間差異不顯著。為減少外界因素對試驗的影響，包被條件選擇37℃干燥8h。

（2）封閉液和封閉條件的選擇

為減少NC膜對反應(yīng)的非特異性影響，采用封閉液對NC膜進行封閉，分別用A、B、C、

D四種封閉液封閉，37℃溫育30min后，用PBST洗液清洗2次，自然干燥后組裝試紙條檢測

陰性豆粕樣品，觀測膠體金在NC膜上的層析情況及檢測線的顯色情況，結(jié)果見表10。

表10封閉液篩選結(jié)果

封閉液ABCD

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋

由表10可知，封閉液D封閉后得到的斑點顏色很深，作為背景的NC膜呈白色，同斑點

顏色反差非常大，說明封閉液D封閉效果很好，將NC膜上的一些結(jié)合位點進行了封閉，使

金標(biāo)抗體不在NC膜上結(jié)合停留，除抗原點樣處為紅色外，NC膜其他位置都為白色。封閉液

A封閉后得到的斑點顏色也很深，但NC膜上呈深淺不一的粉紅色，降低了斑點同背景的反

差。封閉液B、C封閉后得到的斑點顏色較淺。說明封閉液D的封閉效果比其他三種封閉液

封閉效果好。

包被抗原點樣后，用封閉液D以不同的封閉時間30min、1h、2h、8h、12h分別在室溫

（18~25℃）、37℃條件下進行封閉，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察膠體金在NC膜上

的層析情況及檢測線的顯色情況，結(jié)果見表11。

表11封閉條件篩選結(jié)果

封閉時間30min1h2h8h12h

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表11可知，抗原點樣后，37℃封閉2~12h和室溫條件下封閉12h均能得到著色較深、背

景較淺的斑點。為縮短試驗時間、減少外界因素對試驗的影響，選擇的封閉條件為37℃封閉

2h。

12

（3）金標(biāo)抗體稀釋液和干燥條件的篩選

分別用A、B、C、D、E五種不同配方的稀釋液將金標(biāo)抗體做1:1、1:2、1:3、1:4稀釋后，

組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察顯色情況，結(jié)果見表12。

表12金標(biāo)抗體稀釋液篩選結(jié)果

金標(biāo)抗體稀釋液

稀釋倍數(shù)

ABCDE

1:1＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:2＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1:3＋＋＋－－＋

1:4＋－－－－

由表12可知，五種金標(biāo)抗體稀釋液顯色結(jié)果差異顯著，分析結(jié)果顯示經(jīng)稀釋液A稀釋1:4

的金標(biāo)抗體滴加到NC膜上時仍能顯色，而同樣情況下，其他稀釋液不顯色，故選擇金標(biāo)抗

體稀釋液A作為實際用金標(biāo)抗體稀釋液。

用稀釋液A將金標(biāo)抗體稀釋到1:2，取5μL涂布在金釋放墊上，分別置于室溫（18~25℃）、

37℃條件下干燥，時間設(shè)置為10min、20min、30min、60min、120min，觀察金釋放墊的干

燥度，組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，觀察金標(biāo)抗體釋放程度及檢測線的顯色情況，結(jié)果見

表13。

表13金標(biāo)抗體干燥條件篩選結(jié)果

干燥時間

干燥條件

10min20min30min60min120min

37℃＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

室溫（18~25℃）＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

由表13可知，金釋放墊在37℃、室溫下干燥時間大于30min時檢測結(jié)果差異不顯著，為

減少外界因素對試驗的影響，最終選擇37℃下干燥60min作為金釋放墊干燥條件。

（4）樣品墊展開劑的篩選

配制A、B、C、D、E五種不同展開劑作為樣品墊處理液，并將液體處理到BX-SB06上，

組裝試紙條檢測陰性豆粕樣品，對比五種展開劑對膠體金層析速度、樣品流動性的作用及顯

色情況。結(jié)果見表14。

表14樣品墊展開劑篩選結(jié)果

展開劑種類

ABCDE

顯色情況＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

13

層析速度

174182175163149

（樣本到達吸水墊的時間/s）

由表14可知，不同展開劑對樣品的流動速度及顯色差異較大。大體規(guī)律為層析速度越快，

金標(biāo)抗體與C、T線有越充足的時間結(jié)合則顯色越深，不過展開劑A的層析速度較B快，但顯

色比B淺，這可能是由于A中加入的表面活性劑影響了DON抗原抗體的結(jié)合。綜合考慮層析

速度與顯色情況，選擇展開劑E作為樣品墊處理液適宜。

（5）C、T線包被濃度及線寬的確定

利用已確定的包被稀釋液將抗原與二抗分別進行不同倍數(shù)稀釋，并制備成試紙條檢測，

測試結(jié)果顯示：二抗或抗原濃度太低時，試紙條上的C、T線顏色偏淺，不利于觀察；抗原

濃度太高則試紙條上T線太深，與C線對比反差明顯，且對檢測靈敏度有顯著影響。通過不

斷對比試驗，綜合考慮陰性顯色程度與陽性樣品添加測試，確定在層析材料上的抗原濃度為

0.2mg/mL，線寬為0.85μL/cm，二抗?jié)舛葹?.15mg/mL，線寬為1.0μL/cm。

（四）試紙條的組裝

試紙條的結(jié)構(gòu)如下所示：

加樣后的樣品流動方向

圖5膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖

注：1為樣品墊、2為金釋放墊、3為NC膜、4為吸水墊、5為檢測線、6為質(zhì)控線、7為PVC底板

樣品墊、金釋放墊、NC膜和吸水墊依次按順序黏貼在PVC底板上，金釋放墊從起始端

起有1/3區(qū)域被樣品墊覆蓋，金釋放墊的末端與NC膜的始端相連，NC膜的末端與吸水墊的

始端相連，樣品墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；可將試紙條

組裝入帶有加樣孔和觀察窗的特制塑料盒中制成試紙卡。

（五）試紙條檢測過程的優(yōu)化

1、樣品提取方法的研究

在研制本方法的過程中，盡量簡化樣品前處理的步驟，力求方法更加簡單、快速。對于

飼料原料樣品，一般需要簡單的過篩、粉碎過程。試驗摸索中發(fā)現(xiàn)，粉碎后的飼料原料樣品，

需加入提取液進行提取，將提取后的上清液加入到稀釋液中，混勻后，點樣。具體試驗過程

如下：

（1）樣品提取方式的選擇

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，加入提取

14

液6mL，選擇下述三種方式提取后，取200L上清液加入200L稀釋液混勻后進行檢測，結(jié)

果見表15。

表15樣品提取方式的選擇

提取方式

C（渦動3min，室溫

添加濃度A（渦動3min，室溫B（室溫3000r/min以

3000r/min以上離心

靜置5min）上離心5min）

5min）

0mg/kg＋＋＋＋＋＋

0.1mg/kg＋＋＋＋＋

0.2mg/kg＋＋＋

0.5mg/kg———

1.0mg/kg———

由表15可知，幾種方法處理后，當(dāng)樣品中含有DON標(biāo)準(zhǔn)品≥0.5mg/kg時，消線情況均良

好，但當(dāng)不加標(biāo)準(zhǔn)品或其濃度較低進行陰性測定時，方法C處理后顯色最好且梯度明顯。方

法A未離心，使得上清液中含有少量的沉淀，影響跑線效果。方法B中沒有渦動，導(dǎo)致樣品

與提取液不能充分混勻，提取效果較差。因此在樣品提取時，必須要渦動足夠時間并低速離

心后吸取上清液進行后續(xù)操作。

（2）樣品提取液的選擇

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，分別用水、

10%甲醇的水溶液、84%乙腈水作為提取液，各加入6mL，渦動3min，室溫3000r/min以上離

心5min，取200L上清液加入200L稀釋液混勻后進行檢測，結(jié)果見表16。

表16樣品提取液的選擇

提取液

添加濃度

水10%甲醇的水溶液84%乙腈水

0mg/kg＋＋＋＋＋＋—

0.1mg/kg＋＋＋＋—

0.2mg/kg＋＋—

0.5mg/kg———

1.0mg/kg———

由表16可知，當(dāng)提取液為84%乙腈水時跑不出線條，而用水和10%甲醇的水溶液提取后，

顯色結(jié)果差別不大，T線顯色深淺適中且梯度明顯。為方便現(xiàn)場快速檢測，實驗中樣品提取

液直接選擇水。

（3）樣本稀釋液的選擇

15

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)過篩和粉碎后，各稱取(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL

水，渦動3min，室溫3000r/min以上離心5min，按以下三種方案處理后檢測，結(jié)果見表17。

A：直接吸取上清液200L測定

B：取200L上清液加入200LPBS混勻后進行檢測

C：取200L上清液加入200L0.01mol/LpH7.4PBS（10%甲醇，0.05%吐溫-20）混勻后

進行檢測

表17樣本稀釋液的選擇

樣本稀釋液

添加濃度

ABC

0mg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.1mg/kg＋＋＋＋＋＋

0.2mg/kg＋＋＋

0.5mg/kg———

1.0mg/kg———

通常樣品提取后含有一定的雜質(zhì)，影響跑線速度和特異性結(jié)合率，實驗對比了不加稀釋

液和加兩種不同稀釋液的顯色情況，如表17所示顯色差別不是很大?？赡苁且驗榍疤幚碇杏?/p>

水提取時水相充足，足以浸潤樣品中的蛋白，加之離心后使得上清液中基質(zhì)干擾少，所以可

以不加稀釋液直接吸取上清液測定，為方便現(xiàn)場快速檢測，最終選擇方案A。

2、顯色時間的研究

取陰性豆粕樣品，及DON添加濃度分別為0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg的

陽性豆粕樣品，經(jīng)樣品前處理后，向樣品墊中加入100μL上清液，分別在反應(yīng)3min、5min、

8min、10min、15min后觀察結(jié)果，結(jié)果見表18。

表18顯色時間研究結(jié)果

顯色時間（min）

添加濃度

3581015

0mg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.1mg/kg＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.2mg/kg＋＋＋＋＋＋

0.5mg/kg＋————

1.0mg/kg－————

由表18可知，顯色時間為3min時，NC膜上試劑展開不充分，T線顯色淺，顯色梯度不

明顯；顯色時間為5min、8min、10min、15min時，T線顯色無明顯差異，考慮到試劑展開的

16

充分性以及實驗的快速性，選擇顯色時間為5min，T線顯色深淺適中且梯度明顯，為最優(yōu)方

案。

由此可見，飼料原料樣品前處理方法及檢測過程為：試樣經(jīng)過篩、粉碎后，稱取

(2.00±0.01)g至50mL聚苯乙烯離心管中，加入6mL水，渦動3min，室溫3000r/min以上離心

5min，向樣品墊中加入100μL上清液，加樣后5min觀察結(jié)果。

（六）檢測方法技術(shù)參數(shù)的確定

1、檢測限

取空白小麥、大米、黃豆、玉米、豆粕、花生粕、DDGS樣品各100份，按表19添加至

工作濃度，經(jīng)樣品前處理后進行檢測，結(jié)果見表20。

表19添加樣品準(zhǔn)備

添加濃度

小麥大米黃豆玉米豆粕花生粕DDGS

（mg/kg）

020份20份20份20份20份20份20份

0.120份20份20份20份20份20份20份

0.220份20份20份20份20份20份20份

0.520份20份20份20份20份20份20份

1.020份20份20份20份20份20份20份

合計100份100份100份100份100份100份100份

表20檢測限確定

添加濃度

樣品測定結(jié)果

（mg/kg）

－－－－－－－－－－

0

－－－－－－－－－－

－－－－－－－－－－

0.1

－－－－－－－－－－

－－－－－－－－－－

小麥0.2

－－－－－－－－－－

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.5

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1.0

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

－－－－－－－－－－

0

大米－－－－－－－－－－

0.1－－－－－－－－－－

17

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－－－－－－－－－－

0.2

－－－－－－－－－－

＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

0.5

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＋＋＋＋＋＋＋＋＋＋

1.0

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0

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0.1

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黃豆