(高清版)GB∕T 38792-2020 蛋白質(zhì)致敏性細胞學評價技術(shù)規(guī)范

ICS07.080A21中華人民共和國國家標準蛋白質(zhì)致敏性細胞學評價技術(shù)規(guī)范T國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會ⅠGB／T38792—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。本標準起草單位：中國標準化研究院、江南大學、北京薩姆伯科技有限公司、石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司。本標準主要起草人：馬愛進、吳曉玲、胥傳來、匡華、袁愛夢、劉麗強、馬偉、徐麗廣、王忠興、郝帥、柴艷兵、張耀廣。GB／T38792—2020蛋白質(zhì)致敏性細胞學評價技術(shù)規(guī)范本標準規(guī)定了蛋白質(zhì)致敏性細胞學評價要求、證實方法。本標準適用于由免疫球蛋白E(IgE)介導的食品蛋白質(zhì)致敏性的細胞學評價。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1蛋白質(zhì)致敏性由蛋白質(zhì)誘發(fā)機體發(fā)生過敏反應的特性。注：本標準中的蛋白質(zhì)致敏性特指由嗜堿性粒細胞(RBL-2H3)表面結(jié)合的IgE與蛋白質(zhì)相互作用后導致β-氨基己糖苷酶釋放的程度。4.1按照相關(guān)法律法規(guī)和標準要求對樣品進行接收、保管、交接、配制、回收、退還／銷毀處理，并制定相應的管理制度和程序。4.2實驗室應符合生物安全一級要求。細胞實驗工作區(qū)一般要由準備室、緩沖間、無菌室、細胞保存室組成。其中，緩沖間面積應不小于3m2,并設(shè)有更衣柜和紫外燈，紫外燈的強度為不少于1.5W/m3。紫外燈源距地面不應超過2.5m,每次照射時間為20min~30min。無菌室無菌等級的最低標準應達到萬級。4.3評價使用的儀器與設(shè)備種類、數(shù)量、性能、量程、精度應能滿足評價的需要。評價需要的器皿材料應經(jīng)過無菌處理，試驗操作過程均為無菌操作。4.4實驗用水應滿足GB/T6682的要求，所使試劑使用前都需經(jīng)無菌處理。4.5評價實驗結(jié)束后，實驗材料應進行無害化處理。-氨基己糖苷酶最大釋放率表示。-氨基己糖苷酶最大釋放率。12GB／T38792—20205證實方法氨基己糖苷酶釋放率測定將待測樣品粉碎、450μm微孔濾膜過濾后，準確稱取5.00g于聚丙烯離心管中，向離心管中加入40mL水，充分振蕩混勻。將離心管水平置于振蕩器中，室溫下100次/min,振蕩12h,5000r/min離心10min,小心吸取上清液于另一個干凈的聚丙烯離心管中，真空冷凍干燥，固體蛋白粉末可于2℃~將待測樣品攪碎勻漿后，準確稱取5.00g,置于漏斗中，加入50mL石油醚進行連續(xù)3次沖洗后，放入烘箱中烘干。將烘干后的樣品置于聚丙烯離心管中，向離心管中加入10mL15%三氯乙酸溶液（體積分數(shù)充分振蕩混勻，靜置10min。樣品溶液5000r/min離心10min,小心吸取上清液于另一個干凈的聚丙烯離心管中，真空冷凍干燥，固體蛋白粉末可于2℃~8℃貯存，時間不超過24h。稱取5.00g液體樣品，置于漏斗中，加入50mL石油醚進行連續(xù)3次沖洗后，放入烘箱中烘干。將烘干后的樣品置于聚丙烯離心管中，加入40mL水，充分振蕩混勻勻，將離心管水平置于振蕩器中，室溫下100次/min,振蕩過夜12h,5000r/min離心10min,小心吸取上清液于另一個干凈的聚丙烯離心管中，真空冷凍干燥，固體蛋白粉末可于2℃~8℃貯存，時間不超過24h。稱取上述蛋白樣品50.0mg,用PBS緩沖液（參見附錄A)溶解并定容至50mL容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1mg/mL的儲備溶液。試驗時用Tyrode′s液（參見附錄A)稀釋成一定濃度的工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。細胞培養(yǎng)將RBL-2H3細胞（參見附錄A)置于細胞培養(yǎng)瓶中，加入10mL的細胞培養(yǎng)液（參見附錄A),于37℃,5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h~72h,倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞生長至培養(yǎng)瓶的80%~90%時，進行細胞計數(shù)和細胞接種。將細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)吸出，用PBS緩沖液洗細胞一次。向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2.0mL胰蛋白酶溶液（參見附錄A),于37℃消化2min~4min。在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞變圓接近脫壁時，將胰蛋白酶溶液倒掉。加入10mL細胞培養(yǎng)液，用吸管吹打，使細胞脫壁制成細胞懸液。吸取細胞懸液，以200μL/孔加到細胞培養(yǎng)板中，使細胞接種密度為1×105細胞/mL。37℃,5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使其貼壁。3GB／T38792—2020將細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)板內(nèi)吸出，用PBS緩沖液洗細胞三次。以200μL／孔向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入含50μg／mLIgE（參見附錄A）的細胞培養(yǎng)液，37℃，5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培5.1.6細胞與蛋白的激發(fā)作用將細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)板內(nèi)吸出，用PBS緩沖液洗細胞三次。分別以50μL／孔向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入不同濃度的待測蛋白工作液，37℃，5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中反應45min。反應結(jié)束后，放入冰水中終止反應。上述各項均設(shè)3個復孔。將細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)板內(nèi)吸出，用PBS緩沖液洗細胞三次。以50μL／孔向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入細胞裂解液（參見附錄A輕輕吹打使裂解液和RBL-2H3細胞充分接觸，4℃反應45min后，吸取全部細胞培養(yǎng)上清，1200r／min離心5min，收集細胞上清液。上述將細胞培養(yǎng)液從細胞培養(yǎng)板內(nèi)吸出，用PBS緩沖液洗細胞三次。以50μL／孔向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入Tyrode′s液，37℃，5%二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中反應45min。反應結(jié)束后，放入冰水中終止反應。上述設(shè)3個復孔。吸取5.1.6中作用后的反應液，以30μL／孔轉(zhuǎn)移至新的細胞培養(yǎng)板中，以50μL／孔向細胞培養(yǎng)板內(nèi)加入PNP-NAG溶液（參見附錄A37℃反應1h后，以200μL／孔加入碳酸鈉終止液（參見附錄A）終止反應，用酶標儀在波長405nm處測各孔吸光度值。樣品組的吸光度標記為犃1，空白對照組的吸光氨基己糖苷酶釋放率結(jié)果計算式中：氨基己糖苷酶釋放率；犃1—樣品組的吸光度；犃0—空白對照組的吸光度；犃m—全部釋放組的吸光度。平行樣的平均值為最終釋放率值，計算結(jié)果保留到小數(shù)點后兩位。4GB／T38792—2020附錄A（資料性附錄）GB/T6682規(guī)定的二級水。磷酸鹽緩沖液緩沖液）酸調(diào)節(jié)pH至7.2,再加水定容至1000mL,0.22μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆没蜻x用同類商品化產(chǎn)品。對硝基苯氨基葡萄糖苷溶液溶液）稱取加水溶解并定容至碳酸鈉終止液稱取1.06g碳酸鈉，加水溶解并定容至100mL,0.22μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆谩Ｅ_氏液液）氯化鈣和葡萄糖用水溶解用鹽酸調(diào)節(jié)再加水定容至10.22μm微孔濾膜濾過除菌，4℃保存?zhèn)溆没蜻x用同類商品化產(chǎn)品。A.6細胞培養(yǎng)液最低必需培養(yǎng)基(加入小牛血清和青霉素-鏈霉素，配制成含體積分數(shù)為10%小牛血清、1%青霉素-鏈霉素的細胞培養(yǎng)液，其中青霉素和鏈霉素的終濃度分別是100U/mL和100μg/mL。EMEM培養(yǎng)基可選用各種商品供應的粉末培養(yǎng)基，按生產(chǎn)廠商提供資料配制并除菌，4℃保存?zhèn)溆?。A.7細胞裂解液商品化細胞裂解液主要成分為氯化鈉和5mmol乙二胺四乙酸、體積分數(shù)為1%曲拉通X-100。0.22μ