活細胞分析在免疫學中的十大應用

SR正OZIUS免疫細胞體外分析的主要方法包括流式細胞術、PCR以及各種形式的ELISA（如ELISPOT）。這些技術加在一起，可以從分子水平上對不同的細胞群的功能進行檢測，并對免疫反應進行量化，例如，細胞因子的釋放。雖然這些平臺非常強大，但近年來，實時活細胞分析已成為免疫學研究重要的研究方法，突破了傳統(tǒng)方法的諸多限制。在這里，我們總結(jié)了10個活細2活細胞分析是利用延時成像（數(shù)小時至數(shù)周）對活細胞的2.在整個實驗過程中將細胞維持在不受干擾的穩(wěn)定的生理CultureManipulateAssayEndpointflowcytometry)ContinuousCellhealth,morphologyandplateuniformity(e.g.,proliferation,maturatiCultureManipulateAssayEndpointflowcytometry)ContinuousCellhealth,morphologyandplateuniformity(e.g.,proliferation,maturatiSingletimepoint賽多利斯推出專業(yè)的活細胞分析系統(tǒng)Incucyte?,可以自動收集、分析和展示2000多個平行實驗（如6x384孔微孔不是細胞板），這樣就可以在不干擾細胞的情況下捕捉非貼壁細胞的高質(zhì)量圖像。另外，搭配優(yōu)化的活細胞試劑、SingletimepointMonitorefectoftreatment(e.g.,diferentiation,drugtreatment)3作用。該方法適用于所有類型的免疫細胞，包括T細胞、免疫細胞可以通過一些不同的方式進行非侵入式的活細胞可以作為細胞數(shù)量的代表性方法（圖2）。至少達到80%的匯合度，這個數(shù)據(jù)指標與細胞直接計數(shù)法和ATP熒光檢測的結(jié)果高度一致，證明了此數(shù)據(jù)的可靠性。但是，對于密集的培養(yǎng)物，或者考察單個細胞區(qū)域隨時間的變化，這種相關性會減弱。此外，也可以使用熒光標簽，如核靶向熒光蛋白（如Incucyte?NuclightLentivirus）或非干擾染料（如Incucyte?CytolightRapidDye）。細胞核計數(shù)能夠?qū)毎麛?shù)量進行精準測量，即使細胞被擠在一起，熒光標在最近的發(fā)展中，可以使用新的圖像分割工具（Incucyte?和形狀（偏心度）等指標在單個細胞水平上對視野中的所有細胞進行計算，并使用類似于流式細胞儀中使用的“散并對細胞群中單個細胞的參數(shù)更深入地了解。無論采用哪種方法，都能產(chǎn)生完整的時間過程數(shù)據(jù)、洞察有價值的細熒光標記的CD抗體（Abs）被廣泛用于流式細胞儀，用于細胞識別和免疫分型。基于這些特征，至少有15種人類T細胞亞型被描述出來（例如，CD4+，CD8+，等等）?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了使用相同原理的活細胞分析方法。與其使用直接標記的Abs，不如將抗CD的Abs結(jié)合到同型匹配的帶有熒光標簽的Fc區(qū)域靶向Fab片段（如Incucyte?），Confluence,24h1005025040K20K0244872965040K20K0244872964在檢測中使用一種非干擾性的背景熒光抑制染料，以幫助改善488nM的熒光信號。然后將Fabfluor-488標和抑制劑直接加入到細胞中，只有表達表面標志物的細胞才會發(fā)出熒光。然后，細胞亞群可以很容易地被識別并隨CD4+、CD8+）的百分比，并將形態(tài)學屬性與不同的亞群聯(lián)系起來，并且測量細胞占比隨時間的變化。更有用的是能夠觀察培養(yǎng)物中細胞亞群之間的相互作用--例如，在基于PBMC的免疫細胞殺傷實驗中，CD8+細胞毒性T細胞免疫細胞的分化和激活是免疫力和免疫應答的關鍵步驟。細胞通過受體信號傳導進行擴增并產(chǎn)生功能效應，最終導致基因表達、分化和表型變化。活細胞分析很適合研究其復雜性和動態(tài)性。在一個簡單的案例中，我們評估了化合劑誘導的人類中性粒細胞的激活（圖3）。圖像分割工具用Fabfluor-488/Ab復合物進行定量）的時間和濃度依賴性的變化。這些變化的時間過程相似（0-6小時），偏心度在進一步分析中，我們檢測了刺激誘導人THP-1單核細胞向巨噬細胞的分化。對照組（未處理）和受刺激的THP-1細胞中，隨處可見的細胞表面標記物CD45在三天的監(jiān)測過程中沒有任何的變化。CD45可被認為是一個穩(wěn)定的"管家"蛋白。在控制條件下，THP-1細胞在長達72小時內(nèi)幾0.60.50.4Vehicle0.60.50.4log[CXCL8](M)0.80.60.40.04nMvehicle,02460.80.60.4log[CXCL8](M)圖3:中性粒細胞激活的量化。將新鮮分離的人中性粒細胞以40,000/孔接種在涂有Matrigel?（50μg/mL）的96孔板中，并在Fabfluor-488標記的5分化劑，如維生素D3、IFNγ+m4）。維生素D3沒有上調(diào)CD40。仔細觀察細胞圖像，只有PMA使細胞形態(tài)產(chǎn)生了明顯的變化，產(chǎn)生了大的、扁平的、粘附的"巨噬細胞"樣細胞。只有那些用PMA處理的這些數(shù)據(jù)共同說明了如何使用Incucyte?一種檢測工具來同時檢測表面蛋白標志物、細胞形態(tài)和功能隨時間的變化，上述應用也可以通過使用專為活細胞分析而優(yōu)化的熒光染料，與細胞凋亡或細胞健康讀數(shù)進行關聯(lián)。例如，細胞凋亡可以通過磷脂酰絲氨酸外翻（Incucyte?AnnexinV胞非通透性的DNA結(jié)合熒光探針（如Incucyte?CytotoxRedDye）可用于檢測細胞膜的完整性。活細胞分析的實時讀數(shù)提供了對細胞凋亡、細胞死亡的時間過程以及它們與細胞增殖的關系的洞察（Artymovich和Appledorn，UndiferentiatedVitaminD3(50nM)ProliferationVitD3Undiff.VitD350250244872log[CXCL8](M)80604020080CD4060402000244872806040200024487200244872VitD3Undiff.log[CXCL8](M)CD14或CD40復合的情況下暴露于培養(yǎng)基（未分化明顯變化（高清相差圖像）。動力圖突出了各種處理條件下不同的、隨時間變化的表面蛋白表達。了細胞增殖（匯合）的減少和吞噬潛力的增加，這是通過用pHrodo?紅細胞標記試劑盒標記的凋亡Jurkat6可能不同（例如，釋放細胞因子、細胞毒性顆?；騌OS、Fas/FasL相互作用），但最終這些免疫防御者通過細胞裂監(jiān)測其紅色熒光的損失。例如，THP-1細胞被核靶向RFP穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后轉(zhuǎn)移至96孔板上。加入預激活的PBMCs（抗），的裂解，最終完全失去RFP信號。細胞溶解的速度取決于查細胞圖像得到驗證，顯示膜破壞、運動能力喪失和目標細胞的收縮。類似的檢測原理可以應用于腫瘤球的殺傷。在圖5中，Incucyte?NuclightRedA549腫瘤細胞在加入PBMCs之前，在超低吸附板（ULA）中形成并生長3天形成3D球細胞模型。隨著時間的推移，PBMCs裂解了球狀這種形式可以擴展到在第二熒光通道中直接測量目標細胞的凋亡（McCormack,etal.,2013）。只要效應細胞比目標細胞小，任何來自PBMCs的凋亡信號都可以通過熒光對象的尺寸門控來排除。為了說明這一點，CD8+細胞毒性T細胞與Incucyte?NuclightRedA549細胞在Incucyte?Caspase3/7染料（5mM）存在下共同培養(yǎng)在96孔板上。在此應用案例中，T細胞殺傷開始大約需要48小時，同時），這些方法對于表征檢查點抑制劑、CAR-T細胞、雙特異性++Anti-CD3/IL-2(10ngmL)A549+PBMCs30200A549Alone+AntiCD3/IL-2TimeAfterPBMCAddition(h)HD相位和熒光圖像比較了在沒有（非激活，上7微生物（如微生物病原體）和外來的、垂死的細胞被滅活并從體內(nèi)清除。免疫系統(tǒng)的專業(yè)吞噬細胞包括巨噬細胞、中性粒細胞、Kuppfer細胞、小膠質(zhì)細胞和未成熟的樹突狀通過檢測其熒光標簽來進行。其中非常重要的是要區(qū)分吞噬作用和非特異性的細胞吸收或表面結(jié)合的非內(nèi)化標簽。Incucyte?已經(jīng)開發(fā)了使用pH值敏感染料（如pHrodo?)標記活細胞分析方法，該標簽與細菌壁蛋白或目標細胞連在第一個例子中，通過加入pHrodo?綠色標記的大腸桿菌細胞內(nèi)的熒光隨著時間的推移（24小時）而增加，因為生物顆粒被內(nèi)化了（圖6）。在對照實驗中，如果沒有?；蚴褂梅峭淌杉毎ㄈ鏏549），則觀察不到熒光（數(shù)據(jù)未顯示）。細胞吞噬作用的抑制劑，包括細胞松弛素D和為了說明哺乳動物細胞的吞噬作用（"胞葬作用"），我們描述了抗CD47抗體介導的小鼠骨髓巨噬細胞對CD47+CCRF-CEMT淋巴細胞的吞噬。CD47是一種跨膜是一種有希望的免疫治療新方法?？笴D47抗體（0.04-5），0’30’240’10-3ou10-3oug/wel3pg/welloug/wel2.00.50.00.80.40.00.04ugmL20o o o0.2ugmL0.04ugmL0031030Bioparticle(ug/well)TreatmentGroup值得注意的是，吞噬作用取決于生物顆粒的數(shù)量（B）。使用Incucyte?的pHrodo?紅細胞標記抗CD47的情況下，目標細胞被骨髓來源的巨噬細胞吞噬，增加了熒光信號并產(chǎn)生了濃度依賴8這兩種情況下，信號窗口都很大，而且吞噬可以通過可視化來驗證。這種功能驗證分析可用于篩選新的CD47調(diào)節(jié)御感染的機制之一。當中性粒細胞遇到入侵的病原體時，它們會釋放出一種抗菌蛋白和染色質(zhì)的混合物來捕獲和降解微生物?；罴毎治隹梢酝ㄟ^使用熒光DNA結(jié)合試劑實當使用NETosis誘導刺激物（如PMA、IO理中性粒細胞時，熒光強度迅速上升，細胞邊界會顯示降解的DNA云或光暈（圖7）?？梢杂^察到細胞核的退化和外翻，以及活性氧（ROS）檢測進行關聯(lián)，可以闡明個重要組成部分。中性粒細胞、單核細胞、T細胞和小膠質(zhì)細胞都會以這種方式被吸引到病原體和炎癥刺），檢測趨化作用。新型的transwell在每個孔中都有精確的激光鉆孔供細胞移動通過。與傳統(tǒng)的Boydenchamber實驗不同的是，當細胞向化學試劑移動時，可以對其進行可視化和量化。與早期的應用一樣，這種方法能夠更深入地洞與-Boydenchamber實驗相比，所需的細胞數(shù)量要少得多0d0h0m0d0h32m0d1h2m0d2h2m550.50.03343220002460.013YM0.04YM0.37UM3.33UMnM圖7：NETosis的量化。在Incucyte?Cytotox綠色染料（250nM）和CellROX?DeepRed（5μM，ThermoScienti?處理新鮮分離的人中性粒細胞。相位和熒光圖像顯示（A）活性氧（ROS，紅色，0-2小時）的瞬時產(chǎn)生，細胞核的解聚（30-60分鐘）和細胞外DNA9在體外測量病毒在哺乳動物細胞中的感染性和復制能力對免疫細胞佐劑至關重要。與傳統(tǒng)的蝕斑實驗和病灶形成實驗相比，活細胞分析可以通過計算被熒光蛋白（如GFP）標記的病毒的細胞數(shù)量和程度來自動量化病毒的傳播和復這種方法已在一系列病毒研究中被使用并發(fā)表，包括），也可以檢測細胞的凋亡或壞死程度。Incucyte?活細胞分析工作流程的一個有趣的優(yōu)點是，當添加病毒或病毒復制體到細胞后，培養(yǎng)板不需要離開培養(yǎng)箱。因此，即使是高度傳染性的病毒也可以在適當?shù)纳锔綦x設施中安全地進行單克隆抗體（mAb）和抗體偶聯(lián)藥物（ADCs）被廣泛用于這些生物制劑的一個關鍵特性是內(nèi)化到不同細胞中的程度活細胞分析可以在96孔板中檢測Ab內(nèi)化。使用對pH值敏感的熒光染料檢測Ab進入酸性溶菌酶的內(nèi)化，其思路與?Fabfluor-pH染料）實現(xiàn)的，只需一步，無需洗滌，提供高效、高通量的樣品制備。為了證明這一點，用