1.2基因工程的操作程序公開課一等獎?wù)n件省賽課獲獎?wù)n件

專項一基因工程雙都市第三中學(xué)基因工程的基本操作程序1.獲取目的基因2.基因體現(xiàn)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測和鑒定1.2 基因工程的基本操作程序1）目的基因：重要是指能編碼特定蛋白質(zhì)的構(gòu)造基因，也能夠是某些含有調(diào)控作用的因子。如：蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因 植物的抗?。共《尽⒖辜?xì)菌）基因 種子貯藏蛋白的基因 人的胰島素基因、干擾素基因……1.2.1 獲取目的基因①從基因文庫中提取②人工合成基因：已知氨基酸序列合成基因2）目的基因的提取辦法涉及：基因組文庫＞cDNA文庫生物DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割得到提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到③運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞提供的外源DNA的全部片段分別在各個受體細(xì)胞中大量復(fù)制（即擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再運(yùn)用一定發(fā)辦法將目的基因的DNA片段分離出來。①鳥槍法（散彈射擊法）：生物體中提取出現(xiàn)成的mRNA單鏈DNA雙鏈DNA(cDNA)反轉(zhuǎn)錄合成②反轉(zhuǎn)錄法：蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列構(gòu)造基因的脫氧核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成此辦法合成的目的基因與真實基因同樣嗎？有何差別？只含外顯子和部分已知的非編碼區(qū)因同義密碼子有諸多，因此mRNA有多個可能③人工合成目的基因法：運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因概念體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。特點短時間擴(kuò)增目的基因。原理DNA半保存復(fù)制原理。條件目的基因序列、引物、Taq酶、脫氧核苷酸、溫度、pH等1.2.2 基因體現(xiàn)載體的構(gòu)建（核心）（1）基因體現(xiàn)載體的構(gòu)成

目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因等RNA聚合酶識別、結(jié)合的位點如何才干把這些序列連接在一起？（2）構(gòu)建工具：同種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶目的基因與運(yùn)載體結(jié)合的成果可能有幾個狀況？目的基因與目的基因結(jié)合；運(yùn)載體與運(yùn)載體結(jié)合；目的基因與運(yùn)載體結(jié)合√思考：能夠被篩選出來實質(zhì)：不同來源的基因進(jìn)行重組質(zhì)粒含目的基因的DNA分子限制性內(nèi)切酶一種切口，兩個黏性末端兩個切口，獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種（1）導(dǎo)入植物細(xì)胞（受精卵或體細(xì)胞）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法其T-DNA可將目的基因整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上1.2.3 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞經(jīng)組培，得到

轉(zhuǎn)基因植物基因槍法：

10000個整合細(xì)胞/槍 氣壓300-600米/秒

脫氧核糖核酸隨機(jī)插入，原理不明1987年，周光宇中國的轉(zhuǎn)基因棉花原理不明顯微注射法如何才干懂得含有目的基因的運(yùn)載體與否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞？（2）導(dǎo)入動物細(xì)胞 ？經(jīng)胚胎移植，得到轉(zhuǎn)基因動物（受精卵為主）Ca2+解決，形成感受態(tài)細(xì)胞如何才干懂得含有目的基因的運(yùn)載體與否成功導(dǎo)入受體細(xì)胞？（3）導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞——繁殖快經(jīng)微生物培養(yǎng)，得到工程菌能吸取周邊環(huán)境中的DNA四環(huán)素抗性基因青霉素抗性基因如何通過檢測受體細(xì)胞中運(yùn)載體上標(biāo)記基因的體現(xiàn)，擬定連鎖的目的基因與否導(dǎo)入？對于這個重組質(zhì)粒，該如何檢測它與否被導(dǎo)入受體細(xì)胞？目的基因與標(biāo)記基因連鎖在一起普通質(zhì)粒目的基因（抗蟲基因）標(biāo)記基因（四環(huán)素抗性基因）標(biāo)記基因（青霉素抗性基因）加入四環(huán)素的培養(yǎng)基如何挑選出導(dǎo)入目的基因的受體細(xì)胞？加入氨芐青霉素的培養(yǎng)基菌落中的全部細(xì)菌都含有氨變青霉素抗性基因，也同時含有目的基因受體細(xì)胞攝入重組DNA分子，就意味轉(zhuǎn)基因成功嗎？受體細(xì)胞（1）與否插入染色體1.2.4 目的基因的檢測與鑒定（2）與否轉(zhuǎn)錄（3）與否翻譯（4）與否體現(xiàn)特定性狀分子水平檢測——個體水平檢測1.2.4 目的基因的檢測與鑒定檢測水平步驟檢測內(nèi)容檢測方法結(jié)果顯示第一步第二步第三步1.2.4 目的基因的檢測與鑒定檢測水平步驟檢測內(nèi)容檢測方法結(jié)果顯示分子水平檢測第一步轉(zhuǎn)基因生物染色體DNA上是否插入目的基因分子雜交（DNA與DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交（DNA與RNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否被翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個體水平檢測目的基因控制的性狀是否出現(xiàn)等①目的基因產(chǎn)物與否出現(xiàn)2）檢測目的基因與否體現(xiàn)（如：抗蟲棉與否含有 ）②檢測目的基因控制的性狀與否出現(xiàn) （如：抗蟲棉中與否能檢測到 ）毒蛋白抗蟲性翻譯水平的檢測個體水平的檢測若不能體現(xiàn)，要對目的基因（抗蟲基因）進(jìn)行修飾后，再次拼接、導(dǎo)入。1.提取目的基因2.基因體現(xiàn)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測和體現(xiàn)（重組DNA）生物體外操作各自需要的特殊工具?重組DNA發(fā)生在哪一步？操作在哪里完畢？限制性內(nèi)切酶DNA連接酶借助運(yùn)載體小結(jié)：基因操作的四個基本環(huán)節(jié)同種限制酶1）下列說法對的的是（）A、全部的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C、運(yùn)載體必須含有的條件之一是：含有多個限制酶切點，方便與外源基因連接D、基因控制的性狀都能在后裔體現(xiàn)出來C練習(xí)每種酶含有各自的特異性病毒等目的基因體現(xiàn)后才干體現(xiàn)出性狀2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是（）A、能復(fù)制B、有多個限制酶切點C、含有標(biāo)記基因D、它是環(huán)狀脫氧核糖核酸D練習(xí)3）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是（）

A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內(nèi)切酶可用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶A練習(xí)4）有關(guān)基因工程的敘述對的的是（）A、限制酶只在獲得目的基因時才用B、重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完畢C、質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D、蛋白質(zhì)的構(gòu)造可為合成目的基因提供資料D練習(xí)還用于對質(zhì)粒等運(yùn)載體的剪切對基因的剪切、拼接都在生物體外進(jìn)行含有標(biāo)記基因的質(zhì)粒根據(jù)已知的氨基酸序列可推測基因外顯子的脫氧核苷酸對序列5）基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計施工的。在基因操作的基本環(huán)節(jié)中，不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的環(huán)節(jié)是（）A、人工合成目的基因B、目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D、目的基因的檢測和體現(xiàn)C練習(xí)黏性末端基因的雙鏈的堿基對轉(zhuǎn)錄、翻譯（上海卷39）A、以重組DNA技術(shù)為核心的基因工程正在變化著人類的生活。請回答下列問題。⑴獲得目的基因的辦法普通涉及_______和_________。⑵切割和連接DNA分子所使用的酶分別是______和____。⑶運(yùn)輸目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體普通選用病毒或，后者的性狀呈。⑷由于重組DNA分子成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的頻率，因此在轉(zhuǎn)化后普通需要進(jìn)行操作。⑸將人胰島素基因分別導(dǎo)入大腸桿菌與酵母菌，從兩者中生產(chǎn)的胰島素在功效和序列上是相似的。答案：（1）化學(xué)合成（人工合成）酶切獲取（從染色體DNA分離/從生物細(xì)胞（2）限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶）DNA連接酶（連接酶）（3）質(zhì)粒小型環(huán)狀（雙鏈環(huán)狀、環(huán)狀）（4）低篩選（5）氨基酸（海南卷26）（選修模塊3：當(dāng)代生物科技專項）圖為某種質(zhì)粒體現(xiàn)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamHI的酶切位點，ampR為青霉素抗性基因，tctR為四環(huán)素抗性基因，P為啟動子，T為終止子，ori為復(fù)制原點。已知目的基因的兩端分別有涉及EcoRI、BamHI在內(nèi)的多個酶的酶切位點。據(jù)圖回答：（1）將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒體現(xiàn)載體分別用EcoRI酶切，酶切產(chǎn)物用DNA連接酶進(jìn)行連接后，其中由兩個DNA片段之間連接形成的產(chǎn)物有_____、____、_____三種。若要從這些連接產(chǎn)物中分離出重組質(zhì)粒，需要對這些連接產(chǎn)物進(jìn)行_________。（2）用上述3種連接產(chǎn)物與任何抗藥性的原核宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化實驗。之后將這些宿主細(xì)胞接種到含四環(huán)素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是____________;接種到含青霉素的培養(yǎng)基中，能生長的原核宿主細(xì)胞所含有的連接產(chǎn)物是________。（3）目的基因體現(xiàn)時，RNA聚合酶識別和結(jié)合的位點是____________，其合成的產(chǎn)物是_________。（4）在上述實驗中，了避免目的基因和質(zhì)粒體現(xiàn)載體在酶切后產(chǎn)生的末端發(fā)生任意連接，酶切時應(yīng)選用的酶是____________________。答案：（1）目的基因-載體連接物載體-載體連接物目的基因-目的基因連接物分離純化/篩選（其它合理答案也得分）（2）載體-載體連接物目的基因-載體連接物載體-載體連接物（3）啟動子mRNA（4）EcoRI和BamHI（只答一種酶不給分）病毒注入DNA分子限制性內(nèi)切酶切割入侵的DNA切割限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶對抗外來DNA1）DNA序列自動測序儀：2）PCR技術(shù)：

對提取出來的基因進(jìn)行核苷酸序列分析。

使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增。哪些新技術(shù)能大大簡化基因工程的操作技術(shù)？本實驗所使用的載體質(zhì)粒DNA為pBS,轉(zhuǎn)化受體菌為E.coliDH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr和lacZ基因,故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的辦法。

因pBS帶有Ampr基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pBSDNA的轉(zhuǎn)化子才干在含有Amp的LB平板上存活下來;而只帶有本身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。

pBS上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一種多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功效。E.coliDH5α菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的狀況下,pBS和DH5α編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在pBS和DH5α融為一體時可形成含有酶活性的蛋白質(zhì)。這種lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的β-半乳糖苷酸陰性突變體之間實現(xiàn)互補(bǔ)的現(xiàn)象叫α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌較易識別，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。當(dāng)外源片段插入到pBS質(zhì)粒的多克隆位點上后會造成讀碼框架變化,體現(xiàn)蛋白失活,產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力,因此在同樣條件下含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上，α-互補(bǔ)產(chǎn)生的Lac+細(xì)菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麥康凱培養(yǎng)基中的乳糖，產(chǎn)生乳酸，使pH下降，因而產(chǎn)生紅色菌落，而當(dāng)外源片段插入后，失去α-互補(bǔ)能力，因而不產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，無法分解培養(yǎng)基中的乳糖，菌落呈白色。由此可將重組質(zhì)粒與本身環(huán)化的載體DNA分開。此為α-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選。重組質(zhì)粒的篩選抗生素：由真菌產(chǎn)生，能克制或殺滅細(xì)菌的一類物質(zhì)。慣用的抗生素涉及：青霉素、四環(huán)素、土霉素等。絕大多數(shù)細(xì)菌不能在有抗生素的環(huán)境中生活，但也有少數(shù)突變體，其質(zhì)粒上具某種抗生素抗性基因，則含這樣質(zhì)粒的細(xì)菌，能體現(xiàn)出對對應(yīng)抗生素的抗性。如：質(zhì)粒上帶有青霉素抗性基因，則該細(xì)