YYT 0251-1997 微量青霉素試驗(yàn)方法

中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)微量青霉素試驗(yàn)方法1997-10-1997-10-1中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)Testmethodsofpenicillin本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用微生物法測定微量青霉素的試驗(yàn)方法。2引用標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國藥典1995年版二部3方法提要利用抗生素的抗菌性質(zhì)及在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散滲透作用，將被檢物放入攤布高度敏感檢定菌的4.1青霉素標(biāo)準(zhǔn)品。4.2乙酸正戊酯。4.3培養(yǎng)基Ⅱ:中華人民共和國藥典1995年版二部(或培養(yǎng)基I:美國藥典XXⅡ版)。4.4營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：中華人民共和國藥典1995年版二部。稱取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g,加蒸餾水至1000mL,濾過，在115℃滅菌30min。稱取100g磷酸二氫鉀，溶于800mL蒸餾水中，加0.2mL濃鹽酸，再加蒸餾水至1000mL,用磷酸溶液[c調(diào)節(jié)pH值，使滅菌后pH為2.2～2.5,備用。將磷酸鹽緩沖液(4.6)稀釋10倍。4.8青霉素酶溶液用鮮肉湯將濃的青霉素酶溶液稀釋到1000u/mL,37℃恒溫培養(yǎng)5天，5℃以下冰箱保存?zhèn)溆谩?.9磷酸溶液取85%磷酸12.3mL加蒸餾水17.7mL。國家醫(yī)藥管理局1997-06-09批準(zhǔn)1997-10-01實(shí)施YY/T0251—199724.10.1藤黃微球菌ATCC93411>檢定菌液將工作用菌種ATCC9341的斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，32～35℃培養(yǎng)24h,然4.10.2藤黃微球菌ATCC9341a2(耐50mg/mL鏈霉素)檢定菌液將工作用菌種ATCC9341a代替4.10.1工作用菌種ATCC9341,其他操作步驟按4.10.1進(jìn)行。5儀器和材料5.1培養(yǎng)皿：內(nèi)徑90mm,皿深16～17mm,硬質(zhì)玻璃，皿底平坦，光潔，薄厚均勻、透明。5.2鋼管(牛津杯):不銹鋼制，外徑7.8mm±0.1mm,內(nèi)徑6.0mm±0.1mm,高10.0mm±0.1mm,同批鋼管的重量極差不超過0.05g,內(nèi)外光亮，無凹凸痕跡。5.6陶瓦蓋：內(nèi)徑103mm,外徑108mm,表面平坦，吸水性強(qiáng)。5.7生化培養(yǎng)箱：28℃±1℃。5.8恒溫水浴箱：控溫范圍0～100℃。5.9微波爐或電爐。5.10電熱干燥箱：控溫范圍40～250℃。5.11鋼管放置器：六孔直落式。6操作步驟6.1非青霉素類藥品中微量青霉素的測定采樣量：逐批按件數(shù)、瓶數(shù)取樣，設(shè)總件數(shù)為n。當(dāng)n≤3時(shí)，每件(瓶)都取，當(dāng)3<n≤300時(shí)，按√n+1取樣量隨機(jī)取樣，當(dāng)n>300時(shí)，按.取樣量隨機(jī)取樣。6.1.2青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備6.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)母液A液(1000u/mL)的制備5℃以下冰箱保存可用3天。6.1.2.2標(biāo)準(zhǔn)使用液的制備將A液取出，放置到室溫，用刻度吸管取A液1.0mL至50mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(4.5)稀釋成濃度為20u/mL的B液，取B液2.5mL至50mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(4.5)稀釋成濃度為1u/mL的C液，取C液2.0mL至50mL容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液(4.5)稀釋成濃度為6.1.3試樣液的制備1)ATCC9341適用于溶媒萃取法測定。3)直接法適用于鏈霉素類的抗生素藥品。YY/T0251—1997樣品號(hào)樣品液磷酸鹽緩沖液青霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液(6.1.2.2C液)青霉素酶溶液100230l46.1.3.2溶媒萃取法1加20mL乙酸正戊酯(4.2),加1mL磷酸鹽緩沖液(4.6),振搖，分層后將水層放入第二支分液漏斗中，如水溶液pH值大于3.0,用磷酸溶液(4.9)調(diào)節(jié)至pH2.5,不得超過5min,在第二支分液漏斗中再加在乙酸正戊酯中加入磷酸鹽緩沖液(4.5)10mL,使青霉素從乙酸正戊酯中轉(zhuǎn)入磷酸鹽緩沖液(4.5)中準(zhǔn)使用液(6.1.2.2)C液0.4mL,重復(fù)上述操作。樣品萃取物6.1.4測定「取4mL加磷酸鹽緩沖液(4.5)1mL……樣1取4mL加青霉素酶溶液(4.8)1mL……樣3[取4mL加磷酸鹽緩沖液(4.5)ImL……樣2L取4mL加青霉素酶溶液(4.8)1mL……樣46.1.4.1培養(yǎng)皿平板的制備將培養(yǎng)基Ⅱ溶化后，放入恒溫水浴(5.8)中保持48～50C,加入適量相應(yīng)的檢定菌混勻，用青霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液(6.1.2.2)D液標(biāo)定檢定菌液，使其產(chǎn)生的抑菌圈直徑在15～18mm,用滅菌吸管加入圖1順時(shí)針方向滴裝。樣1樣2樣3樣4樣5:磷酸鹽緩沖液(4.5)YY/T0251—19974滴完后，室溫放置2h,水平移入28℃±1℃生化恒溫培養(yǎng)箱(5.7)中，培養(yǎng)16～18h。6.1.5結(jié)果判斷b)樣1、樣2、樣6為陽性，樣3、樣4、樣5為陰性，其中樣6的標(biāo)準(zhǔn)圈直徑應(yīng)控制在15～18mm,樣1的抑菌圈直徑超過9mm,判為有青霉素污染。6.1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制6.1.6.1標(biāo)準(zhǔn)曲線用青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備稱取青霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.002～0.005g(精確至0.0002g),用磷酸鹽緩沖液(4.5)分別配制成0.01u/mL、0.025u/mL、0.04u/mL、0.08u/mL、0.16u/mL的溶液。6.1.6.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和計(jì)算取消毒好的培養(yǎng)皿10套，照6.1.4.1制備培養(yǎng)皿平板，每皿以圓心為中心等距離放置5支鋼管，以標(biāo)記的字為起點(diǎn)，按順時(shí)針在5支鋼管內(nèi)分別滴入5種不同濃度的青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，滴完后室溫放置2h,然后放入28℃±1℃生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18h,量取各抑菌圈的直徑，求出每個(gè)濃度10套培養(yǎng)皿抑菌圈直徑的平均值y,以濃度為對數(shù)坐標(biāo)，抑菌圈直徑的平均值為算術(shù)坐標(biāo)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。濃度的對數(shù)與抑菌圈直徑在一定范圍內(nèi)呈直線關(guān)系，其斜率b按式(1)計(jì)算：x——濃度的對數(shù)；6.2.1培養(yǎng)皿平板的制備按6.1.4.1方法進(jìn)行。6.2.2采樣與培養(yǎng)6.2.3結(jié)果判斷6.2.3.2每套培養(yǎng)皿不應(yīng)有任何