DB51T 3184-2024醫(yī)用供體豬 基因鑒定通則

DB51本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定科學(xué)院?四川省人民醫(yī)院、四川泰康醫(yī)院、南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院、海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院、華愛迪眼科醫(yī)院、四川省機(jī)械研究設(shè)計院（集團(tuán)）有限公司、四川省實驗動物學(xué)會醫(yī)用豬專業(yè)委員王毅、杜嘉祥、陳剛、蔣子敬、竇科峰、楊恒鈺、鐘浩、姚曉明、莊醫(yī)用供體豬基因鑒定通則本文件規(guī)定了醫(yī)用供體豬基因鑒定的總體原則及鑒GB/T30989高通量基因測GB/T33681.1高通量基因測序樣本預(yù)處理方法第1部分：動GB/T35537高通量基因測序結(jié)GB/T38477基因表達(dá)的測定基因修飾geneticmodif基因組結(jié)構(gòu)變異genomestructuralv注：基因組結(jié)構(gòu)變異包括長片段序列插入或刪除、串聯(lián)重復(fù)、染色體倒位、染色體內(nèi)部或染色體之間的序列易位、高通量測序high-throughpu123455.1有效性評價樣本DNA提取可選用符合要求的市售試劑盒進(jìn)行提取，也可由實驗室自配試劑進(jìn)行提取。引物設(shè)判定目標(biāo)基因的是否敲除，應(yīng)將符合預(yù)期的條帶回收，進(jìn)行測序（見結(jié)果判定a)出現(xiàn)目標(biāo)條帶，則判定基因整合有效。檢測方法跡法、免疫組化/免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等方法進(jìn)行檢測。建議根據(jù)不同生產(chǎn)工藝選擇合適的檢測方法，蛋白免疫印跡法可作為基礎(chǔ)方法選用，蛋白免疫印跡法檢測及判定方法可參考蛋白免疫印跡法結(jié)果判定a)成像圖片本底干凈，能觀察到轉(zhuǎn)印膜均勻的輕微背景輪廓，目標(biāo)條帶清晰且不過曝，即可判b)基因整合類應(yīng)有目標(biāo)基因蛋白表達(dá)，敲除類應(yīng)無目標(biāo)基因蛋白表達(dá)。5.2遺傳穩(wěn)定性檢測醫(yī)用供體豬群體每代個體均應(yīng)進(jìn)行基因型鑒定和基因表達(dá)檢測，方法見5.1，應(yīng)連續(xù)監(jiān)測3代以上。染色體結(jié)構(gòu)變異預(yù)期基因片段插入、序列缺失、倒置、異位，則認(rèn)為在醫(yī)用脫靶檢測使用Cas-OFFinder（CRISPRRGENTools()）或類似算法模型工息和基因組參考序列一致，則認(rèn)為沒有脫靶，反之則PERVhumanmembranecofactorproteintransgenic(hCD46-tg)humandecay-acceleratingfactortransgenic(hCD55-tg)humanmembraneinhibitorofreactivelysistransgenic(hCD59-tg)humancomplement-regulatoryproteinC1inhibitortransgenic(hC1-INH-tg)HLA-E/humanbeta2-microglobulintransgenic(HLA-E/B2M-humansignalregulatoryproteinalphatransgenic(hCD47-tg)humanCTLA4-Igtransgenic(hCTLA4-Ig-porcineCTLA4-Igtransgenic(pCTLA4-Ig-tg)humandominant-negativemutantclassIItransactivatortransgenhumanthrombomodulintransgenic(hTBM-tg)humanendothelialproteinCreceptortransgenic(hEPCR-tg)humantissuefactorpathwayinhibitortransgenic(hTFPI-tg)humanectonucleosidetriphosphatediphosphohydrolase-1transgenic(hCD39-tg)humanecto-5′-nucleotidasetransgenic(hCD73-tg)humantumournecrosisfactorα–inducedprotein3(TNFAIP3)humanhaemeoxygenase1trasolublehumanTNFRI-Fctransgenic(sh血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3mL～5mL。LEA29Y上游引物：5’-GTACCCACCGCCATACTAC2×酶緩沖液KODBuffer1×2注：反應(yīng)體系中的各組分可根據(jù)不同最終反應(yīng)體系進(jìn)行區(qū)分，但是需保持所最后68℃延伸5min；反應(yīng)完成后在4℃保存。制備1%的瓊脂糖凝膠并加入染色劑，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。將10檢驗過程中分別設(shè)陽性對照、陰性對照、空白對照。采用含有LEA29Y基因的質(zhì)粒作為陽性對照，WT豬的DNA作為陰性對照，采用與模板等體積a)空白對照：無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶；在符合B.1.5的情況下，被檢樣品在573bp大小處可見PCR擴(kuò)增條帶則判為陽性，LEA29Y基因整合至豬基因組上；在573bp大小處未見PCR擴(kuò)增條帶利用LEA29Y蛋白與LEA29Y抗體的特異性結(jié)合，檢測抗體酶標(biāo)物或標(biāo)記熒光來間接鑒定LEA29Y取適量豬胰腺組織，加入100μLRIPA裂解液，冰上裂解30min。獲得胰腺組織蛋白液，取少量細(xì)胞裂解液測定蛋白濃度（可用BCA蛋白濃度測定將PVDF膜浸泡到甲醇中進(jìn)行活化1min；將3張轉(zhuǎn)膜用濾紙于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5min；將轉(zhuǎn)膜夾放于盛有1×轉(zhuǎn)膜緩沖液的盤中，白板（陽極）在上，黑板（陰極）在下，由下向上依次放置1塊海綿、2層濾紙、SDS-凝膠、PVDF膜、1層濾紙，注意PVDF膜和SDS-凝膠之間不應(yīng)有氣泡，最后合上轉(zhuǎn)膜夾,將其放置于轉(zhuǎn)膜槽中。轉(zhuǎn)膜槽中加入4℃冰箱預(yù)冷30min的1×轉(zhuǎn)膜液，加入冰袋，蓋上轉(zhuǎn)膜蓋。然后將轉(zhuǎn)膜槽放置于泡沫箱中，加入冰水混合物，以在180mA恒流（或90V恒壓）條件下，轉(zhuǎn)移時間為1.5h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，若Marker清晰可見，證明轉(zhuǎn)膜將PVDF膜浸入封閉液（含5%脫脂奶粉的TBST）于平板搖床上搖動封閉1h?將PVDF膜浸入含適當(dāng)比例一抗的稀釋液中，在室溫下孵育1h?取出PVDF膜，浸入TBST在搖床上洗滌4次，每次5min?將PVDF膜浸入含適當(dāng)比例二抗的稀釋液中，在室溫下孵育1h?孵育完成后取出PVDF膜，浸入TBST在搖床上洗滌4次，每次5min?達(dá)；若實驗組與對照組均無目的條帶，則蛋并冷凍，并儲存在-70℃。用冰凍切片機(jī)作冰凍切片風(fēng)干后用丙酮固定10min～15min。用0.3%過氧化氫甲醇溶液或1%鹽酸酒精37℃作用30min。PBS漂洗3次，每次5min。5%小牛血清或1：10稀釋的正常馬血清，37℃濕盒中作用30min。加適當(dāng)稀釋的已知單抗或抗血清，37℃濕盒中作用1h后4℃過夜。PBS洗3次，每次5min。加適當(dāng)稀釋的第二抗體酶結(jié)合物，37℃盒作用1h。PBS洗3次，每次5min。新鮮配制的DAB溶液顯色5min～10min后用PBS漂洗3次，每次5min。對照片本底清晰,背景無非特異著染,被檢物呈黃至棕褐色著染,即可冰凍切片取出，室溫放置使其干燥后，用冷丙酮于4℃固定10min。切片用0.01mol/LPBS清洗后加入1.2%雙氧水作用30min，以除去非特異染色。0.01mol/LPBS清洗，洗3次，每次10min。加入熒光抗體IgG，室溫育2h。0.01mol/LPBS清洗，洗3次，每次10min。用10mL注射器從豬的前腔靜脈采集8mL全血。取6mL保存在促凝采血按照酶聯(lián)免疫試劑盒所述操作步驟對待測試樣(液)進(jìn)行根據(jù)待測樣本中目的蛋白的含量,選擇一個合適的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn),以確定試驗過程的操按照試劑盒說明書提供的計算方法,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度變化關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)按照試劑盒說明書提供的計算方法,將待測樣品吸光度代人B.所獲得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,計算待測血液采集：使用紫色采血管，采集豬全血3mL～5mL。GGTA1下游引物：5’-GATCCTAATTGGGTTTGCTG2×酶緩沖液KODBuffer1×2最后68℃延伸5min；反應(yīng)完成后在4℃保存。制備1%的瓊脂糖凝膠并加入染