色譜聯(lián)用技術(shù)

關(guān)于色譜聯(lián)用技術(shù)課件7.1色譜聯(lián)用分析技術(shù)概述1.聯(lián)用技術(shù)的必要性每種分析方法都有其特長和局限性。局限性來自兩個方面：

原理方面，不可逾越；技術(shù)方面，可以改進、發(fā)展。在線聯(lián)用不僅能取長補短，而且還具有協(xié)同作用，獲得兩種技術(shù)單獨使用時所不具備的某些功能。第2頁,共82頁，星期六，2024年，5月2.實現(xiàn)在線聯(lián)用的關(guān)鍵

硬件接口（hardwareinterface）

用于協(xié)調(diào)聯(lián)用的兩種儀器的輸出和輸入之間的矛盾，使兩種儀器連接成一個整體。第3頁,共82頁，星期六，2024年，5月3.色譜聯(lián)用技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀色譜：分離光譜：結(jié)構(gòu)鑒定兩者聯(lián)用，不僅可以對混合物中的各未知組分進行定性，也可用于定量分析。GC-MS,GC-FTIR,LC-MS,LC-FTIR,LC-NMR,LC-ICP-AES…第4頁,共82頁，星期六，2024年，5月7.2氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用

GC-MS第5頁,共82頁，星期六，2024年，5月

1.氣相色譜與“四譜”工作條件的適應(yīng)性第6頁,共82頁，星期六，2024年，5月2、氣質(zhì)聯(lián)用接口（協(xié)調(diào)輸出/輸入的矛盾）工作氣壓不匹配是實現(xiàn)GC－MS聯(lián)用的主要困難。GC柱的輸出為100kPa，而MS離子源在小于10－3Pa的條件下工作。接口的作用是將GC流出的載氣氣壓降低到MS能夠接受的程度，并將樣品送入MS離子源接口的類型噴射式分子分離器，早期，適合于填充柱；通過傳輸線直接連接，適合于毛細管柱。第7頁,共82頁，星期六，2024年，5月噴射式分子分離器的結(jié)構(gòu)作用：①降低氣壓；②濃縮樣品。第8頁,共82頁，星期六，2024年，5月出口氣相色譜高真空泵傳輸線化學工作站軟件（計算機）離子源質(zhì)量分析器機械泵檢測器質(zhì)譜3.儀器結(jié)構(gòu)第9頁,共82頁，星期六，2024年，5月GC-MS組成：

GC：低流失毛細管柱載氣必須用>99.999%的氦氣

離子源：電子轟擊源、化學電離源

MS：四極桿質(zhì)譜儀、離子阱、飛行時間質(zhì)譜儀

接口：細口徑毛細管柱——通過傳輸線直接連接粗口徑——分流

數(shù)據(jù)系統(tǒng)：計算機數(shù)據(jù)庫

真空系統(tǒng)：分子渦輪泵第10頁,共82頁，星期六，2024年，5月4、質(zhì)量分析器四極桿質(zhì)量分析器飛行時間質(zhì)量分析器離子阱質(zhì)量分析器磁質(zhì)量分析器傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)量分析器多個質(zhì)量分析器的串聯(lián)（串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用）第11頁,共82頁，星期六，2024年，5月1.四極桿質(zhì)量分析器

（QuadrupoleMassFilter）+ElectronBeamABCSampleinIonBeam對于給定的直流DC和射頻電壓RF

，特定質(zhì)荷比的離子在軸向穩(wěn)定運動，其他質(zhì)荷比的離子則與電極碰撞湮滅。將DC和RF以固定的斜率變化，實現(xiàn)質(zhì)譜掃描功能。

第12頁,共82頁，星期六，2024年，5月特點：

（1）結(jié)構(gòu)簡單，體積小，價格便宜

（2）掃描速度快，與色譜出峰速度匹配，適合聯(lián)用

（3）可串聯(lián)使用

（4）無需狹縫分離，靈敏度高

（5）質(zhì)量分辨率不高(小數(shù)點后1位）

（6）檢測的m/z范圍小第13頁,共82頁，星期六，2024年，5月2.離子阱質(zhì)量分析器(iontrap)特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達檢測器；第14頁,共82頁，星期六，2024年，5月特點：

（1）結(jié)構(gòu)簡單，體積小，價格低

（2）掃描速度快，與色譜出峰速度匹配，適合聯(lián)用

（3）自身可做多級，有利于定性

（4）質(zhì)量分辨率6000-9000（5）檢測的m/z范圍小第15頁,共82頁，星期六，2024年，5月3.飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)具有相同動能、不同質(zhì)量的離子，其飛行速度不同而分離。如果固定離子飛行距離，則不同質(zhì)量離子的飛行時間不同，質(zhì)量小的離子飛行時間短而首先到達檢測器。第16頁,共82頁，星期六，2024年，5月特點：

（1）結(jié)構(gòu)簡單，體積較大，價格略貴

（2）掃描速度快，與色譜出峰速度匹配，適合聯(lián)用

（3）靈敏度高（4）質(zhì)量分辨率高（5）檢測質(zhì)量無上限第17頁,共82頁，星期六，2024年，5月氣相色譜-四極桿質(zhì)譜儀第18頁,共82頁，星期六，2024年，5月第19頁,共82頁，星期六，2024年，5月4.氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)提供的信息GC-MS-Computer的工作過程：GC：各組分被色譜柱分離，隨時間變化依次從柱子流出，通過接口進入MS。MS：連續(xù)掃描MS圖，每掃描一張MS圖需花費約零點幾到幾秒鐘?？倰呙钑r間＝(掃一張圖譜的時間)×掃描次數(shù)計算機：將得到的所有MS數(shù)據(jù)存儲起來，供下一步的處理和輸出。第20頁,共82頁，星期六，2024年，5月(1)總離子流圖（TIC）質(zhì)譜儀檢測到的所有離子信號（不分其質(zhì)荷比）的總和對時間t作圖相當于氣相色譜圖。沒有組分通過時為基線；當組分流出時，即出現(xiàn)峰。記錄方法：TIC檢測器；計算機采集和存儲連續(xù)、重復(fù)掃描的信息，然后進行數(shù)據(jù)處理。第21頁,共82頁，星期六，2024年，5月TIC圖中的每一個峰代表一個組分；峰的位置就是該組分的色譜保留時間；峰面積與組分的相對含量有關(guān)。某種天然蠟質(zhì)衍生物的GC－MS總離子流圖第22頁,共82頁，星期六，2024年，5月(2)每個組分的質(zhì)譜圖可從質(zhì)譜圖獲得組分的分子量和分子結(jié)構(gòu)信息。譜庫檢索根據(jù)NIST，INCOS，PBM三種算法，將未知物圖譜與譜庫中的標準圖譜比較，匹配度越高，可信度越高88101396第23頁,共82頁，星期六，2024年，5月序號 化合物名稱 序號 化合物名

1 十六碳酸 12 二十九碳烷

29,12-十八碳二烯酸 13 三十碳烷

3 十八碳酸 14 二十六醇乙酸酯

4 二十四碳烷 15 三十一碳烷

5 二十醇乙酸酯 16 結(jié)構(gòu)未定*

6 二十五碳烷 17 三十二碳烷

7 二十六碳烷 18 二十八醇乙酸酯

8 二十二醇乙酸酯 19結(jié)構(gòu)未定*

9 二十七碳烷 20 三十四碳烷 10 二十八碳烷 21 三十醇乙酸酯 11 二十四醇乙酸酯 22～25 結(jié)構(gòu)未定* 由GC－MS確定的某天然蠟衍生物的成分第24頁,共82頁，星期六，2024年，5月(3)質(zhì)量色譜圖（提取離子流圖）以指定質(zhì)荷比的離子強度（而不是總的離子流強度）對時間t（或掃描號）作圖。是計算機進行數(shù)據(jù)處理得到的圖。優(yōu)點：可在復(fù)雜混合物的TIC圖中,迅速找到所需檢測的化合物或同系物。第25頁,共82頁，星期六，2024年，5月某天然蠟衍生物的總離子流圖和質(zhì)量色譜圖（用于尋找一類成分）第26頁,共82頁，星期六，2024年，5月1.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100質(zhì)量色譜圖總離子流圖（用于尋找微量成分）第27頁,共82頁，星期六，2024年，5月5.GC-MS的應(yīng)用

凡是能用氣相色譜分析的試樣，均適合于GC-MS分析，如環(huán)境污染物的分析香精、香料的成分分析和質(zhì)量評價中草藥的揮發(fā)性成分鑒定藥物及其他化工產(chǎn)品的分析毒物、毒品及違禁藥物的鑒定和檢測等等。第28頁,共82頁，星期六，2024年，5月（1）GC-MS定性分析分析條件的設(shè)定

GC條件：同普通CGCMS條件：掃描方式，掃描范圍，掃描速度,燈絲電流，倍增器電壓等定性分析

進樣，電離，質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，譜圖檢索第29頁,共82頁，星期六，2024年，5月GC-MS定量分析依據(jù)用總離子色譜圖定量用質(zhì)量色譜圖（提取離子色譜圖）定量用選擇離子色譜圖定量（SIM，選擇離子監(jiān)測）

對串聯(lián)質(zhì)譜還可以用MRM（SRM，反應(yīng)離子監(jiān)測）定量優(yōu)缺點…GC-MS定量分析方法：內(nèi)標法，外標法，歸一化

（2）GC-MS定量分析第30頁,共82頁，星期六，2024年，5月有機氯農(nóng)藥的GC-MS總離子流圖第31頁,共82頁，星期六，2024年，5月第32頁,共82頁，星期六，2024年，5月7.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

LC-MS第33頁,共82頁，星期六，2024年，5月一、實現(xiàn)LC-MS的困難

1.LC流動相對MS工作條件的影響1ml溶劑氣化生成500-1300ml的蒸氣，而質(zhì)譜儀只能接受10ml/min氣體流量。有時流動相中含難以揮發(fā)的緩沖鹽2.質(zhì)譜離子源溫度、電離方式不適宜液相色譜所分析的樣品。第34頁,共82頁，星期六，2024年，5月二、接口系統(tǒng)1.脫溶劑2.使被測物電離第35頁,共82頁，星期六，2024年，5月1.粒子束接口（Particle-Beam,PB）根據(jù)流體力學原理，利用樣品與溶劑動量的不同將它們分開形成氣溶膠→脫溶劑→動量分離得到的譜圖與電子轟擊質(zhì)譜圖非常相似，可利用標準譜圖檢索現(xiàn)少使用第36頁,共82頁，星期六，2024年，5月EIPB第37頁,共82頁，星期六，2024年，5月2.電噴霧電離（ESI，接口+軟電離技術(shù)）RayleighLimitReached++++++++++-----++++++++++-----++++++--++++++--Evaporation++ChargedDroplets試樣離子準分子離子AnalyteIonsSolventIonClustersSalts/IonpairsNeutrals++++++++--其他離子第38頁,共82頁，星期六，2024年，5月電噴霧電離，Electrospray流出液在高電場下形成帶電噴霧，在電場力作用下穿過氣簾。氣簾的作用：霧化；蒸發(fā)溶劑；阻止中性溶劑分子第39頁,共82頁，星期六，2024年，5月特點：是LC-MS的基本配置接口是一種軟電離方式，適合穩(wěn)定性差、極性大、分子量大的物質(zhì)的電離。主要生成準分子離子（[M+H]+、[M-H]-、[M+Na]+等），生物大分析產(chǎn)生多電荷離子。靈敏度高不能進行譜庫檢索不適用于非極性化合物的分析第40頁,共82頁，星期六，2024年，5月對于大分子化合物，電噴霧產(chǎn)生多電荷離子，相對分子質(zhì)量Mr計算方法如下：選相鄰峰，電荷n，n+1m1=(Mr+n+1)/(n+1)m2=(Mr+n)/n第41頁,共82頁，星期六，2024年，5月分子量約為12200的細胞色素的ESI質(zhì)譜圖第42頁,共82頁，星期六，2024年，5月3.大氣壓化學電離(AtmosphericPressureChemicalIonization,APCI)電離主要生成溶劑離子樣品分子與溶劑離子反應(yīng)生成離子簇離子去簇后送到質(zhì)譜計中MS放電針噴霧LC第43頁,共82頁，星期六，2024年，5月熱噴霧(100-120

C)，化學電離;適用于弱極性和熱穩(wěn)定化合物分析.第44頁,共82頁，星期六，2024年，5月特點：化學電離，軟電離技術(shù)，產(chǎn)生的碎片很少適用于弱極性、分子量?。?lt;2000Da）和熱穩(wěn)定化合物分析靈敏度高

ESI的補充技術(shù)第45頁,共82頁，星期六，2024年，5月ESIAPCI硬件毛細管有幾千伏高壓放電針

電離液滴中的離子蒸發(fā)類似于化學電離原理屬于液相電離屬于氣相電離應(yīng)用*適合的LC流速為

0.2～2ml/min0.2～0.3ml/min*極性和離子化合物極性較小的化合物*可產(chǎn)生多電荷離子產(chǎn)生單電荷離子第46頁,共82頁，星期六，2024年，5月

LC-MS(四極桿)聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖第47頁,共82頁，星期六，2024年，5月LC-MS(離子阱)聯(lián)用儀器結(jié)構(gòu)示意圖第48頁,共82頁，星期六，2024年，5月醫(yī)藥、臨床：藥物代謝、藥物動力學、雜質(zhì)分析、天然產(chǎn)物分析、疾病診斷生物化學：肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、糖環(huán)境化學：農(nóng)藥和農(nóng)殘分析、有機污染物、土壤/食品/水分析食品科學：香料、添加物、包裝物、蛋白質(zhì)、致癌物化學：有機合成物三、液質(zhì)聯(lián)用的應(yīng)用第49頁,共82頁，星期六，2024年，5月%%MultiView--?1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%%%MultiView--?1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%%%MultiView--?1996,SCIEX,adivisionofMDSHealthGroup.%%Originalconcept:%Dr.RonBonner%Dr.LyleBurton%%Development:%Dr.LyleBurton%YvesLegault%ShengpingMa%%Withthehelpof:%Dr.VictoriaBarclay%ScottChamp%RobMcDermid%.2468101214Time,min200400600800100012001400160018002000220024002600Intensity,cpstanshinoneItanshinoneIIAcryptotanshinonedihydrotanshinoneTICSpectrumofFourDiterpenoidsofRadixSalviaeMiltiorrhizae丹參中四種丹參酮的lc-ms-ms測定第50頁,共82頁，星期六，2024年，5月LC-MS-MSMRMChromatogramsofRadixSalviaeMiltoirrhizaeSample反應(yīng)離子監(jiān)測第51頁,共82頁，星期六，2024年，5月7.4高效液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)LC-NMR第52頁,共82頁，星期六，2024年，5月一、HPLC與NMR的比較及聯(lián)用的困難

HPLCNMR分析對象

有機物樣品狀態(tài)

液態(tài)操作溫度

室溫掃描時間

大體相同操作方式連續(xù)流動間歇靈敏度

g～ngmg溶劑普通氘代溶劑第53頁,共82頁，星期六，2024年，5月二、問題的解決

主要取決于核磁共振技術(shù)的提高和發(fā)展（1）靈敏度儀器方面高頻儀器的使用：NMR的信噪比與磁場強度的平方成正比，800MHz(18.79T)與100MHz(2.35T)儀器相比，信噪比增大約64倍。用新技術(shù)提高信噪比：軟件濾波，消噪技術(shù)第54頁,共82頁，星期六，2024年，5月

操作參數(shù)的影響提高LC柱的負載量內(nèi)徑4.6mm色譜柱，合適的負載量為100g。采用停流技術(shù)增加檢測的有效時間（多次掃描累積）。把射頻線圈直接繞在流通池壁上，減少死體積。（2）溶劑使用氘代溶劑使用脈沖序列等溶劑抑制技術(shù)第55頁,共82頁，星期六，2024年，5月采用WET序列進行溶劑峰抑制的實例乙腈溶劑峰第56頁,共82頁，星期六，2024年，5月三、聯(lián)用方式實驗布局泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測器組成的LC系統(tǒng)，通過一條2-2.5m的特制毛細管連接到NMR液相探頭上，探頭底部有閥控制NMR測定方式。第57頁,共82頁，星期六，2024年，5月第58頁,共82頁，星期六，2024年，5月

液相探頭帶有一個流動腔；射頻發(fā)射線圈垂直固定在流動腔的玻璃管上；接受線圈平行于玻璃管；流動腔不能旋轉(zhuǎn)，NMR測定分辨率較差。第59頁,共82頁，星期六，2024年，5月聯(lián)用模式

連續(xù)流動模式LC的載液帶著試樣組分連續(xù)不斷流入NMR的流動腔，NMR儀器用溶劑峰抑制技術(shù)采集NMR譜圖，得到化學位移－LC保留時間的假二維譜。得到的譜圖分辨率和信噪比差。停流技術(shù)（時間切割譜）當色譜峰的最高點到達流動腔的檢測位置時，關(guān)閉液相探頭底部的進口閥，同時LC的泵停止工作，NMR進行采樣直到獲得滿意的譜圖。第60頁,共82頁，星期六，2024年，5月

峰存儲模式(peakparking)

實際上是一種離線模式。由LC流出的峰存儲在毛細管回路中，然后通過適當?shù)拈y系統(tǒng)依次送入NMR探頭中進行NMR測定，LC分析過程不中斷。體系中有三個閥，12個存儲峰的毛細管回路，整個過程由計算機控制。第61頁,共82頁，星期六，2024年，5月

峰存儲模式第62頁,共82頁，星期六，2024年，5月三種聯(lián)用模式的比較流動模式：靈敏度和信噪比差，適合于測定富核，如1H、19F、31P和富集的13C、15N；對1H最小檢測量（16次累加）為10g（500MHz），30g（300MHz）；停流模式：有較好的靈敏度，可測1H、13C、15N等。最小檢測量1H為1g；峰存儲模式：與停流模式類似。第63頁,共82頁，星期六，2024年，5月應(yīng)用實例耐哌地爾雜質(zhì)的檢測第64頁,共82頁，星期六，2024年，5月7.5色譜-傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用(GC-FTIR)第65頁,共82頁，星期六，2024年，5月1.GC-FTIR聯(lián)用概述（1）GC-IR聯(lián)用的作用MS一般難于區(qū)分同分異構(gòu)體，IR是很好的補充。（2）實現(xiàn)GC-IR的困難

掃描速度、靈敏度、物理狀態(tài)均不匹配

（3）解決方法

FTIR：具有信噪比好、掃描速度快等優(yōu)點，與GC的匹配性大大提高。

物理狀態(tài)：測氣體紅外。第66頁,共82頁，星期六，2024年，5月2.GC-FTIR系統(tǒng)FT－IR光學臺數(shù)據(jù)系統(tǒng)GCMCT檢測器GC－FT系統(tǒng)的示意圖光管第67頁,共82頁，星期六，2024年，5月第68頁,共82頁，星期六，2024年，5月GC-FTIR接口示意圖第69頁,共82頁，星期六，2024年，5月接口--光管用硼硅玻璃制成；兩端裝有KBr鹽窗，紅外干涉光可以通過；內(nèi)壁鍍金，有高的反射率，紅外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高靈敏度；可加熱，保證GC流出物不在此冷凝；適當?shù)娜莘e，以獲得最佳分辨率和靈敏度；尾吹裝置：用以解決毛細管GC柱與傳輸線（i.d.2mm）、光管(1mm)中線速變化的問題。即柱外效應(yīng)的問題第70頁,共82頁，星期六，2024年，5月3.GC-FTIR提供的信息(1)三維實時顯示圖波數(shù)時間吸光度第71頁,共82頁，星期六，2024年，5月(2)化學圖（Chemigram）(官能團色譜圖)指定官能團頻率范圍對時間所作的圖；是一個“色譜圖”，每個峰