(高清版)GB∕T 39100-2020 多肽抗氧化性測定 DPPH和ABTS法

ICS07.080A40中華人民共和國國家標準DPPHABTDPPHABT2020-09-29發(fā)布2021-04-01實施國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會ⅠGB／T39100—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由全國生化檢測標準化技術(shù)委員會(SAC/TC387)提出并歸口。本標準起草單位：河北科技大學、河北農(nóng)業(yè)大學、北京工商大學、華測檢測認證集團股份有限公司、北京薩姆伯科技有限公司、武漢明了生物科技有限公司、浙江東杰生物科技有限責任公司、市場監(jiān)督管理總局食品審評中心、中國檢驗檢疫科學研究院。本標準主要起草人：王志新、田益玲、賈英民、馬愛進、郝帥、彭海、劉文秋、楊志堅、鄭剛、姜雨、GB／T39100—2020多肽抗氧化性測定DPPH和ABTS法本標準規(guī)定了DPPH和ABTS法測定多肽抗氧化性能的方法。本標準適用于多肽體外抗氧化性能的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1多肽介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，由2個或2個以上氨基酸通過肽鍵連接形成的一類化合物。3.2抗氧化能力清除自由基的能力，以待測多肽半數(shù)清除量與谷胱甘肽半數(shù)清除量的比值(AO值）來表示。4縮略語下列縮略語適用于本文件。乙基-苯并噻唑sulfonicacid)diammoniumsalt]抗氧化能力(二苯基二甲基亞砜(半數(shù)清除量(5試劑或材料除非另有說明，本方法所用的試劑均為分析純，試驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。L-還原型，純度12GB／T39100—2020分析純。5.3二甲基亞砜分析純。5.4DPPH溶液適量無水乙醇溶解，避光超聲使其充分溶解，再用無水乙醇定容至100.0mL,配制成溶液。該溶液應現(xiàn)配現(xiàn)用。5.5ABTS溶液稱取過硫酸鉀溶于蒸餾水搖勻室溫避光放置后作為母液取適量母液用乙醇稀釋至吸光度值在),作為測定溶液，該溶液應現(xiàn)配現(xiàn)用。注：可以根據(jù)分光光度計的靈敏度配制合適濃度的ABTS測定溶液。6儀器設(shè)備吸光度值精確至0.001。電子天平感量為7DPPH·自由基清除法DPPH是一種暗紫色棱柱狀結(jié)晶，在無水乙醇溶液中呈深紫色，DPPH·自由基在可見光區(qū)517nm處具有較強吸收峰。該方法通過DPPH提供的1個穩(wěn)定的DPPH·自由基與抗氧化性多肽提供的1個電子配對結(jié)合，使DPPH·自由基的特征性紫色消失，變?yōu)闊o色或淺黃色，采用紫外可見分光光度計測定反應后的吸光度。通過與谷胱甘肽的清除能力進行比較，采用相對半數(shù)清除量來判定多肽的抗氧化能力AO值。稱取多肽樣品10.0mg,水溶性好的樣品采用蒸餾水溶解與定容，水溶性差的樣品先溶于DMSO充分混合均勻，配制成10.0的母液。用蒸餾水將母液稀釋至不同倍數(shù)，得到不同濃度的待測樣品溶液。待測樣品溶液濃度的選擇應使其清除率在且線性方程的R2稱取L-還原型谷胱甘肽10.0蒸餾水定容至1.0充分混合均勻，配制成10.0的母液。用蒸餾水將母液稀釋至不同倍數(shù)，得到不同濃度的谷胱甘肽溶液。谷胱甘肽溶液濃度的選擇應使3其清除率在且線性方程的表1試劑添加量溶液名稱DPPH溶液 谷胱甘肽溶液 樣品溶劑溶液 無水乙醇溶液——于波長517條件下，用紫外分光光度計測定其吸光度值（樣品溶劑調(diào)零校準）。用待測樣品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同7.2.2.1。式中：犘—清除率；犃s—待測溶液與DPPH溶液混合液的吸光度；犃c—待測溶液與無水乙醇溶液混合液的吸光度；犃b—DPPH溶液與樣品溶劑溶液混合液的吸光度。以待測溶液濃度的自然對數(shù)值為橫坐標，以清除率為縱坐標，建立待測溶液濃度自然對數(shù)值與清除計算半數(shù)清除量EC50，按式（2）計算多肽樣品的抗氧化能力AO值。式中：AO—抗氧化能力；??計算結(jié)果以平行測定值的算術(shù)平均值表示，保留三位有效數(shù)字。ABTS經(jīng)氧化后生成較穩(wěn)定的藍綠色ABTS+自由基，在可見光區(qū)734nm處有最大吸收峰，抗氧4GB／T39100—2020化性多肽與ABTS+自由基反應后使其褪色，在734nm處的吸光值降低，采用紫外可見分光光度計測定反應后的吸光度。通過與谷胱甘肽的清除能力進行比較，采用相對半數(shù)清除量來判定多肽的抗氧化能力AO值。8.2試驗步驟稱取多肽樣品10.0mg，水溶性好的樣品采用蒸餾水溶解與定容，水溶性差的樣品先溶于DMSO再用蒸餾水定容，定容至1.0mL，充分混合均勻，配制成10.0mg／mL的母液。用9至不同倍數(shù)，得到不同濃度的待測定溶液。待測樣品溶液濃度的選擇應使其清除率在35%~65%，且液。用95%乙醇將母液稀釋至不同倍數(shù)，得到不同濃度的測定溶液。谷胱甘肽溶液濃度的選擇應使其清除率在且線性方程的取2支試管，分別編號為1、2號，每支試表2試劑添加量溶液名稱ABTS溶液谷胱甘肽溶液 樣品溶劑溶液 在1號試管中加入3.6mLABTS溶液和0.4mL谷胱甘肽溶液，作為試驗組（犃s在2號試管中加入3.6mLABTS溶液和0.4mL樣品溶劑溶液，作為空白組（犃b分別充分混合均勻后，室溫避光反應5min，于波長734nm條件下，用紫外分光光度計測定其吸光度值（樣品溶劑調(diào)零校準）。用待測樣品溶液代替谷胱甘肽溶液，其他操作同8.2.2.1。8.2.3試驗數(shù)據(jù)處理式中：犘—清除率；犃b—ABTS溶液與樣品溶劑溶液混合液的吸光度；5GB／T39100—2020As—待測溶液與ABTS溶液混合液的吸光度。以待測溶液濃度的自然對數(shù)值為橫