《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》編制說明

目錄

1項目背景.........................................................2

1.1任務(wù)來源....................................................2

1.2工作過程....................................................2

2標(biāo)準(zhǔn)制修訂的必要性分析...........................................4

2.1被測對象（糞大腸菌群）對環(huán)境的影響..........................4

2.2相關(guān)生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和生態(tài)環(huán)境管理工作的需要....................4

2.3現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實施情況和存在問題................5

3國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究...........................................6

3.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究....................6

3.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究........................................6

4標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線...................................7

4.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則........................................7

4.2標(biāo)準(zhǔn)制訂的技術(shù)路線..........................................8

5方法研究報告.....................................................8

5.1方法研究的目標(biāo)..............................................8

5.2方法原理....................................................9

5.3試劑和材料..................................................9

5.4儀器的選擇.................................................10

5.5樣品.......................................................10

5.6分析步驟...................................................11

5.7結(jié)果計算與表示.............................................12

6方法對比........................................................13

6.1方法比對方案...............................................17

6.2方法比對結(jié)果...............................................17

7方法驗證........................................................24

7.1方法驗證方案...............................................24

7.2方法驗證過程及結(jié)論.........................................25

8參考文獻(xiàn)........................................................26

附件一方法驗證報告...............................................27

1

《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》編制說明

1項目背景

1.1任務(wù)來源

根據(jù)《廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會關(guān)于下達(dá)2022年第八十一批團體標(biāo)準(zhǔn)制修訂項目計劃

的通知》（桂標(biāo)協(xié)〔2022〕199號）文件精神，由廣西環(huán)境科學(xué)學(xué)會提出，廣西

北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司、廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心、廣西壯族自治

區(qū)分析測試研究中心、廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會共同起草的團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸菌群

的測定酶底物法》（項目編號：2022-8104）已獲批立項。

1.2工作過程

1.2.1成立標(biāo)準(zhǔn)編制小組

團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》項目任務(wù)下達(dá)后，廣西北

投環(huán)保水務(wù)集團有限公司等單位成立了標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，起草單位制定了起草編

寫方案與進(jìn)度安排，明確任務(wù)職責(zé)，確定工作技術(shù)路線，開展標(biāo)準(zhǔn)研制工作。具

體標(biāo)準(zhǔn)編制工作由廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司、廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)

測中心、廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心、廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會等起草單位相關(guān)人

員負(fù)責(zé)。

為高質(zhì)量編制團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》，對標(biāo)準(zhǔn)編

制工作組進(jìn)行如下分工：

表1標(biāo)準(zhǔn)編制小組分工

主要起草人(單位)承擔(dān)的工作

項目負(fù)責(zé)人，負(fù)責(zé)項目申請立

項、整體構(gòu)思、編制思路及整

王莉莉（廣西上善若水發(fā)展有限公司）

體定位、項目技術(shù)把控及項目

的整體組織和推進(jìn)等。

用SET2020軟件對標(biāo)準(zhǔn)文檔

進(jìn)行編輯；按GB/T1.1—2020

要求對標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行修改與

王莉莉（廣西上善若水發(fā)展有限公司）

撰寫；按專家提出的意見修改

廣西標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會

標(biāo)準(zhǔn)文本；匯總和撰寫編制說

明，匯總征求意見，撰寫標(biāo)準(zhǔn)

解讀、上報函等技術(shù)資料。

2

負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的研制工作：包括研

王莉莉（廣西上善若水發(fā)展有限公司）制實驗以及方法文本、研制報

潘尚麗（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心）告、編制說明的撰寫并征集意

見等工作。

何東明、劉小萍、李世龍（廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心）

盧安根、潘尚麗（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心）

鄧文艷、蒙金燕、禤曉艷（廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站)負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的驗證工作：包括驗

王莉莉、馮金榮、秦國富（廣西上善若水發(fā)展有限公司）證實驗、驗證報告的撰寫工

馬骉、曹珊（南京水務(wù)集團有限公司排水水質(zhì)監(jiān)測中心）作。

白濤、王紹艷（昆明市城市排水監(jiān)測站）

劉曉穎、李洪、莫婉湫（東莞市東江檢測有限公司）

王莉莉、馮金榮（廣西上善若水發(fā)展有限公司）負(fù)責(zé)驗標(biāo)檢測結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)

盧安根（廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心）計、分析工作。

韋純忠（南寧市水安全工程技術(shù)研究中心）

蔣嚴(yán)波（南寧市城鄉(xiāng)供水排水工程研究中心）

吳家勇（廣西上善若水發(fā)展有限公司）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)的專業(yè)技術(shù)指導(dǎo)工

管運濤（清華大學(xué)深圳國際研究生院）作。

申佩弘（廣西大學(xué)）

李悅（深圳市水務(wù)（集團）有限公司水質(zhì)監(jiān)測站）

申學(xué)安、凌威（廣西澤霖環(huán)保水務(wù)有限公司）負(fù)責(zé)標(biāo)準(zhǔn)文本的校核工作：包

張振國、羅皓百、吳章雁、朱高俊、肖新春、冉琪、勞靜丹、林勇（廣括標(biāo)準(zhǔn)文本和編制說明的校

西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司）核工作。

鐘文輝、梁智勇、祁效鈺、文君娟、韓靜嫻、黃義群（廣西北投環(huán)保負(fù)責(zé)組織樣品采樣、運輸工

水務(wù)集團有限公司）作。

1.2.2查詢國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料

標(biāo)準(zhǔn)編制小組根據(jù)國家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)修訂工作管理辦法的相關(guān)規(guī)定，檢索、查詢

和收集國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)資料，了解掌握測定分析方法的國內(nèi)外最新技術(shù)發(fā)

展情況，對現(xiàn)有各種方法和監(jiān)測工作需求開展調(diào)查研究。

1.2.3確定標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)路線，制訂原則

2022年11月，編寫項目任務(wù)計劃，確定了本標(biāo)準(zhǔn)的具體內(nèi)容、原則、技術(shù)路

線等內(nèi)容，明確污泥中糞大腸菌群為本標(biāo)準(zhǔn)的分析對象，在眾多方法中，酶底物

法具有操作簡便、假陽性低、結(jié)果可靠、檢驗周期短等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用，成為糞

大腸菌群檢驗的最佳分析方法，因此確定檢測方法為酶底物法。

1.2.4編寫標(biāo)準(zhǔn)草稿和編制說明草稿

2022年12月，本標(biāo)準(zhǔn)編制組經(jīng)過大量文獻(xiàn)調(diào)研和基礎(chǔ)實驗，建立了酶底物法

3

測定污泥中糞大腸菌群的方法，編制完成了《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物

法》（草案）和編制說明草稿。

1.2.5方法驗證工作

2023年1月～4月，組織了3家具備檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)的實驗室進(jìn)行6組方

法驗證試驗，組織廣西區(qū)外3家具備檢驗檢測機構(gòu)資質(zhì)的實驗室進(jìn)行方法比對驗

證試驗。于2023年4月28日收回全部的驗證報告，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和

分析整理工作，并編寫完成了《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》驗證報告。

同時完善《污泥中糞大腸菌群的測定酶底物法》征求意見稿及其編制說明。

1.2.6編寫標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿和編制說明

2023年2月～4月，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組多次召開標(biāo)準(zhǔn)研制會議，對標(biāo)準(zhǔn)征求意

見稿初稿進(jìn)行了反復(fù)修改和研究討論。最終定稿形成了團體標(biāo)準(zhǔn)《污泥中糞大腸

菌群的測定酶底物法》征求意見稿及其編制說明。

2標(biāo)準(zhǔn)制修訂的必要性分析

2.1被測對象（糞大腸菌群）對環(huán)境的影響

污泥是城鎮(zhèn)污水處理廠（凈化廠）在污水凈化處理過程中產(chǎn)生的含水率不同

的半固態(tài)或固態(tài)物質(zhì)，不包括柵渣、浮渣和沉砂池砂礫。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)

展、人們環(huán)保意識的日益增強和城市污水處理率的不斷提高，污泥的安全處置問

題愈加突出。污泥中病原微生物的種類和數(shù)量繁多，當(dāng)這些含有病原微生物的污

泥施入土壤后，會對生態(tài)環(huán)境安全和人類健康構(gòu)成威脅。總大腸菌群是指一類在

37℃下24小時內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

糞大腸菌群又稱為耐熱大腸菌群，是總大腸菌群的一部分，在44.5℃下能生長并

發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，主要包括埃希氏菌屬和耐熱的克雷伯氏菌屬細(xì)菌。糞大腸菌

群在自然界中分布廣泛，是我國環(huán)境衛(wèi)生管理中最具有代表性的衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)，在

許多環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和污染物排放標(biāo)準(zhǔn)中均有標(biāo)準(zhǔn)限值的規(guī)定。糞大腸菌群主要來

源于人和動物的糞便，因此在衛(wèi)生學(xué)中可以指示糞便污染。糞大腸菌群濃度的高

低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。

2.2相關(guān)生態(tài)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和生態(tài)環(huán)境管理工作的需要

目前，我國對城鎮(zhèn)污水處理廠污泥污質(zhì)、污泥排放、污泥處置利用等已制定

4

了相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)共9項（見表2），對污泥的糞大腸菌群指標(biāo)有限

值要求，同時，依據(jù)CJJ60-2011《城鎮(zhèn)污水處理廠運行、維護及安全技術(shù)規(guī)程》

要求，城鎮(zhèn)污水處理廠污泥分析化驗項目糞大腸菌群的分析周期為每月1次；HJ

978-2018《排污許可證申請與核發(fā)技術(shù)規(guī)范水處理（試行）》對污泥控制標(biāo)準(zhǔn)

中要求：城鎮(zhèn)污水處理廠的污泥穩(wěn)定化處理后應(yīng)達(dá)到GB18918要求；污泥產(chǎn)物

農(nóng)用時應(yīng)滿足GB4284要求等。

表2相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)匯總表

糞大腸菌群菌值

序號污泥相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)

指標(biāo)要求

1GB/T24188-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥污質(zhì)》＞0.01

＞0.01

2GB18918-2002《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》

(好氧堆肥)

3GB4284-2018《農(nóng)用污泥污染物控制標(biāo)準(zhǔn)》≥0.01

4GB/T23485-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置混合填埋泥質(zhì)》＞0.01

5GB/T23486-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置園林綠化用泥質(zhì)》＞0.01

6GB/T24600-2009《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置土地改良用泥質(zhì)》＞0.01

7GB/T25031-2010《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置制磚用泥質(zhì)》＞0.01

8CJ/T362-2011《城鎮(zhèn)污水處理廠污泥處置林地用泥質(zhì)》≥0.01

糞大腸菌群數(shù)

9GB18466-2005《醫(yī)療機構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》

≤100MPN/g

2.3現(xiàn)行環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)的實施情況和存在問題

目前我國關(guān)于污泥中糞大腸菌群的測定方法有濾膜法、發(fā)酵法(多管發(fā)酵

法），有關(guān)使用酶底物法測定糞大腸菌群的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有：HJ1001-2018《水質(zhì)總

大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定

水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法，適用于地表水、地下

水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定；

DB12/T956-2020《奶牛場糞污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測

定酶底物法》，該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了基于酶底物法測定規(guī)?；膛黾S污中總大腸菌

群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的技術(shù)要求及操作方法，適用于規(guī)?；膛黾S

5

污中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的同時測定；DB61/T1138-2018

《水質(zhì)糞大腸菌群的測定酶底物法》,該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水中糞大腸菌群測定的酶

底物法的術(shù)語和定義、方法原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、樣品、分析步驟、

結(jié)果計算與表示、質(zhì)量保證和質(zhì)量控制、廢物處理的要求,適用于地表水、生活

污水和廢水中糞大腸菌群的測定。上述標(biāo)準(zhǔn)檢測適用范圍為水質(zhì)和牛場糞污，與

污泥有所區(qū)別，不適用于檢測城鎮(zhèn)污水處理廠污泥、排水管道通挖污泥、污泥衍

生產(chǎn)品中的糞大腸菌群。

3國內(nèi)外相關(guān)分析方法研究

3.1主要國家、地區(qū)及國際組織相關(guān)分析方法研究

酶底物法技術(shù)已廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外各類水質(zhì)中的總大腸菌群、糞大腸菌群、

大腸埃希氏菌、腸球菌、銅綠假單胞菌等項目的檢測，獲得全球近50個國家的

認(rèn)證、全球20多個組織發(fā)放的100多項認(rèn)證認(rèn)可，包括美國EPA認(rèn)證、ISO認(rèn)

證等。如：美國EPA40CFR136.3，美國SM9223B；國內(nèi)GB5750，HJ1001

以及農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、團體標(biāo)準(zhǔn)中都有酶底物法測定水質(zhì)中微生物項目

的標(biāo)準(zhǔn)化文件。英國環(huán)境署《TheMicrobiologyofSewageSludge（2003）》

第3部分推薦采用酶底物法檢測污水污泥中的大腸埃希氏菌。GB5750國標(biāo)在國

內(nèi)首次引入酶底物法，從2006年至今已經(jīng)17年，在國內(nèi)酶底物法的方法原理、

檢測方法的普及及實際應(yīng)用已有廣泛的基礎(chǔ)。

3.2國內(nèi)相關(guān)分析方法研究

目前關(guān)于糞大腸菌群的檢測方法有很多，主要有多管發(fā)酵法、紙片法、濾膜

法、酶底物法等。多管發(fā)酵法需要的試劑和器材比較多，分析步驟多，檢測周期

長，培養(yǎng)基保存時間短，陽性結(jié)果還需平板分離、革蘭氏染色鏡檢、復(fù)發(fā)酵試驗，

需檢測人員花費大量的時間，不能快速判斷樣品的污染狀況，不適用于應(yīng)急和樣

品量較大時檢測使用。紙片法每批次的樣品檢測均需要使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株做陽性

和陰性對照試驗，對實驗室標(biāo)準(zhǔn)菌株需求量比較大，且紙片法現(xiàn)階段可適用的環(huán)

境排放標(biāo)準(zhǔn)和評價標(biāo)準(zhǔn)相對比較少，實驗最終結(jié)果不能直接作為執(zhí)法憑證依據(jù)，

不便于從事環(huán)境監(jiān)測及執(zhí)法的實驗室分析使用。濾膜法受限于濾膜孔徑，只能適

用在較清潔水樣，對渾濁較高、污染程度較大、細(xì)菌密度比較大的水樣不適用。

6

在眾多方法中，酶底物法具有操作簡便、假陽性低、結(jié)果可靠、檢驗周期短

等優(yōu)點而廣泛應(yīng)用，成為糞大腸菌群檢驗的最佳分析方法。范秀英等在《酶底物

法與多管發(fā)酵法測定水中糞大腸菌群的對比研究》中的研究表明，酶底物法和多

管發(fā)酵法在準(zhǔn)確性方面無太大差異，而酶底物法檢測的靈敏度要高于多管發(fā)酵

法。酶底物法采用購買成品培養(yǎng)基及定量盤等耗材，操作流程簡便，減少了部分

實驗過程中可能受污染的環(huán)節(jié)，最快18h即可判斷水樣中糞大腸菌群的MPN值，酶

底物法較好地彌補了傳統(tǒng)方法的不足，證明酶底物法是檢測糞大腸菌群的優(yōu)選方

法。

4標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則和技術(shù)路線

4.1標(biāo)準(zhǔn)制修訂的基本原則

4.1.1實用性原則

本文件是在充分收集相關(guān)資料和文獻(xiàn)，分析和調(diào)研酶底物法測定水質(zhì)及環(huán)境

樣品中糞大腸菌群的應(yīng)用現(xiàn)狀，在現(xiàn)有國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中相關(guān)酶底物法測定各類

型樣品中的糞大腸菌群的基礎(chǔ)上，結(jié)合起草單位的方法經(jīng)驗，總結(jié)起草而成。符

合當(dāng)前酶底物法測定污泥中糞大腸菌群發(fā)展需求，有利于解決污泥檢測難點且提

高時效性，有力提升檢測質(zhì)量，具有較強的實用性和可操作性。

4.1.2協(xié)調(diào)性原則

本文件編寫過程中注意了與糞大腸菌群測定的相關(guān)法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)文件的協(xié)

調(diào)問題，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。

4.1.3規(guī)范性原則

本文件嚴(yán)格按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件

的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容，保證標(biāo)準(zhǔn)的編寫質(zhì)量。

4.1.4前瞻性原則

本文件在兼顧國內(nèi)各級檢測機構(gòu)、污水處理廠化驗室測定污泥中糞大腸菌群

現(xiàn)實情況的同時，還考慮了采用酶底物法測定污泥中糞大腸菌群的實際需要和發(fā)

展趨勢，在標(biāo)準(zhǔn)中體現(xiàn)了個別特色性、前瞻性和先進(jìn)性條款，作為對糞大腸菌群

測定的更好指導(dǎo)。

7

4.2標(biāo)準(zhǔn)制訂的技術(shù)路線

目前，國內(nèi)尚未制定有使用酶底物法測定污泥中糞大腸菌群的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，本

標(biāo)準(zhǔn)的制定結(jié)合本國實際情況，引用、參考國內(nèi)外現(xiàn)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)實驗研究

完成了本標(biāo)準(zhǔn)方法的制定。酶底物法測定污泥中糞大腸菌群標(biāo)準(zhǔn)制定的技術(shù)路

線，見圖1。

圖1標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)路線圖

5方法研究報告

5.1方法研究的目標(biāo)

建立適用于污泥中糞大腸菌群測定糞大腸菌群的酶底物法。通過方法研究和

8

方法驗證，確定酶底物法測定糞大腸菌群的可行性和適用性，建立簡便、快速、

準(zhǔn)確的檢測方法，并將方法標(biāo)準(zhǔn)化以期應(yīng)用。本標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果以樣本中是否檢

出糞大腸菌群表示。

5.2方法原理

在44.5℃培養(yǎng)24h條件下，糞大腸菌群能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將選擇性培

養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為黃色的鄰硝基苯

酚（ONP）。統(tǒng)計陽性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，査MPN表，計算樣品中糞大腸菌群的濃度值。

5.3試劑和材料

除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實驗用水應(yīng)滿足

GB/T6682中三級水的要求。

（1）培養(yǎng)基：本標(biāo)準(zhǔn)釆用MinimalMediumONPG-MUG培養(yǎng)基。每100mL樣品

需使用培養(yǎng)基粉末2.7g±0.5g,所含基本成分見表3。也可釆用市售商品化培養(yǎng)

基制品。

表3培養(yǎng)基基本成分及含量

基本成分含量

硫酸銨[(NH4)2SO4]0.5g

硫酸錳（MnSO4）0.05mg

硫酸鋅（ZnSO4）0.05mg

硫酸鎂（MgSO4）10mg

氯化鈉（NaCl）1g

氯化鈣（CaC12）5mg

亞硫酸鈉（Na2SO3）4mg

兩性霉素B（AmphotericinB）0.1mg

鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖昔（ONPG）50mg

4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）7.5mg

茄屬植物萃取物（Solaniutn萃取物）50mg

N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸鈉鹽（HEPES鈉鹽）0.53g

N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）0.69g

（2）硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H20）。

（3）硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3）=0.05g/mL。稱取7.85g硫代硫酸鈉，

溶于適量水中，定容至100mL，臨用現(xiàn)配。

（4）97孔定量盤：含49個大孔，48個小孔。其中，每個小孔可容納0.186mL

9

樣品，大孔中48個大孔每個可容納1.86mL樣品，一個頂部大孔可容納11mL樣品。

也可采用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。

（5）標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤。

（6）無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

5.4儀器的選擇

（1）采樣瓶：經(jīng)過滅菌處理的耐高壓塑料瓶。可釆用市售無菌釆樣瓶、無

菌采樣袋/均質(zhì)袋

（2）樣品瓶：具螺旋帽的100mL、250mL玻璃瓶?？刹捎檬惺蹮o菌采樣瓶。

（3）高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。

（4）恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差44.5℃±0.5℃。

（5）程控定量封口機：用于97孔定量盤的封口。

（6）天平：感量0.01g。

（7）渦旋振蕩器。

（8）移液管：1mL±0.1mL、10mL±0.1mL。也可采用計量合格的可調(diào)式移

液。

（9）三角瓶：100mL、250mL、500mL。

（10）量筒：100mL±1mL。

（11）一般實驗室常用儀器和設(shè)備。

其中，三角瓶、移液管、樣品瓶等玻璃器皿在試驗前按無菌操作要求包扎，

按需選擇121℃高壓蒸汽滅菌20min，烘干，或160℃干熱滅菌2h，備用。

5.5樣品

5.5.1采樣器皿的洗滌

對所有與樣品直接接觸的器皿，均應(yīng)采取措施保證其潔凈度，避免造成污染

或干擾。

5.5.2采樣步驟

污泥的表層、中層、下層斷面各采集三點，充分混合后取約500g泥樣裝入

無菌樣品瓶中。

5.5.3樣品的保存

采得的泥樣應(yīng)立即送檢，時間不超過2h，如不能立即送檢，應(yīng)置于保溫箱

10

或冰箱（0℃～4℃）中避光低溫保存，時間不超過24h，否則將影響檢驗結(jié)

果。主要參照《CJ/T221-2005城市污水處理廠污泥檢驗方法》中13.6的要求

擬定。

5.6分析步驟

5.6.1樣品制備

將樣品置于無菌器皿內(nèi)，用無菌鑷子揀出樣品中的雜質(zhì)異物，充分混勻稱取

10.0g樣品，放入無菌樣品瓶內(nèi)，加入90mL無菌水，混搖或渦旋振蕩2min～4

min，混勻，制成1：10混懸液。其中，干污泥可用少量無菌水浸泡軟化，再稀

釋混均。無渦旋振蕩器時，可使用均質(zhì)機慢速均質(zhì)樣品2min或者軌道式搖床以

200±10rpm的速度對樣品進(jìn)行均質(zhì)1h。

然后根據(jù)樣品污染程度決定稀釋度，避免樣品接種結(jié)果均呈陽性或陰性。用

無菌吸管吸取1:10樣品混懸液10mL加到含有90mL無菌水的無菌樣品瓶中混勻

制成1:100稀釋樣品。按同法依次稀釋，可制成1:1000、1∶10000等梯度稀釋

樣品。對于未知樣品，可選用多個接種量進(jìn)行檢測。其中稀釋待測樣品pH值應(yīng)

在4.5～10.5范圍內(nèi)，如超出此范圍，可用鹽酸或氫氧化鈉溶液預(yù)先調(diào)節(jié)pH值

再進(jìn)行測定。經(jīng)過石灰處理的樣品在稀釋均質(zhì)后，應(yīng)調(diào)整pH值至7.0±0.2。值

得注意的是，本方法不適用于稀釋待測樣品顏色類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤的樣

品。在野外操作時應(yīng)避開明顯局部污染源，建議使用一次性手套、口罩、酒精燈

等。

5.6.2接種

量取100mL稀釋樣品于滅菌瓶，加入2.7g±0.5g培養(yǎng)基粉末，充分混勻，

完全溶解后，全部倒入97孔定量盤內(nèi)，以手撫平97孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣

泡，然后用程控定量封口機封口，確保每個孔格內(nèi)都有液體。觀察97孔定量盤

顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤的顏色或者其他異色，則需排查樣品、

培養(yǎng)基、無菌水等一系列因素后，終止試驗或重新操作。

5.6.3培養(yǎng)

將封口后的97孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱中44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24h。

11

5.6.4空白對照

每次試驗都要用無菌水按照步驟5.6.1～5.6.3進(jìn)行實驗室空白測定。培養(yǎng)

后的97孔定量盤不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)査明

原因后重新測定。

5.6.5陰性和陽性對照

糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表4。

表4陰性、陽性菌株參考表

檢測指標(biāo)陽性菌種陰性菌種

大腸埃希氏菌（耐熱型）、糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)、

糞大腸菌群

克雷伯氏菌屬（Klebsiellatrevisan）（耐熱型）假單胞菌屬

將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300個/mL～3000個/mL的菌懸液，將菌懸液按接種和培養(yǎng)

要求操作，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng)；陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品

測定結(jié)果無效，應(yīng)重新測定。為了試驗的順利進(jìn)行，可先制備較高濃度菌懸液，

釆用血球計數(shù)器在顯微鏡下對其濃度進(jìn)行初步測定，然后根據(jù)實際情況用無菌水

稀釋至300個/mL～3000個/mL。

5.6.6結(jié)果判讀與計數(shù)

將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤進(jìn)行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為糞大腸菌群

陽性。如果結(jié)果可疑，可延長培養(yǎng)至28h進(jìn)行結(jié)果判讀，超過28h后出現(xiàn)的顏

色反應(yīng)不作為陽性結(jié)果?？墒褂帽Ｙ|(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤以輔助判讀，當(dāng)樣品

孔格的黃色與其顏色相同或更深，判讀結(jié)果為陽性。然后分別記錄97孔定量盤

中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。

5.7結(jié)果計算與表示

5.7.1結(jié)果計算

（1）計算原始（濕）污泥的糞大腸菌群濃度

從97孔定量盤法MPN表中査得每100mL稀釋樣品中糞大腸菌群的MPN值后，再

根據(jù)樣品不同的稀釋度，按照公式（1）換算樣品中糞大腸菌群濃度（MPN/g）：

......................（1）

式中：

12

——原始（濕）污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g；

MPN值——每100mL稀釋樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/100mL；

——每100mL稀釋樣品代表的樣品實際接種量，單位為g/100mL。

（2）計算干污泥（扣除含水率）的糞大腸菌群濃度

按照式（2）計算干污泥（扣除含水率）的糞大腸菌群濃度：

..........................（2）

式中：

——干污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g；

——原始（濕）污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g；

——原始（濕）污泥樣品的含水率，單位為％。

5.7.2結(jié)果表示

測定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測定結(jié)果≥100MPN/g時，以科學(xué)計數(shù)法表

示；若97孔均為陰性，可報告為糞大腸菌群數(shù)未檢出或＜10MPN/g。

5.7.3結(jié)果換算

按照公式（3）將糞大腸菌群濃度換算成糞大腸菌群菌值：

...........................（3）

式中：

V——樣品的糞大腸菌群菌值；

——原始（濕）污泥樣品中糞大腸菌群濃度，單位為MPN/g。

6方法對比

目前常用的污泥中糞大腸菌群的檢測方法有發(fā)酵法（圖2）、濾膜法（圖3），

但這些方法均存在操作繁瑣、檢測時間長、分析效率低的問題，對檢測人員技術(shù)

經(jīng)驗要求高，因此研究制定一種更為快速、準(zhǔn)確的污泥中糞大腸菌群測定方法十

分必要。

13

圖2發(fā)酵法檢測污泥中糞大腸菌群的程序步驟

（GB7959-2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》附錄D）

圖3濾膜法檢測污泥中糞大腸菌群的程序步驟

（CJ/T221-2005《城市污水處理廠污泥檢驗方法》）

14

在參照《水質(zhì)總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》

（HJ1001-2018）、英國環(huán)境署《TheMicrobiologyofSewageSludge（2003）》

第3部分中酶底物法檢測污水污泥中的大腸埃希氏菌方法的基礎(chǔ)上，研究開發(fā)制

定污泥中糞大腸菌群的測定——酶底物法。酶底物法具有操作簡便，假陽性假陰

性低，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，檢驗周期短等優(yōu)點而成為糞大腸菌群檢驗的推薦分析方法，

而且文獻(xiàn)報道，酶底物法測定水中糞大腸菌群與多管發(fā)酵法、濾膜法無顯著性差

異。通過酶底物法和發(fā)酵法（多管發(fā)酵法）測定污泥樣品進(jìn)行方法比對、準(zhǔn)確度

和精密度試驗，判斷測定結(jié)果是否符合驗收要求，確認(rèn)檢測方法的可行性。

酶底物法檢測污泥中糞大腸菌群，方法步驟只有6步（如圖4），分別為：污

泥樣品稀釋、定量添加反應(yīng)試劑、混勻倒入定量盤、封口機封口、放入培養(yǎng)箱培

養(yǎng)、統(tǒng)計陽性數(shù)報告結(jié)果。所需儀器主要為封口機、培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器等，所

需試劑耗材主要有酶底物試劑、定量盤、采樣瓶、吸管等。酶底物法所需的儀器

設(shè)備、試劑耗材種類數(shù)量少、常規(guī)，市場上均可采購，容易獲得，檢測操作步驟

簡單。

圖4酶底物法檢測污泥中糞大腸菌群步驟

參考相關(guān)文獻(xiàn)資料，采用酶底物法對污泥中糞大腸菌群進(jìn)行測定，已開展少

量試驗確認(rèn)這種方法的有效性，計劃通過本項目進(jìn)一步完成方法研究，證明酶反

應(yīng)原理更能有效避免檢測結(jié)果的假陰性假陽性，避免傳統(tǒng)方法的缺陷和不足，為

污泥中糞大腸菌群快速測定提供技術(shù)指導(dǎo)。表5是三種檢測方法在污泥檢測中的

應(yīng)用比較。

15

表5檢測方法對比表

方法名稱多管發(fā)酵法濾膜法酶底物法

適用范圍全部樣品稀釋后低濁樣品全部樣品

培養(yǎng)基3種2種1種

其他試劑1種1種無

檢驗時限24h～72h24h～48h24h～28h

確認(rèn)試驗需要需要不需要

檢驗步驟較繁瑣較簡單簡單

特殊設(shè)備顯微鏡顯微鏡、抽濾裝置封口機

對環(huán)境污染無無無

對人體傷害無無無

耗材價格低低較高

本項目涉及酶底物方法的培養(yǎng)基、定量儀器與方法的專利已超過保護期，不

存在專利技術(shù)等知識產(chǎn)權(quán)的問題。其次，國內(nèi)已經(jīng)有多家企業(yè)開發(fā)、生產(chǎn)和銷售

酶底物試劑及儀器設(shè)備，預(yù)計未來隨國產(chǎn)耗材的大量推廣普及，以及以酶底物反

應(yīng)原理為基礎(chǔ)的檢測方法應(yīng)用范圍的擴大延伸，酶底物方法的耗材成本將大幅降

低。

本項目采用酶底物法測定污泥中的糞大腸菌群指標(biāo)，與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法濾膜

法、發(fā)酵法相比，具有簡單、快速、準(zhǔn)確、高效的特征，無需預(yù)先配置培養(yǎng)基，

樣品經(jīng)過稀釋后的手工操作時間僅需1分鐘，操作方法十分簡單。僅需24小時即

可檢測污泥中糞大腸菌群結(jié)果，相比傳統(tǒng)方法，可有效縮短檢測時間，提高分析

效率，結(jié)果判讀準(zhǔn)確，可減少人工判讀誤差和人工操作時間，節(jié)省人力成本。檢

測方法和技術(shù)在國內(nèi)外屬于領(lǐng)先技術(shù)水平。

同時，編制組組織6家實驗室分別做了方法對比試驗，見表6。

表6方法驗證及方法研制單位匯總表

單位名稱單位類別

廣西壯族自治區(qū)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心

廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心

方法驗證單位

廣西城市供水水質(zhì)監(jiān)測網(wǎng)防城港監(jiān)測站

國家城市排水監(jiān)測網(wǎng)南京監(jiān)測站/南京水務(wù)集團有限公司排水水質(zhì)

監(jiān)測中心

16

昆明市城市排水監(jiān)測站

東莞市東江檢測有限公司

廣西北投環(huán)保水務(wù)集團有限公司

方法研制單位

廣西上善若水發(fā)展有限公司

6.1方法比對方案

（1）與多管發(fā)酵法進(jìn)行比對。由于GB7959-2012《糞便無害化衛(wèi)生要求》

附錄D堆肥、糞稀中糞大腸菌群檢測法采用多管發(fā)酵法4管法，查表值跨度大，

為了更好的進(jìn)行方法比對，選擇GB18466-2005《醫(yī)療機構(gòu)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》

附錄A醫(yī)療機構(gòu)污水和污泥中糞大腸菌群的檢驗方法,采用多管發(fā)酵法9管法進(jìn)

行方法比對。

（2）每個單位至少采集30份實際樣品（高、中、低濃度）開展方法比對，

樣品主要涉及城鎮(zhèn)污水處理廠污泥、處置后污泥兩個類型。樣品要求一定的陽性

檢出率，若實際樣品未檢出目標(biāo)物的，可通過實際樣品基體加標(biāo)的方式獲得樣品。

（3）陰性樣品的比對。廣西區(qū)內(nèi)三家驗證單位分別用無菌污泥（經(jīng)高壓滅

菌的污泥樣品）進(jìn)行方法比對10組。

（4）通過對比實驗,將實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與處理（換算成以10為底的對數(shù)），

對多管發(fā)酵法與酶底物法的結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗，分析驗證兩種方法在統(tǒng)計學(xué)意

義上的顯著性差異，評價兩種方法等效性、一致性；進(jìn)行線性回歸分析，證明兩

種方法具有可比性。

6.2方法比對結(jié)果

6.2.1實際樣品的測定

6家實驗室分別采集廣西南寧市、防城港市、東興市以及南京市、昆明市、

東莞市的污泥樣品共計201份，污泥樣品來源于當(dāng)?shù)爻擎?zhèn)污水處理廠及市政排水

管，樣品類型包括：脫水污泥、深度脫水污泥、板框污泥及排水管污泥。分別用

多管發(fā)酵法和酶底物法進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表7。

17

表7多管發(fā)酵法和酶底物法檢測實際樣品中糞大腸菌群的結(jié)果

多管發(fā)酵法酶底物法多管發(fā)酵法酶底物法

序號序號

（MPN/g）（MPN/g）（MPN/g）（MPN/g）

11500007701001011500011000

246000046110010220003600

324000075560010334005900

44600009804001044300026000

524000011199001051400011000

646000027550010693008600

7110000057940010746002500

8240000857001082900019000

91200009340010975009100

10150000771001109.3<10

119378.01114200061000

1293110.61126.2<10

1343135.41131200011000

1493124.61142900029000

157595.9115930012000

162363.11162400013000

174367.01173500024000

182173.31182000016000

194390.6119910019000

202879.812043006600

21750958121<3<10

22120010591222100013000

2315009851233.6<10

249309341242300015000

2512001063125930017000

26750886126460000350000

2716001010127210000220000

2893010081281100000690000

291200101012993000290000

309501166130460000570000

31240001299701319300098000

322400002419601322300042000

3343941331100000460000

34235213493000460000

35110000394501352400020000

3646000721501362300012000

37240000272300137910018000

18

多管發(fā)酵法酶底物法多管發(fā)酵法酶底物法

序號序號

（MPN/g）（MPN/g）（MPN/g）（MPN/g）

3824000095700138460000170000

392400004569001392400001100000

402400001299700140150000380000

41460000770100141240000160000

42240000488400142240000200000

432400001299701432300074000

44110000041600014464000280000

45110000155310145910027000

4646000011199014624000160000

4723311479141

48110000920800148240000100000

491100000111990014993006900

5046000014136001502300034000

5124000012033001511500010000

524394152240000290000

532400008664001532300019000

5411000001011201542300022000

55240000616701552400022000

5646000033000015615000001200000

57110000533501573610

5811000006867001582300032000

5923821594300036000

6064301601100000140000

61430065701614300036000

6246000141361622400020000

6346000913901632400018000

6424000387301641100000720000

6524000027550016516000110000

662400034360166460000730000

6793121167110000220000

68110000277801684600058000

69110000019863001699398

709300158601704341

71110000011199001714375

721100001413601722320

732400007701017324009804

7424000040340174460012033

75240000387301751100017329

7611000001986301761100019863

19

多管發(fā)酵法酶底物法多管發(fā)酵法酶底物法

序號序號

（MPN/g）（MPN/g）（MPN/g）（MPN/g）

77240000378401771100024196

78460000241960178460959

794384179460005794

8046000019863018046005475

814600008664018146002909

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