GB∕ T 40254-2021 輪枝菌屬實(shí)時(shí)熒光PCR檢疫鑒定方法（正式版）

ICSCCS65.020.01輪枝菌屬實(shí)時(shí)熒光PCR檢疫鑒定方法國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)IGB/T40254—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC271)提出并歸口。1GB/T40254—2021輪枝菌屬實(shí)時(shí)熒光PCR檢疫鑒定方法1范圍本文件描述了植物病原真菌輪枝菌屬實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢疫鑒定方法。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文SN/T2589植物病原真菌檢測(cè)規(guī)范本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4基本信息輪枝菌屬隸屬于真菌界(Fungi),子囊菌門(mén)(Ascomycota),盤(pán)菌亞門(mén)(Pezizomycotina),糞殼菌綱(Sordariomycetes)中的小不整球殼科(Plectosphaerellaceae)。5鑒定原理根據(jù)輪枝菌屬病菌的DNA序列特征及實(shí)時(shí)熒光PCR原理，應(yīng)用所設(shè)計(jì)引物或探針對(duì)輪枝菌屬病菌進(jìn)行檢測(cè)鑒定。2GB/T40254—2021次氯酸鈉、液氮、超純水、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)提取液(2%CTAB,1.4mol/LNaCl,6.3培養(yǎng)基在濾液中加入葡萄糖和瓊脂粉各20g,加蒸餾水定容至1L。配成溶液后121℃下滅菌20min。采用基因組提取試劑盒制備DNA,或采用改良的CTAB提取法，CTAB提取法應(yīng)符合附錄A。7.3DNA純度與濃度的測(cè)定DNA純度=OD?so/OD?s0用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的DNA溶液的OD?bo/OD?so比值應(yīng)為1.7～1.9。7.4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法應(yīng)符合附錄B。8結(jié)果判定以疑似分離物或樣品的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果作為鑒定依據(jù)。疑似分離物：陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照正常，出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線判定為陽(yáng)性；無(wú)典型擴(kuò)增曲線判定為陰性。增加DNA用量2倍～10倍再次測(cè)試，出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35,判定為陽(yáng)性；其余情況判定為陰性。9樣品保存與復(fù)核保存植物樣品應(yīng)置于2℃~8℃冰箱妥善保存，對(duì)檢出輪枝菌屬病菌的樣品應(yīng)至少保存6個(gè)月，以GB/T40254—2021分離到的輪枝菌屬病菌應(yīng)接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中妥善保存。要有檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果照片。9.2復(fù)核由指定的單位或人員負(fù)責(zé)，主要考察試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)記錄及實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果等資料的完整性34(規(guī)范性)A.4加入1/2體積(300pL)的Tris飽和酚及1/2體積(300μL)的三氯甲烷：異戊醇(24:1),顛倒混A.512000r/min離心10min,取上清液至另一離心管中。A.7加入等體積三氯甲烷：異戊醇(24:1),輕輕顛倒混勻。A.9向上清液中加入等體積異丙醇，輕輕顛倒混合均勻后于4℃或-20℃冰箱沉淀1h。A.12加50pL無(wú)菌水或TE緩沖液(10mmol/LTris·HCl,1mol/LEDTApH8.0)溶解沉淀，注：DNA提取亦可采用商品化DNA提取試劑盒。5GB/T40254—2021(規(guī)范性)實(shí)時(shí)熒光PCR方法正向引物VF:5'-CTGTCCGAGCGTCGTTTC反向引物VR:5'-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3';探針VP:5'-FAM-TGGCCCGGTGTTGG-MGB-3',探針5'端含有FAM報(bào)告熒光染料，3'端含有不發(fā)熒光的淬滅基團(tuán)并具有MGB分子。6[1]段維軍，郭立新，顧建鋒，等.基于COI基因分析的植物病原性輪枝菌條形碼評(píng)價(jià)[J].植物檢疫，2013,27(6):41-45.26(4):30-34.[3]段維軍，郭立新，張祥林，等.檢疫性輪枝菌及其近似種的鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2013,43(3):274-285.2013,39(4):72-77.[5]BarbaraDJ,ClewesE.Plantpathogen[J].MolecularPlantPathology,2003,4:297-305.[6]CameleI,MarconeC,CapticilliumwiltofSolanumaethiopicuminItaly[J].PlantPathology,2006,55(4):581-581.[7]CollinsA,OkoliCAN,MortonA,etal.IsolatesofVerticilliumdahliaepathogenictocru-cifersareofatleastthreedistinctmoleculartypes[J].Phytopathology,20[9]InderbitzinP,DavisRM,BostockRM,etal.TheascomyceteVerticilliumlongisporumis[10]GiraldoA,CrousPW.InsidePlectosphaerellaceae[J].StudiesinMyc227-286.[11]KirkPM,CannonPF,MinterDW,etal.Dictionaryofthefungi[M].Wallingford:CA-BI,2008:724.[12]KlostermanSJ,AtallahZK,ValladGE,etal.Diversity,pathogenicity,andmanagemofVerticilliumSpecies[J].AnnualReviewofPhytopathology,2009,47:39-62.[13]NeesvonE,GottfriedC.DasSystemderPilzeundSchwny:StahelschenBuchhandlung,1817.[14]PramateftakiPV,AntoniouPP,TypasMA.ThecompleteDNAsequenceofthenuclearribosomalRNAgenecomplexofVerticilliumdahliae:intraspecificheterogeneitywithintheintergenicspacerregion[J].Fungalgeneticsandbiology,2000,29(2):19-27.[15]QinQM,ValladGE,WuBM,etal.PhylogeneticanalysesofphytopathogenicisolatesofVerticilliumspp.[J].Phytopathology2006,96(6):582-592.forVerticilliumnigrescens,andMusicillium,anewgenusforV.theobromae[J].NovaHedwigia,2007,85(