AbMole 體內(nèi)免疫肽組揭示新的腫瘤特異性抗原

AbMole|解密體內(nèi)免疫肽組揭示新的腫瘤特異性抗原由AlexM.Jaeger,LaurenE.Stopfer,RyuhjinAhn等人在“Nature”上發(fā)表的名為“Decipheringtheimmunopeptidomeinvivorevealsnewtumourantigens”的文章，在該文章中，使用了AbMole的CHIR99021（M1692）、PD0325901（M1763）的2種產(chǎn)品。癌癥的免疫治療近年來(lái)取得了顯著進(jìn)展，其核心在于通過(guò)激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)識(shí)別和攻擊腫瘤細(xì)胞。這一過(guò)程依賴于主要組織相容性復(fù)合體I類（MHC-I）分子在細(xì)胞表面呈遞的肽抗原，這些肽抗原通常由腫瘤細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)生。然而，當(dāng)前對(duì)MHC-I相關(guān)肽（即免疫肽組）的研究主要依賴于體外實(shí)驗(yàn)或腫瘤裂解物分析，這些方法往往忽略了體內(nèi)微環(huán)境對(duì)肽抗原呈遞的復(fù)雜影響。為了更深入地理解體內(nèi)腫瘤特異性抗原的呈遞機(jī)制，研究人員設(shè)計(jì)并驗(yàn)證了一種新型小鼠模型，該模型能夠在體內(nèi)精確分離MHC-I肽，并揭示了多種新的腫瘤抗原。癌癥免疫監(jiān)視依賴于免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞表面MHC-I分子上呈遞的肽抗原的識(shí)別。然而，現(xiàn)有的MHC-I肽組研究方法多局限于體外細(xì)胞培養(yǎng)或腫瘤裂解物分析，這些方法難以全面反映體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境和腫瘤特異性。因此，研究人員設(shè)計(jì)了一種在小鼠MHC-I基因中插入誘導(dǎo)型親和標(biāo)簽的方法，以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)精確分離和鑒定MHC-I肽，進(jìn)而揭示腫瘤特異性抗原的呈遞機(jī)制。研究人員首先在小鼠MHC-I基因（H2-K1）內(nèi)含子1中插入了一個(gè)Cre可誘導(dǎo)的外顯子，該外顯子編碼高度特異性的親和標(biāo)簽StrepTagII。這一設(shè)計(jì)使得在Cre重組酶的作用下，StrepTagII會(huì)被整合到成熟的H2-Kb蛋白的N端，從而允許通過(guò)StrepTactin親和樹脂特異性地純化帶有StrepTagII的MHC-I肽。隨后，這一KbStrep等位基因被靶向整合到攜帶KrasLSL-G12D/+Trp53fl/fl（KP）基因型的小鼠胚胎干細(xì)胞中，從而建立了可用于研究體內(nèi)腫瘤特異性抗原呈遞的新型小鼠模型。圖1KPKbStrep小鼠模型的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證為了研究胰腺癌（PDAC）和肺腺癌（LUAD）的免疫肽組，研究人員通過(guò)不同的途徑在KP小鼠中誘導(dǎo)了腫瘤。對(duì)于PDAC，通過(guò)胰腺導(dǎo)管內(nèi)逆行注射表達(dá)Cre重組酶的腺病毒，誘導(dǎo)了自發(fā)生成的胰腺癌。對(duì)于LUAD，則通過(guò)氣道內(nèi)給予表達(dá)Cre重組酶的腺病毒，在KP小鼠中誘導(dǎo)了肺腺癌。在腫瘤誘導(dǎo)成功后，研究人員采集了不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤樣本以及相應(yīng)的正常組織樣本，用于后續(xù)的MHC-I肽分離和分析。圖2LUAD免疫肽球在整個(gè)腫瘤進(jìn)化過(guò)程中是動(dòng)態(tài)和異質(zhì)性的圖3LUAD特有肽的轉(zhuǎn)錄和翻譯為了精確分離MHC-I肽，研究人員采用了抗體免疫沉淀（Ab-IP）和StrepTactin親和純化兩種方法。抗體免疫沉淀方法使用特異性抗體結(jié)合MHC-I分子，從而分離出與之結(jié)合的肽段。而StrepTactin親和純化方法則利用StrepTagII與StrepTactin之間的高親和力，特異性地純化出帶有StrepTagII的MHC-I肽。分離得到的肽段隨后通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）進(jìn)行分析，以確定其序列和特性。圖4LUAD中新腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)通過(guò)比較體外培養(yǎng)的細(xì)胞、原位移植的腫瘤以及自發(fā)生成的腫瘤中MHC-I肽的組成，研究人員發(fā)現(xiàn)體內(nèi)特異性分離的MHC-I肽覆蓋了更廣泛的免疫肽組。特別是，通過(guò)StrepTactin親和純化鑒定出的多種肽段僅在體內(nèi)腫瘤樣本中特異性出現(xiàn)，這表明體內(nèi)微環(huán)境對(duì)MHC-I肽的呈遞具有重要影響。為了進(jìn)一步探究體內(nèi)MHC-I肽的細(xì)胞類型特異性，研究人員利用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)分析了健康肺組織和腫瘤組織中基因表達(dá)譜的差異。結(jié)果表明，通過(guò)StrepTactin親和純化的MHC-I肽強(qiáng)烈反映了肺泡2型（AT2）細(xì)胞的特征，這表明這些肽段主要由AT2細(xì)胞呈遞。相比之下，抗體免疫沉淀得到的肽段則包含多種細(xì)胞類型的污染，進(jìn)一步驗(yàn)證了體內(nèi)特異性分離方法的優(yōu)越性。隨著LUAD的進(jìn)展，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫肽組逐漸偏離了正常AT2細(xì)胞的特征。通過(guò)基因集富集分析（GSEA），他們發(fā)現(xiàn)晚期腫瘤肽簽名與胃癌上皮模塊和高度混合轉(zhuǎn)錄模塊的相關(guān)性顯著增加，而與AT2模塊的相關(guān)性顯著減少。這表明腫瘤在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了顯著的免疫逃逸機(jī)制轉(zhuǎn)變，進(jìn)而影響了MHC-I肽的呈遞模式。通過(guò)質(zhì)譜分析，研究人員在LUAD樣本中鑒定出了135種非突變腫瘤特異性抗原（TSA）和147種腫瘤相關(guān)抗原（TAA）。為了驗(yàn)證這些抗原的免疫原性，他們選擇了其中部分抗原制備了疫苗，并通過(guò)骨髓衍生的樹突狀細(xì)胞（BMDC）接種給小鼠。結(jié)果表明，多種TSA和TAA在疫苗接種后成功誘導(dǎo)了顯著的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。特別是PRDM15來(lái)源的肽SVAHFINL在腫瘤組織中特異性地誘導(dǎo)了強(qiáng)烈的T細(xì)胞反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了其在腫瘤免疫治療中的潛力。盡管mRNA表達(dá)水平和預(yù)測(cè)親和力在一定程度上可以指導(dǎo)MHC-I肽的篩選和驗(yàn)證工作，但研究人員發(fā)現(xiàn)許多腫瘤特異性肽的呈現(xiàn)并不能完全通過(guò)這些因素來(lái)解釋。為了進(jìn)一步探究抗原呈遞的分子機(jī)制，他們利用核糖體分析（Ribo-seq）技術(shù)研究了相關(guān)基因的翻譯效率變化。結(jié)果表明LUAD特異性肽的基因在腫瘤中表現(xiàn)出顯著的翻譯效率變化，這提示翻譯后修飾在抗原呈遞過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。此外他們還發(fā)現(xiàn)LUAD特異性肽的來(lái)源蛋白在穩(wěn)定性和細(xì)胞定位方面也存在差異進(jìn)一步支持了翻譯后修飾對(duì)抗原呈遞的影響。本研究通過(guò)體內(nèi)精確分離MHC-I肽的方法揭示了腫瘤免疫肽組的復(fù)雜性和動(dòng)態(tài)變化性。研究結(jié)果表明體內(nèi)外MHC-I肽的組成存在顯著差異且受腫瘤微環(huán)境影響顯著；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)了多種新的腫