飼料中牛、綿羊和山羊源性成分的定性檢測 實時熒光PCR法 編制說明

定性檢測實時熒光PCR法》（征求意見稿） 1 1 1 1 5 6 7 7 7 8 8 9 9 11 2.3.8絕對檢測限（Absolutelimitofdetection)測試 2.3.9相對檢測限（Relativelimitofdetection)測試 2.3.10方法的穩(wěn)健性（Robust 32 32 33 1根據《國家標準化管理委員會關于下達2023年國家標準復審修訂計劃的通瘋牛病(BSE)是發(fā)生在成年牛的一種慢性進行性高致死性神經系統疾病，屬表1我國主要動物源性成分檢測標準匯總飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應（PCR）法明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法常見畜禽動物源性成分檢測方法實時熒光PCR法熒光PCR法熒光PCR法2熒光PCR法轉基因動物及其產品成分檢測普通牛(Bostaurus)內標準基因定性黃羊源性成分檢測實時熒光PCR法牛和山羊源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法牛和馬源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法牛和豬源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法馬源性成分檢測方法實時熒光PCR法綿羊和山羊源性成分同步檢測方法實時熒光PCR法飼料中羊源性成分檢測方法（熒光定量PCR法）羊奶中羊、牛源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法動物產品中馬、驢、騾源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法食品中馬、驢源性成分定性檢測方法實時熒光PCR法食品中雞、鴨源性成分定性檢測方法實時熒光PCR法料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應（PCR）法》。但該標準存3山羊完全配對，與綿羊相差7個堿基，會導致綿羊成分漏檢。上?？诎对?003年曾經發(fā)現SN/T1119-2002標準的嚴重缺陷，重新設計綿羊的引物，連續(xù)從價在海關日常的進口飼料檢測中，檢測人員使用檢驗檢疫行業(yè)標準《SN/T2051-2008食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法》檢測出牛羊成分出現陽性結果需要退貨或銷毀時，客戶會提出使用國家標準GB/T1Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbmethod分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR檢42Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR3Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part3Porcmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR4Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part4ChickenDNAdemethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR5Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR6Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR7Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Part7Donkeymethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR8Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR檢測方法第8部分—火雞DNA檢測方法9Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-demethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCRMolecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimal-defoodstuffsandfeedstuffsbyreal-timePCR—Parmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR本項目修改采用建議參照ISO/TS20224-1:2020、ISO/TS20224-2:2020、5產品的質量安全，促進我國飼料工業(yè)、畜牧業(yè)和水光PCR法》制定任務后，對該標準的具體工作進行了認真研究，確定了總體工6 2024年6月，標準編制小組完成標準文本、編制說明定向征求意見稿編制7該標準在具有質量控制及檢驗水平的分子生物學實驗內可以使用便于檢測該檢測方法的相對檢測下限為0.1%（W/W)，絕對檢測下限均為5拷貝參考ISO/TS20224-1:2020《分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成2020《分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR檢測方法第2部分—綿羊DNA檢測方法》、ISO/TS20224-5:2020《分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實時熒光PCR檢測方法第5部分—山羊8DNA檢測方法》，開展方法學研究，建立了《飼料中牛、綿羊和山羊源性成分的定性檢測實時熒光PCR法》。DNA提取試劑或DNA提取試劑盒、熒光定量PCR擴增實驗配套試劑、蛋條引物配制成400nmol/L儲存液，將每條引物探針配制成200nmol/L儲存液，表3引物探針序列目標物種引物探針編號序列基因序列號18SrRNA參照方法118S-137bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3’XR_003508809.118S-137bp-R5’-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3’18S-137bp-P5’-[FAM]-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-[TAMRA]-3’真核生物18SrRNA參照方法218S-136bp-F5’-TCTGCCCTATCAACTTTCGATG-3’18S-136bp-R5’-ATTTGCGCGCCTGCTG-3’18S-136bp-P5’-[FAM]-TGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGC-[TAMRA]-3’18SrRNA參照方法318S-179bp-F5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG-3’18S-179bp-R5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG-3’18S-179bp-P5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’18SrRNA參照方法418S-159bp-F5’-TACCCCAGGGATAACAGCGC-3’18S-159bp-R5’-TCCGGTCTGAACTCAGATCACG-3’18S-159bp-P5’-[FAM]-TGTTAATCGTTGAACAAACGA-[MGB]-3’牛Bov-62bp-FF:5′-GGCCTCGGAGTGTGTATTCAG-3′NC_037352.1Bov-62bp-RR:5′-GCCCCAGAATGAGGTTCACTT-3′Bov-62bp-PP:5′-[FAM]-AGGTGCACAGTACGTTC-[NFQ-MGB]-3′綿羊Ovine-88bp-F5’-CCAACATGCCTTTAAACCCTCAA-3’AF041979.1Ovine-88bp-R5’-GGAACTGTAGCCTTCTGACTCG-3’Ovine-88bp-P5’-[FAM]-TGCCTTTCCTTCCCCGCCAGTCTC-[TAMRA]-3’Goat-87bp-F5’-GGAAGGAAAGAGAATGGGGATATGG-3’NC_030816.1Goat-87bp-R5’-TCTCCACACACAGCCAAAACC-3’Goat-87bp-P5’-[FAM]-ATCCATCTCTCCCTCCACTCCCTGCCTAA-[TAMRA]-3’9定儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Eppendorf5425小型臺式高速離心機（德國Eppendorf公司）；UFE500AO型烘箱（德國Memeert公司）；SPEX6850型冷凍碾磨機（美國SPEXSamplePrep公司）；QX1）；國產精補飼料陽性樣品的制備：使用犢牛精料補充料，分別添加5%含量的國產濃縮飼料陽性樣品的制備：使用種豬濃縮飼料，分別添加5%含量的牛國產配合飼料陽性樣品的制備：使用對蝦配合飼料，分別添加5%含量的牛為了保持檢測結果的一致性和提取方法的簡便性，本研究所用的DNA提取方法，除比較核酸提取方法1和核酸提取方法2的效果外，均采用核酸提取方法2表4PCR實驗反應體系—表5PCR反應程序反應溫度反應時間循環(huán)數預變性95℃10mins1熱循環(huán)（擴增）95℃4060℃通過檢測內參基因真核生物18SrRNA基因，可以判斷樣品所提取的DNA是否適合于PCR擴增。但目前關于18SrRNA基因檢測，空白對照出現擴增曲實驗樣品包括：18種動物肉類、3種植物種子、3種細菌（原核生物），表618SrRNA檢測實驗樣品1鴿23馬4驢5螺678雞9豬鵝鴨貓鹿狗陰性對照（細菌）、空白對照（水）也會出現擴增，檢測Ct值區(qū)域見表7。表7四套引物和探針檢測Ct區(qū)域比較1234使用18S-179bp-F/18S-179bp-R/18S-179bp-P引物和探針進行檢測，在樣品之間，陰性對照（金葡球菌、沙門氏菌、大腸桿菌等原核生物）和空白對照在表8檢測18SrRNA各樣品的Ct值Ct值樣品123456789均值1普通牛21.1021.1220.3421.0320.1520.8721.1721.0920.3320.3420.752美洲野牛20.2120.2421.0821.1220.3421.0420.2120.1920.4821.3320.623馬20.7620.2320.7820.2721.0121.2620.5620.7821.6521.4220.874驢19.0119.8819.5620.0120.3919.1819.7520.3319.8419.0719.705螺19.1219.8319.3220.2119.8720.4720.1919.5620.1419.3919.816綿羊20.1619.9920.2220.2919.6719.8820.5620.3920.9820.6920.28718.4819.3418.7619.0118.7319.5220.3319.8718.2718.3819.078雞21.9720.8821.2420.8621.3321.0522.3420.7721.0821.7621.339豬22.3522.3421.8922.7821.0922.1721.3922.7722.2922.0322.11鵝20.7119.3920.4420.2820.7820.2221.0119.5620.4920.3820.33鴨18.8219.0128.9819.3218.7318.5219.2218.5919.3319.3619.99貓24.9522.0523.7723.6223.7422.8524.2723.6223.6523.3223.58火雞20.3621.2221.3220.1821.2420.3120.4320.5421.0820.0820.68鹿21.2322.2221.1721.3122.0821.8322.0822.7921.0622.3321.81駱駝20.7120.3921.1621.3820.6620.3920.0621.3321.5620.0320.77狗19.3619.9920.2119.8320.1720.6920.3319.0620.3519.7819.78鴿19.7120.3120.7719.7319.7719.3620.0120.0319.7919.3819.89大鼠18.9819.9819.0318.8818.3218.7519.0319.2218.7318.9618.99玉米13.6913.7513.4414.2113.9913.2413.6414.2213.6913.7313.7620大豆14.5513.9913.7614.2214.3514.5214.2913.6614.8914.7214.3021苜蓿14.0114.6513.5714.4314.0913.7714.8214.8813.7914.0314.2022豬皮明膠31.7630.7731.2532.0831.4431.0531.3732.1432.3331.8431.6023明膠藥殼28.8728.6729.3228.3529.4529.8829.0328.0728.4928.7828.8924牛奶巧克力24.9325.7124.9925.3225.4824.8924.7725.4125.1325.3925.2025豆粉花生24.7725.3824.9624.7935.2725.3324.8424.3125.0325.4426.0126芥末南瓜籽25.8125.4425.7926.0425.4126.1225.8825.9225.4725.9625.7827曲奇餅干20.8120.0820.1220.1720.9820.7821.9121.3321.4921.0620.8728牛奶粉32.0332.3932.1732.3932.3332.1733.4533.1332.0932.8432.4929羊奶粉32.7933.4132.0533.1832.5832.1133.0932.4832.6232.7732.7130NegativeControl(金葡球菌)38.6240.5238.9939.3240.7741.0739.3838.7938.2240.6339.6331NegativeControl(沙門氏菌)37.6538.9538.7739.0337.7237.8838.6939.4138.0537.2138.3432NegativeControl(大腸桿菌)39.4739.7739.5340.7341.0839.4438.7839.6939.8839.0639.7433BlankControlO)40.1940.7740.1737.1537.7540.0741.0138.6239.2437.5139.25（2）本研究使用上海生工生物工程公司、大連寶生物、華大基因、上海英駿生物技術有限公司、ThermoFisherScientific（3）本研究將上海生工生物工程公司合成的引物和探針干粉直接寄至上海本項目在深入研究的基礎上，分析其原因可能是：TaqDNA聚合酶（Taq），物探針組對樣品進行檢測，每個濃度設置6個重復，PCR反應體系與反應程序表9樣品DNA稀釋濃度及對應Ct值123456利用數字PCR對梯度稀釋的樣品DNA進行檢測結果顯示，該結果同實時熒光PCR實驗的結果保持一致，說明有效區(qū)分陽表10數字PCR反應體系PCR反應總體積樣品4正/反引物探針0.5PCR擴增酶混合物水表11樣品濃度與拷貝數12345622注釋:“---”超出檢測線性范圍拷貝數明顯高于牛細胞，前者高于后者60倍左右。taurus)、印度瘤牛(Bosindicus)、美洲野牛Bison(Bisonb檢測結果為陽性；使用綿羊的檢測方法檢測時，綿羊(Ovisaries)的檢測結果為陽性，使用山羊的檢測方法檢測時，山羊(Caprahirc表1218SrRNA、牛、綿羊、山羊檢測方法特異性測試物種種類動物普通牛(Bostaurus)++--印度瘤牛(Bosindicus)++--美洲野牛(Bisonbison)++--牦牛(Bosmutus)++--綿羊(Ovisaries)+-+-山羊(Caprahircus)+--+駱駝(Camelusbactrianus)+---鯉魚(Cyprinuscarpio)+---貓(Feliscatus)+---雞(Gallusgallus)+---狗(Canisfamiliaris)+---驢(Equusasinus)+---鴨(Anasplatyrhynchos)+---麋鹿(Cervuscanadensis)+---金魚(Carassiusauratus)+---鵝(Anseranser)+---馬(Equuscaballus)+---小鼠(Musmusculus)+---恒河猴(Macacamulata)+- -鴕鳥(Struthiocamelus)+---野雞(Phasianuscolchicus)+---豬(Susscrofadomesticus)+---野豬(Susscrofa)+---鴿(Columbalivia)+---鵪鶉(Coturnixcoturnix)+---兔(Oryctolaguscuniculus)+ -大鼠(Ratusnorvegicus)+---虹鱒魚(Onchorhynchusmykiss)+---火雞(Meleagrisgallopavo)+- -水牛(Bubalusbubalis)+---人(Homosapiens)+---植物苜蓿(Medicagosativa)+- -玉米(Zeamays)+---油菜(Brassicarapa)+---大米(Oryzasativa)+---高粱(Sorghumbicolor)+- -大豆(Glycinemax)+---小麥(Triticumaestivum)+---2.3.8絕對檢測限（Absolut術對克隆質粒的拷貝數進行精確定量檢測，準確稀釋到1000拷貝/μL。將定量測方法進行檢測，結果顯示所建立的牛、綿羊、山羊成分PCR檢測方法在DNA濃度為1拷貝/μL（5拷貝/PCR反應）時都能1說明所建立的牛、綿羊、山羊成分PCR檢測方法的絕對檢測限可達5拷貝/PCR表13牛、綿羊、山羊檢測方法的絕對檢測限測試牛DNA濃度/（拷貝/μL）靶序列拷貝數/（拷貝/PCR反陽性結果百分比（%)貝/μL）貝數/（拷貝/PCR反陽性結果百分（%)DNA濃度/（拷貝/μL）貝數/（拷貝/PCR反應）陽性結果百分比（%)4442221515152221112.3.9相對檢測限（Relativ20表14牛、綿羊、山羊檢測方法的相對檢測限測試牛質量百分比陽性結果百分比(%)質量百分比陽性結果百分比(%)質量百分比陽性結果百分比(%)5.05.05.02.02.02.00.0150.0%0.0141.7%0.0133.3%0.0010%0.0010.0%0.0010%使用牛、綿羊、山羊PCR成分檢測方法進行檢測，結果顯示所建立的牛、綿羊、），表15牛、綿羊、山羊檢測方法的相對檢測限測試牛質量百分比陽性結果百分比(%)質量百分比陽性結果百分比(%)質量百分比陽性結果百分比(%)5.05.05.02.02.02.00.0125.0%0.0150.0%0.0141.7%210.0010%0.0010.0%0.0010%表16不同儀器型號對測試結果的影響儀器型號牛ABI7500+++BioRadCFX96+++ABI7900HTFast+++EppendorfRealplex4+++表17不同反應體積對測試結果的影響反應體積(μL）牛+++20+++21+++本項目用了三種不同的退火溫度（59、60、61℃)分別對牛、綿羊、山羊表18不同退火溫度對測試結果的影響退火溫度(℃)牛2259+++60+++61+++表19不同引物探針濃度對測試結果的影響引物探針工作液濃度(μmol/L）加樣體積(μL）牛上游引物1+++上游引物1探針0.5上游引物0.85+++上游引物0.85探針0.425上游引物0.7+++上游引物0.7探針0.35以上實驗結果證明，所建立的牛、綿羊、山分檢測，結果如表20所示，表明這些方法適23表20實際飼料樣品的檢測牛1 234 56 78924 12 25 料 料 26 用修訂前標準的方法，未檢測出綿羊成分（見表21）。表21修訂后標準和修訂前標準檢測結果比較樣品檢測項目本方法GB/T20190-2006是否一致種豬濃縮飼料+5%含量的牛肉骨粉牛源性成分++一致種豬濃縮飼料+5%含量的綿羊肉骨粉綿羊源性成分+-不一致種豬濃縮飼料+5%含量的山羊肉骨粉山羊源性成分++一致種豬濃縮飼料+1%含量的牛肉骨粉牛源性成分++一致種豬濃縮飼料+1%含量的綿羊肉骨粉綿羊源性成分+-不一致種豬濃縮飼料+1%含量的山羊肉骨粉山羊源性成分++一致2.6不同DNA提取方法對檢測結果的影響比較5%含量的牛肉骨粉、5%含量的綿羊肉骨粉、5%含量的山羊肉骨粉、1%含量的27表22不同DNA提取方法對檢測結果的影響比較序號名稱牛DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取DNA提取1種豬濃縮飼料+5%含量的牛肉骨粉2種豬濃縮飼料+5%含量的綿羊肉骨粉3種豬濃縮飼料+5%含量的山羊肉骨粉4種豬濃縮飼料+1%含量的牛肉骨粉5種豬濃縮飼料+1%含量的綿羊肉骨粉6種豬濃縮飼料+1%含量的山羊肉骨粉來西亞、美國、葡萄牙、中國在內的6個國家分兩次進行國際協同實驗，12個表23假陽性、假陰性率測試樣品牛28參加協同實驗的實驗室數量提交結果的實驗室數量每個實驗室收到的樣品數量總樣品數量含有檢測靶序列的樣品數量787872不含檢測靶序列的樣品數量787872假陽性結果的數量000假陽性率/%000假陰性結果的數量000假陰性率/%000LOD和POD驗證：通過協同實驗統計結果表明，樣品濃度在1copy表24絕對檢測限的協同實驗結果分析牛靶序列拷貝數（拷貝/PCR反應）P/TP(%)P/TP(%)P/TP(%)2078/7878/7872/7278/7878/7872/72578/7878/7872/72269/7888.573/7893.664/7288.9145/7847.750/7864.151/7270.80.527/7834.632/7841.033/7245.80.18/787/789.08/72表25檢出概率（POD）的協同實驗結果29參數牛綿羊實驗室數量每個稀釋水平的PCR重復數量666實驗室間平均POD0.770,790.82實驗室間平均POD的95%置信區(qū)間0.66-0.860.69-0.880.71-0.90相對于理想POD曲線（b=1）的斜率b實驗室間相對標準偏差σL0.300.300.30理論中位數實驗室的LOD95%（以拷貝/PCR反應表示）3.23.22024年6月，標準編制小組委托國家食品質量檢驗檢測中心（上海）、四川30表26國內外實驗室之間的樣品檢測結果比對（牛成分檢測方法）Bovine-62bp-F/Bovine-62bp-R/Bovine-62b號1-++-+-++--+-2-++-+-++--+-3-++-+-++--+-4-++-+-++--+-5-++-+-++--+-6-++-+-++--+-7-++-+-++--+-8-++-+-++--+-9-++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+-結果結果結果結果結果結果結果結果結果結果結果結果為了驗證綿羊成分檢測方法的檢測數據對比情況，通過國際協同實驗，向表27國內外實驗室之間的樣品檢測結果比對（綿羊成分檢測方法）Ovine-88bp-F/Ovine-88bp-R/Ovin號1+-+-++--+--+2+-+-++--+--+3+-+-++--+--+4+-+-++--+--+315+-+-++--+--+6+-+-++--+--+7+-+-++--+--+8+-+-++--+--+9+-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--++-+-++--+--+為了驗證山羊成分檢測方法的檢測數據對比情況，通過國際協同實驗，向），表28國內外實驗室之間的樣品檢測結果比對（山羊成分檢測方法）Goat-87bp-F/Goat-87bp-R/Goat-號1+-+-+-+-+-+-2+-+-+-+-+-+-3+-+-+-+-+-+-4+-+-+-+-+-+-5+-+-+-+-+-+-6+-+-+-+-+-+-7+-+-+-+-+-+-8+-+-+-+-+-+-9+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-+-32本項目修改采用ISO/TS20224-1:2020、ISO/TS20224-2:2020、ISO/TSfBovineDNAdetectionmethod分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實MolecularbiomarkerfOvineDNAdetectionmethod.分子生物標記分析食品和飼料中動物源性成分實Molecularbiomarkfanimal-derivedmaterialsinfoodstuffsandfeedstuffsDNAdetectionmethod.分子生物標33（2）發(fā)布后、實施前應將信息在媒體上廣為宣傳，建議全國飼料工業(yè)標準34[2]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.飼料中牛羊源性成分的定性檢測定性聚合酶鏈式反應(PCR)法:GB/T[3]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測方法實時熒光PCR法:GB/T[4]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物源性飼料中反芻動物源性成分(牛,羊,鹿)定性檢測方法PCR方法:[5]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法:SN/T[6]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物產品中牛、山羊和綿羊源性成[9]中華人民共和國農業(yè)部.轉基因動物及其產品成分檢[10]中華人民共和國工業(yè)和信息化部.肉類罐頭中牛、羊、豬、雞、鴨源性成分檢測方法PCR法:QB/T[12]中華人民共和國海關總署.出口食品及飼料中動物源成分快速檢測方法第7部分:綿羊成分檢測[16]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物源性產品中雞源性成分PCR檢測方法:SN/T2978—2011[S].北京:[17]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.動物源性飼料中馬、驢源性成分定性檢測方法PCR方法:GB/T[18]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第5部分:馬成分檢測實時熒35[19]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第4部分:驢成分檢測實時熒[21]中華人民共和國海關總署.出口食品及飼料中動物源成分快速檢測方法第12部分:火雞成分檢測[23]ISO.Molecularbiomarkeranalysis—Detectreal-timePCR—Part1BovineDNAdetectionmethod:ISO[24]ISO.Molecularbiomarkeranalysis—Detectionofanimalderivedmatreal-timeP