葡聚糖凝膠過(guò)濾分離蛋白質(zhì)

關(guān)于葡聚糖凝膠過(guò)濾分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料與器材實(shí)驗(yàn)步驟第2頁(yè),共9頁(yè)，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)原理

凝膠過(guò)濾層析利用有一定孔徑的多孔的親水性凝膠作為載體，當(dāng)分子大小不同的混合物通過(guò)這種凝膠柱時(shí)，各物質(zhì)在柱中存在兩種運(yùn)動(dòng)，一是隨洗脫液垂直向下移動(dòng)，二是無(wú)定向的擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)。直徑大于凝膠孔徑的大分子，不能進(jìn)人膠粒內(nèi)部，便直接沿著膠粒間隙溶劑先流出，稱(chēng)為全排出)；小分子物質(zhì)，直徑小于凝膠孔徑，能自由進(jìn)出能容納下它們的孔穴，繞道而行，結(jié)果在柱中的保留時(shí)間增長(zhǎng)而最后流出;中等大小的分子，能進(jìn)人部分膠粒內(nèi)部，從而在柱中的保留時(shí)間較大分子長(zhǎng)，但較小分子短，中間流出。于是，流過(guò)凝膠柱的混合物按其分子大小W被分離。第3頁(yè),共9頁(yè)，星期六，2024年，5月

混合物中某一被分離成分在一定的凝膠層析柱內(nèi)的洗脫，通常用分配系數(shù)(Kd)來(lái)表示。其定義為：

Kd=（Ve一V0）/ViVe，某一被分離物成分被洗脫時(shí)所用洗脫液的體積

Vo，凝膠顆粒間自由空間的總體積

Vi，膠顆粒內(nèi)部孔穴的總?cè)莘e大分子物質(zhì)，其Kd=0，小分子能全部進(jìn)人膠粒內(nèi)的Kd=1，中等大小分子，Kd在O～1之間。凝膠過(guò)濾法的分辨率（ρ）是凝膠層析中的另一個(gè)主要特征常數(shù)。從數(shù)學(xué)角度上可以表示為：

ρ=２（Ｖ２－Ｖ１）／（Ｗ１＋Ｗ２）（≥１）Ｖ２、Ｖ１，是兩種被分離物的洗脫體積

W１、W２，是兩個(gè)物質(zhì)的洗脫峰的寬度。兩個(gè)相的物質(zhì)要想完全分離，ρ≥１。第4頁(yè),共9頁(yè)，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)材料與器材

胰蛋白酶（分子量為23KD）和牛血清白蛋白（分子量68KD）混合物、層析柱50cm×l.lcm、核蛋檢測(cè)儀、部分收集器、sephadexG一l50第5頁(yè),共9頁(yè)，星期六，2024年，5月實(shí)驗(yàn)步驟

1．凝膠的處理：取干燥的SephadexG一l5O浸泡在洗脫液（本實(shí)驗(yàn)用蒸餾水，含5%的乙醇）中，充分溶脹，注意不要過(guò)分?jǐn)嚢?，以防顆粒破碎。為了縮短溶脹時(shí)間，可在沸水浴上加熱至將近1OO℃，還可以排除凝膠內(nèi)部的汽泡。第6頁(yè),共9頁(yè)，星期六，2024年，5月2．裝柱：將柱子及其附件清洗干凈先將下口接好，加上緩沖液，將出口處的汽泡排除，待柱內(nèi)剩有2cm左右液柱時(shí)，關(guān)緊流出口，將己溶脹好的凝膠的上清液吸去，輕輕攪拌凝膠順層析柱或玻璃棒一次性?xún)A倒入層析柱，待底部自然沉降有一定凝膠后，打開(kāi)流出口，直至凝膠沉積至所需高度。加蓋，并接上貯液瓶，開(kāi)始滴注洗脫平衡液（本實(shí)驗(yàn)用蒸餾水，含5%的乙醇）。至少要滴注2個(gè)柱床體積的洗液，使膠床穩(wěn)定。并檢查柱子裝得是否均勻、有無(wú)斷層，有無(wú)汽泡（若有需重裝）。第7頁(yè),共9頁(yè)，星期六，2024年，5月上樣：①用蒸餾水溶解胰蛋白酶含量為l5mg/ml，加樣體積為0.4cm高。②吸去柱床上的溶液，直至膠面剛露出為止。③將樣品沿柱壁四周緩慢加入(別攪動(dòng)膠面)④打開(kāi)下流出口，使樣品進(jìn)入膠床。⑤再如上法，加１－2次小體積的洗脫液沖洗內(nèi)壁