GB∕ T 40256-2021 牡蠣馬爾太蟲病診斷規(guī)程 顯微鏡檢查組織法（正式版）

ICSCCS65.020.30GB/T40256—2021牡蠣馬爾太蟲病診斷規(guī)程顯微鏡檢查組織法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T40256—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國農業(yè)農村部提出。本文件由全國水產標準化技術委員會(SAC/TC156)歸口。本文件起草單位：中國水產科學研究院黃海水產研究所、全國水產技術推廣總站。1GB/T40256—2021牡蠣馬爾太蟲病診斷規(guī)程顯微鏡檢查組織法1范圍本文件規(guī)定了牡蠣馬爾太蟲病診斷規(guī)程中普遍適用的顯微鏡檢查組織法的要求，針對主要病原折本文件適用于牡蠣感染折光馬爾太蟲的普查和初步診斷，以及牡蠣感染折光馬爾太蟲的流行病學調查及診斷。其他貝類也可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文SC/T7205.1—2007牡蠣包納米蟲病診斷規(guī)程第1部分：組織印片的細胞學診斷法SC/T7207.3—2007牡蠣馬爾太蟲病診斷規(guī)程第3部分：透射電鏡診斷法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4縮略語DAFA:戴維森氏乙醇-福爾馬林-乙酸固定液(davidson'salcohol-formalin-aceticacidfixative)5試劑或材料5.1蘇木素。5.2碘酸鈉。5.3鉀明礬。5.5水合三氯乙醛。5.6伊紅Y(水溶性)。5.7焰紅B(水溶性)。5.8石蠟(熔點52℃~54℃):切片級。5.10甲醇。25.1395%乙醇。5.14甲醛(37%)。牡蠣、扇貝和蛤等易感雙殼貝類。采樣數(shù)量、方法和保存運輸應符合SC/T7205.1—2007附錄B的要求。海水溫度高于17℃時為采樣的最佳時期。8試驗步驟3GB/T40256—20218.1.2.3室溫晾干。滴加2滴中性樹膠，封片。用顯微鏡低倍鏡搜索適合觀察的視野，放大400或1000倍觀察孢子和孢囊特征。馬爾太蟲胞體脫水后的組織塊依次浸入盛有無水乙醇：二甲苯(1:1)混合液和二甲苯溶液的燒杯中，流程如下：在恒溫箱(溫度調節(jié)至高于石蠟熔點)中熔蠟，將熔蠟倒入包埋盒與包埋模具(也可用折疊紙盒),用用蠟鏟或刀片將包埋塊四周修平，使上下兩面修成平行面，保留組織周圍附著寬2mm～3mm的將切片平放于展片機或水浴鍋水面上，待伸展平整后，用載玻片撈出，置于烘片機上或烘箱內，45℃烘片2h。將切片放在玻片架上，依次浸入盛有不同溶液的燒杯中，流程如下：二甲苯(5min)→二甲苯4GB/T40256—2021(5min)→無水乙醇(2min)→無水乙醇(2min)→95%(1min20s)→95%乙醇(2min)→無水乙醇(2min)→無水乙醇(2min)→二甲苯(2min30s)→二甲滴加2滴中性樹膠，封片。用顯微鏡低倍鏡搜索不同的視野，觀察組織壞死和血細胞浸潤情況；放大400倍或1000倍觀察孢子和孢囊特征(參見附錄B)。9結果判定9.1.1在折光馬爾太蟲病流行區(qū)9.2.1在折光馬爾太蟲病流行區(qū)域的易感宿主中(參見附錄C),在胃、腸和消化道的上皮細胞觀察到發(fā)育早期(大小4μm～8μm)的蟲體；同時在消化道的上皮細胞中觀察到孢子形成期(大小20μm~疑似折光馬爾太蟲感染。9.3疑似折光馬爾太蟲感染的確診在其他種類宿主中，或者在折光馬爾太蟲病流行區(qū)域以外(參見附錄C),組織印片檢測法或組織病理檢測法檢測結果為陽性，PCR檢測結果陽性且PCR產物序列與折光馬爾太蟲一致，同時5GB/T40256—2021A.1DAFA固定液95%乙醇甲醛(37%)冰醋酸過濾海水330mL220mL335mLA.2邁爾-班尼特蘇木精染色液水(50℃~60℃)蘇木素碘酸鈉鉀明礬檸檬酸水合三氯乙醛A.3伊紅-焰紅染色液伊紅Y(水溶性)焰紅B(水溶性)95%乙醇冰醋酸780mL4mL95%乙醇加水定容至850mL950mL95%乙醇加水定容至800mL950mL6GB/T40256—2021A.675%乙醇95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至95%乙醇加水定容至750mL950mL700mL950mL500mL950mL7GB/T40256—2021(資料性)顯微鏡檢查組織法觀察折光馬爾太蟲形態(tài)圖B.1組織印片檢測法組織印片檢測法示例見圖B.1。B.2組織病理檢測法組織病理檢測法示例見圖B.2。84.產孢體不斷發(fā)育成熟并增殖至8個～16個GB/T4.產孢體不斷發(fā)育成熟并增殖至8個～16個(資料性)牡蠣馬爾太蟲病也稱Aber病(由Marteiliarefringens引起)或QX病(由悉尼馬爾太蟲，M.syd-neyi引起),該病由絲足蟲門(Cercozoa)無孔目(Paramyxida)馬爾太蟲屬的原生動物感染雙殼貝類引起，病變主要發(fā)生在雙殼貝類的消化系統(tǒng)，可引起生理功能紊亂和死亡。馬爾太RRS1.馬爾太蟲原孢體(S)通過消化道或鰓侵染易感宿主MSpNS2.原孢體內發(fā)育出產孢體(SP)NSP5.產孢體內發(fā)育出3.產孢體經二分裂增殖7.成熟孢子(MSp)被釋放O6.原孢了不斷發(fā)育成熟，NSNS:原孢體核(nucleusofsporangiosoruNSP:產孢體核(nucleusofsporangialprimordium);SpP:原孢子(sporeprimordium)。圖C.1馬爾太蟲不同發(fā)育階段及其在牡蠣體內分布模式圖該病全年都可能會發(fā)生，給貝類養(yǎng)殖業(yè)造成較大經濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)水生動物衛(wèi)生法典(2016版)將引起該病發(fā)生的主要病原——折光馬爾太蟲(M.refringens)列為需通報的貝類動marginatus)和黑貽貝(Xenostrobussecuris)。其他馬爾太蟲(Marteiliaspp.)還可感染智利牡蠣(O.chilensis)、阿根廷牡蠣(O.puelchana)和密鱗牡蠣(O.denselamellosa),但感染這些牡蠣的馬爾9GB/T40256—2021仔(R.philippinarum)和美洲牡蠣(Crassostreavirginica)等雙殼貝類中，曾觀察到包括成熟期在內不同發(fā)育階段的類馬爾太蟲寄生蟲。此外，一種橈足類小型節(jié)肢動物(Paracartiagrani)也顯示出對折光馬爾太蟲的易感性，且被認為在該寄生蟲的水平傳播過程中起作用。目前已知的折光馬爾太蟲地理分布主要集中在地中海和北大西洋沿岸，包括：阿爾巴尼亞、克羅地馬爾太蟲的感染率變化很大，在歐洲牡蠣群體中可高達98%。牡蠣感染該寄生蟲后，在夏季和秋季溫度較高的季節(jié)，死亡率較高，一般在50%～90%,死亡發(fā)生和寄生蟲孢子形成過程密切相關。貽貝對寄生蟲的敏感性比牡蠣低，死亡率達40%。有研究報道初次接觸該病原的貽貝，在疫區(qū)養(yǎng)殖6個月后，死亡率達100%。目前我國僅有一例有關折光馬爾太蟲感染養(yǎng)殖貝類的報道，且