6種皰疹類病毒特異性酶切圖譜的建立及其應(yīng)用分析

1/16種皰疹類病毒特異性酶切圖譜的建立及其應(yīng)用分析2003漸江大學(xué)碩士學(xué)位論文6種皰疹類病毒特異性酶切圖譜的建立及其應(yīng)用研究浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科學(xué)碩士研究生董關(guān)萍導(dǎo)師尚世強(qiáng)主任醫(yī)生中文摘要皰疹病毒屬中具有代表性的是單純皰疹病毒I型與II型(HSVI／II)、愛(ài)一馬爾病毒(EBV)、入巨細(xì)胞病毒(CMV)、水痘一帶狀皰疹病毒(VZV)和人類毒6型(HHV6)這6種病毒，它們是免疫功能低下者臨床常見(jiàn)的病原體，尤其胞、體液免疫系統(tǒng)不成熟，易導(dǎo)致皰疹類病毒感染。

皰疹類病毒感染后其臨床體征沒(méi)有特異性，而且臨床又缺乏有效的診斷方法。

在本研究中，我們?cè)诎捳钶^保守的DNA多聚酶基因上自行設(shè)計(jì)兩對(duì)共用引物，分別對(duì)6種病毒進(jìn)行聚反應(yīng)(PCR)及限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)，最終建立了PCR-RFL快速檢測(cè)病毒DNA的方法，并對(duì)臨床標(biāo)本迸行檢測(cè)取得較好結(jié)果。

第一部分皰疹類病毒特異性酶切圖譜的建立廠。

方法：

在皰疹類病毒高度同源序列。

NA多聚酶基因中設(shè)計(jì)兩對(duì)通用引物擴(kuò)增單純皰疹病毒I型與II型、愛(ài)潑斯坦一馬爾病毒、人巨細(xì)胞病毒四種病毒，另一2003浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文HSVII(G株)、CMV(ADl69株)、EBV(B95-8株)、VZV(EF株)和(HHVPCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分子克隆、序列分析，選擇B鋤HI和BstUI兩種內(nèi)切--PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切。

結(jié)果：

6種標(biāo)準(zhǔn)病毒株P(guān)CR擴(kuò)增后產(chǎn)物為510～592bp，其最小檢出量為龜，與乙型肝炎病毒、真菌、細(xì)菌和人類基因組無(wú)交叉反應(yīng)。

發(fā)現(xiàn)G卜C含量在EBV、HSVI／II中較多，分別為60．2％、61．5％、66．2％和67．5％，VzVHHV6則較低分別為40．5％、,13．2％。

CMV擴(kuò)增產(chǎn)物(592bp)內(nèi)含8個(gè)BstUI點(diǎn)，經(jīng)BstUI酶切后產(chǎn)生170bp、130bp、80bp、62bp、50bp、40bp、316bp和14bp9個(gè)DNA片段，但不能被BamHI酶切；EBV520bp長(zhǎng)度內(nèi)含1BamHI和1個(gè)BstUl酶切位點(diǎn)，經(jīng)BamHI酶切成250bp和270bp，被Bst成254bp和266bp；HSVI全長(zhǎng)含7個(gè)BstUI酶切位點(diǎn)，經(jīng)BstUI酶切后230bp、130bp、50bp、40bp、23bp、20bp、15bp和10bp8個(gè)段，但無(wú)BamHl酶切位點(diǎn)；HSVII含1個(gè)BamHl及9個(gè)BstUI酶切位點(diǎn)，經(jīng)mHI酶切成230bp和288bp，但被BstUI切成168bp、90bp、80bp、60bp、40bp、30bp、20bp、15bp、10bp、和5bpl0個(gè)D段。

酶切后凝膠電泳能將HSVI／HSVII、EBV、CMV鑒別出來(lái)。

VZV無(wú)BamHl點(diǎn)，而含1個(gè)BstUI酶切位點(diǎn)，切成280bp和230bp兩個(gè)片段；HHV6被切成243bp和2