清洗消毒器 第5部分：清潔效果的性能要求和測試方法 征求意見稿

1GB/T35267.5—XXXX清洗消毒器第5部分清潔效果的性能要求和測試方法本文件規(guī)定了對可重復使用醫(yī)療器械進行清洗的清洗消毒器及其附件的清潔效果進行測試的程序和試驗方法。注2：本文件不適用于可重復使用醫(yī)療器械2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。ISO/DIS15883-1:-1，清洗消毒器第1部分：一般要求、術語和定義及試驗ISO10993-1醫(yī)療器械的生物評價第1部分：風險管理過程中的評價和試驗（Biologicalevaluationofmedicaldevices--Part1:Evaluationandtestingwithinariskmanagementprocess）ISO10993-5醫(yī)療器械的生物評價第5部分：體外細胞毒性試驗（BiologicalEvaluationOfMedicalDevices.Part5:TestsForInVitroCytotoxicity）3術語和定義ISO15883-1界定的以及下列術語和定義適用于本文件。ISO和IEC在以下地址維護用于標準化的術語數(shù)據(jù)庫：——ISO在線瀏覽平臺：/obp——IEC電百科：/3.13.2行動值需要立即干預的監(jiān)測值。[來源：ISO11139:2018,3.5]3.33.4預警值特定條件下早期預警的監(jiān)測值。[來源：ISO11139:2018,3.11－修訂版－增加注1]3.53.6分析物用于化學分析的化學物質。[來源：ISO11139:2018,3.1.2]3.73.8清潔2GB/T35267.5—XXXX無可見污染物并且分析物在特定水平以下。[來源：ISO11139:2018,3.45]3.93.10臨床應用醫(yī)療產(chǎn)品在患者醫(yī)療過程的使用。[來源：ISO11139:2018,3.49，修訂版－增加注1]3.113.12負載在一個操作周期內(nèi)要一起處理的產(chǎn)品、設備或材料。[來源：ISO11139:2018,3,155]3.133.14產(chǎn)品過程的結果。[來源：ISO11139:2018,3.217]3.153.16漂洗通過水置換和稀釋去除過程殘留物。[來源：ISO11139:2018,3.237]3.173.18模擬使用按預期用途模擬醫(yī)療器械的使用。3.193.20污染物器械或其表面在使用或模擬使用后的自然或人為污染物。[來源：ISO11139:2018,3.257]3.213.22替代產(chǎn)品在過程模擬中設計用來代表產(chǎn)品，并且與實際產(chǎn)品具有可比性的產(chǎn)品。[來源：ISO11139:2018,3.291]3.233.24試驗污染物設計用于替代在使用后的設備上發(fā)現(xiàn)的污染物或殘留的污染物的配方。[來源：ISO11139:2018,3.300]3.253.26清洗通過水流的方式去除表面的污染物。[來源：ISO11139:2018,3,121]4性能要求4.1概述3GB/T35267.5—XXXX4.1.1除4.1.3-4.1.5規(guī)定的要求外，還應符合YY/T0734后續(xù)部分對清洗消毒器清潔性能的要求。4.1.2除4.1.4和4.1.5規(guī)定的試驗外，還應符合YY/T0734后續(xù)部分對清洗消毒器清潔試驗的要求。4.1.3對確認清洗消毒器符合本標準要求的清潔過程條件，如階段、溫度、壓力、流量、化學劑、水質和水量，應按照ISO/DIS15883-1:-，4.1.12和8.2b）進行定義。注1：水質參照ISO/DIS15883-1:-，5.23和GB/4.1.4應在規(guī)定的清潔階段進行清潔效果試驗，包括在適當情況下進行沖洗、漂洗等（見5.2）。清潔階段應按照ISO/DIS15883-1:2020,4.1規(guī)定，應證實并記錄整個清潔階段不會干擾分析物的檢測。在清潔效果測試中，清洗消毒器應在沒有任何消毒或干燥階段的情況下操作，且不應影響測試過程的有效性和安全性。4.1.5清潔效果試驗應在清洗消毒器及其特定負載對應的附件中進行，分為兩個階段：a)在模擬使用條件下，用確定的試驗污染物，包括分析物以及典型性負載（見4.4.1）進行的型式試驗；b)在臨床使用的最具挑戰(zhàn)污染負載的條件下進行性能鑒定試驗（見4.4.1或若合適（5.4.2使用替代產(chǎn)品進行性能鑒定試驗。4.2試驗污染物注意事項4.2.1選擇試驗污染物和涂染方法的理由應得到證明并形成文件。試驗污染物配方的選擇或開發(fā)可以基于文獻和臨床實踐（見附錄A及其參考文獻）中醫(yī)療器械/產(chǎn)品的使用的相關性論證。4.2.2蛋白質試驗的污染物應符合B.2規(guī)定的性能準則。4.2.3試驗污染物的選擇，其使用方法和處理（如干燥）應模擬負載最具挑戰(zhàn)的臨床使用條件。a)試驗污染物成分應包括在產(chǎn)品預期使用過程中，可能遇到一定量的代表性污染物的分析物，數(shù)量符合4.2.1規(guī)定，并且若適用，還應包括產(chǎn)品臨床使用中預期被清潔的任何相關材料（s）（如造影劑、潤滑油等）；b)試驗污染物的使用方法應模擬產(chǎn)品的使用條件，例如，對清潔造成更大挑戰(zhàn)的燒灼或加熱，和/或可促進材料滲透到產(chǎn)品的各個部分的壓力梯度。產(chǎn)品中最難清潔的部件應被污染（見4.3）；c)將試驗污染物涂在產(chǎn)品或樣品上后，應考慮產(chǎn)品從使用地點到處理地點的運輸和停留時間條件（如溫度、時間、濕度），以及任何預處理（見）；d)在驗證方法中，應對污染物的組成進行表征，并識別和考慮最具挑戰(zhàn)的污染物元素（如脂類、黏合劑、不溶性蛋白質等），以確保驗證試驗可證明對污染物的有效去除。4.2.4試驗污染物的提取、回收率方法和分析物檢測的方法應得到驗證和規(guī)定。回收的驗證應證明有能力將分析物降低到行動值以下。除非另有說明（見），回收率應大于70%。4.3負載注意事項4.3.1負載類型，包括典型及最具挑戰(zhàn)臨床使用條件的各類代表性的產(chǎn)品，應加以規(guī)定并證明恰當。這些負載應被用于型式試驗和性能鑒定試驗的清潔效果和過程殘留物測試也見ISO/DIS15883-1:-，8.1b）和GB/T35267.4。負載應適合所測試的清洗消毒器類型。注1：在型式試驗和性能鑒定試驗中，若適用，當證明替代品可以作為前述產(chǎn)品的代表去用于某些試驗時，負載就4GB/T35267.5—XXXX4.3.2應考慮產(chǎn)品類型和患者接觸區(qū)域的任何適用物理特征，包括但不限于：——鉸鏈和連接處；——粗糙不規(guī)則表面；——材料組成，包括孔隙；——接頭和盲端；——內(nèi)部可移動部分（例如，線纜）。這些設計特點具有更大的污染物聚集和滯留風險，在整個產(chǎn)品的清潔效果和清潔終點的評估和風險評估中應特別加以考慮。注1：其他的醫(yī)療器械設計及清潔的細節(jié)見4.3.3任何在其說明書中規(guī)定的必要的預處理，例如，人工預清潔或拆卸，應在試驗程序中體現(xiàn)。4.4清結效果試驗方法4.4.1概述清潔效果應通過目視檢查（見4.4.2）和蛋白質定量檢測（見，注釋和附件B）來確定。對于侵入性醫(yī)療器械，在型式試驗中，至少應使用另外一種有效的定量分析測試方法來測量除蛋白質外的其他分析物。非侵入性醫(yī)療器械只需要目視檢查。注1：一些非侵入性醫(yī)療器械可能代表較高的風險水平，例如嬰兒配方奶粉4.4.2目視檢查在清潔階段結束后，目視檢查應證明所有可觀察到的負載表面都沒有可見的污染物。本要求不適用于由于產(chǎn)品的結構而無法對產(chǎn)品表面進行目視檢查的情況。充分的目視檢查包括：——明確地檢查說明；——充足的照明；——檢查輔助設備，如適用（如發(fā)光放大鏡——觀察距離。更多目視檢查的信息參見EN13018和ASTME3106。4.4.3分析方法概述分析物的接受標準是根據(jù)報警限值和行動值規(guī)定的。蛋白質和其他分析物的報警限值和行動值已在和中規(guī)定。它們的行動值是測試期間可接受的清潔效果的最大標準，但目標值是作為報警限值給出的。當報警限值和行動值都規(guī)定時，如果檢測到的分析行動值在兩個水平之間，則應進行調(diào)查，但應認為可以通過清潔要求。5GB/T35267.5—XXXX為了符合ISO/DIS15883-1:2020第4.2和6.10條的要求，應使用行動值。注1：本文檔中分析物值以單位面積（cm）表示。一些區(qū)域和國家指南規(guī)定了每個醫(yī)療器械或每個醫(yī)療器械側面的最大分析行動值。不可能直接將每平方厘米表示的數(shù)值與每個醫(yī)療器械或每個醫(yī)療器械側面表示的數(shù)值進行比較，除非已知醫(yī)療器械或醫(yī)療器械側面的表面積蛋白質測定標準蛋白質測定標準為：——報警限值≥3μg/cm2；——行動值≥6.4μg/cm2。對于每個樣本，清潔后的產(chǎn)品上蛋白質最大的可接受水平應比行動值低。（見參考注1：蛋白質檢測方法可包括附錄C中規(guī)定的方法其他分析物的實驗方法若使用其他分析物，清潔后的產(chǎn)品上，這些分析物的可接受水平，包括：a)總有機碳（TOC）1)報警限值≥6μg/cm2（見參考【85】）2)行動值≥12μg/cm2（見參考【67】）注1：TOC是指有機物中含碳總量，以非可b)碳水化合物1)報警限值≥0.9μg/cm22)行動值≥1.8μg/cm2（見參考【34】，【40】和【53】）注2：Dubois等人[53]的檢測單糖的方法有所不同，因此碳水化合物因組成不同，測試水平也是有所不同。報警限c)血紅蛋白1)報警限值≥1.0μg/cm2（見參考【73】）2)行動值≥2.2μg/cm2（見參考【34】、【35】、【42】和【51】）注3：血紅蛋白檢測方法可包括附件D中規(guī)定的方法d)三磷酸腺苷（ATP）1)報警限值≥10fmol，ATP/cm2（見參考【37】和【89】）2)行動值≥22fmol，ATP/cm2（見參考【36】、【37】和【43】）注4：相對光單位（RLU）到飛摩爾的轉換可以從特定的ATP監(jiān)1)報警限值≥2.2EU/器械（參見【12】和【33】）2)行動值≥20EU/器械（參見【12】【32】和【33】）注6：對于直接或間接接觸心血管系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)的植入物和產(chǎn)品，推薦內(nèi)毒4.4.4過程殘留清洗階段，包括任何清洗后的漂洗，不得在負載上留下任何可能在后續(xù)使用中有害或損害后續(xù)過程階段的過程殘留物（見5.5）。6GB/T35267.5—XXXX5試驗方法5.1清潔試驗方法驗證5.1.1概述型式試驗（見5.3）和性能鑒定試驗（見5.4）所采用的清潔試驗方法應進行驗證。注1：清潔試驗方法包括試驗污染物、污染方法、回5.1.2負載污染方法負載污染方法，包括其應用和任何處理，應模擬清洗消毒器清潔階段的等效挑戰(zhàn)，就像最具挑戰(zhàn)的臨床污染負載所呈現(xiàn)的一樣，包括指定的負載載體（見4.2.3和5.2.1）。負載污染方法應規(guī)定所有條件，包括對污染產(chǎn)品進行一定時間、溫度和濕度（即停留時間）的干燥，這將代表在清洗消毒器中待處理的產(chǎn)品的使用條件。注1：條件制定示例參見K?hnlein等人25.1.3檢測方法對于用于清潔驗證研究的每種分析物和每種方法，應確定直接或提取的檢測限值。應確定試驗污染物的回收率。應計算出相應的校正因子并應用于結果（見4.2.4）。注1：ISO11737-1[2]給出了確定生物負載量回收率的方法和應用生物負載量校正因子的例子。這些原則和一般應進行陽性和陰性對照，以識別過程條件對檢測方法的干擾（見5.2.2）。5.1.4分析物測定方法應對用于清潔驗證研究的每種分析物的選擇方法進行驗證。5.2清洗消毒器要求5.2.1清潔試驗應在規(guī)定的清洗消毒器負載上進行。最具挑戰(zhàn)的負載應包括代表性的產(chǎn)品和指定的負載架。除非另有說明，載有代表性產(chǎn)品的每種負載架都應單獨進行測試。5.2.2應規(guī)定清洗消毒器清洗階段的參數(shù)和清洗過程中的化學劑。型式試驗應在規(guī)定的最具挑戰(zhàn)參數(shù)（如溫度、時間、過程化學劑濃度、供給、壓力和流速）下進行。5.2.3清潔驗證應在沒有任何消毒或干燥階段的情況下進行測試（見ISO/DIS15883-1:-，6.10）。5.3清潔模式試驗基本原則除本文件要求外，ISO15883其他適用部分的相關清潔試驗要求也應適用。5.3.2試劑/材料7GB/T35267.5—XXXX應使用凝血或符合4.2標準的試驗污染物。5.3.3程序試驗負載、清洗消毒器腔壁和負載架應使用試驗污染物進行污染（見4.2.1和4.3）。污染表面應按中所述進行處理。清潔試驗階段應在清洗消毒器定義的最具挑戰(zhàn)處理條件下進行，重復三次（見5.2.2）。5.3.4可接受準則清潔效果應符合4.4.2規(guī)定的無可見污染物，并符合4.4.3規(guī)定的試驗負載的行動值。若適用，清潔效果應符合4.4.3規(guī)定的試驗負載的報警限值。對于腔壁和負載架來說，目視檢查可滿足要求。5.4清潔性能鑒定試驗5.4.1基本原則測試應符合ISO/DIS15883-1:-，6.10.3和ISO15883的適用部分。5.4.2試劑/材料清洗消毒器應使用經(jīng)臨床污染的實際負載進行測試。這些負載應該是清洗消毒器要處理的具有代表性的負載，包括已知的難以清潔的產(chǎn)品。對于特定的產(chǎn)品，可以使用模擬臨床使用條件的替代產(chǎn)品來進行清潔效果驗證。替代產(chǎn)品和試驗污染物應判斷（見5.1和4.2）是否適用于臨床使用條件。注1：替代產(chǎn)品可以用來模擬在不破壞情況下難以取樣或取樣方法提取效5.4.3程序污染物表面在清潔之前應保持在最具挑戰(zhàn)的代表性停留條件（如時間、溫度和濕度）下（見）。清潔試驗應在可類比負載上進行，重復三次（見5.2）。5.4.4可接受準則清潔效果應符合4.4.2規(guī)定的無可見污染物，并符合4.4.3規(guī)定的試驗負載的行動值。若適用，清潔效果應符合4.4.3試驗負載的報警限值。對于腔壁和負載架，目測檢查即可（見4.4.2）。5.5過程殘留5.5.1概述作為型式測試的一部分，在風險分析和細胞毒性測試要求中應規(guī)定可接受的過程殘留量。性能鑒定試驗要求對產(chǎn)品進行過程殘留的定期取樣（見ISO/DIS15883-1:—，表A.1）。如果過程或過程化學劑發(fā)生變化，應重復進行型式試驗和性能鑒定試驗。所有準備在清洗消毒器中使用的過程化學劑都應符合這一要求。8GB/T35267.5—XXXX5.5.2風險分析風險分析應形成文件，證明過程殘留風險已降低到有害水平以下。風險分析應考慮ISO10993-1的要求。5.5.3細胞毒性包括清洗消毒器及其負載在內(nèi)的醫(yī)療器械應進行細胞毒性測試，以證明其不存在潛在的有害殘留物，除非根據(jù)風險評估另有證明（見ISO/DIS15883-1:-，4.4和4.6）。任何此類風險評估都應包括驗證過程中使用的過程化學劑的細胞毒性。參見[45]和[47]。根據(jù)ISO10993-1定義的風險分析，可能需要額外的生物相容性測試。5.5.4取樣方法應規(guī)定從負載中提取過程殘留物的取樣方法和檢測樣品中過程殘留物的分析方法。這些方法應能夠確定過程化學劑低于規(guī)定的潛在有害濃度（即可接受最大濃度見ISO/DIS15883-1:-，6.10.4）。5.5.5可接受準則應基于風險分析或細胞毒性試驗結果規(guī)定行動值和報警限值。9GB/T35267.5—XXXX附錄B（資料性）附錄C試驗污染物示例C.1概述表A.1提供了可用于測試清潔效果的試驗污染物的簡化示例，以滿足4.2的要求。沒有單一的試驗污染物可被確定為用于所有臨床實踐的代表。表A.1試驗污染物制備方法的示例——0.1ML肝素（10IU）/100mL羊血。4℃~8℃GB/T35267.5—XXXX將組分A和B溶解在相應的溶劑A和B中，室溫（20~物——牛白蛋白：0.5g——（可選）牛膽汁：20g——碳酸氫鈉：2gGB/T35267.5—XXXX每100mL羊血注入0.1mL肝素。4℃~8℃保存?zhèn)銰B/T35267.5—XXXX注1：使用國家法規(guī)允許的含有特定動物來源注2：表A.1中提供的試驗污染物及其制備方法的詳細資料可以在-2209,。ATCC編號是該參考培養(yǎng)標本提供的GB/T35267.5—XXXX附錄E（規(guī)范性）附錄F基于蛋白質污染物的性能評價F.1原則F.1.1試驗背景該測試方法基于本文件的實驗室內(nèi)試驗方案獲得的測試結果。該測試方案主要研究了在規(guī)定的溫度和暴露時間條件下，規(guī)定測試污染物的溶解情況。在模擬不銹鋼平面的標準化測試件（STP）上涂上新鮮凝結的羊血作為測試污染物。將涂抹測試污染物的STP浸入化學成分確定的清洗劑配方中，以評估清潔效果。通過確定的提取蛋白質的測定方法測定清潔度。F.1.2試驗方案本附錄規(guī)定了使用已定義的試驗方法評估蛋白質污染物的試驗方案。應根據(jù)臨床相關性（見4.2）選擇用于符合附錄B的試驗污染物，并且還應滿足B.2中規(guī)定的驗收標準。所選擇的試驗污染物應含有最低量的蛋白質，而與其他任何成分無關，以符合本附錄的評估和一致注1：測試污染物中初始蛋白質不足不利于協(xié)議執(zhí)行的預期順序如下：a)溶液和試劑的制備；b)通過清洗，涂污染物，調(diào)節(jié)，切割和稱重來制備STPs；c)控制溶液的紫外可見光譜（UV-Vis）鄰苯二甲醛（OPA）法；d)牛血清白蛋白（BSA）標準溶液的制備和校準曲線的建立；e)用于陰性對照STPs的UV-VisOPA方法；f)用于陽性對照STPs的UV-VisOPA方法；g)通過浸泡、萃取、洗脫和UV-VisOPA分析對處理過的STPs進行測試；h)最后清潔所有已處理的STPs。F.2驗收標準當按照本附錄的要求進行測試時，所選的測試污染物（見4.2.2）應符合表B.1規(guī)定的標準。蛋白質的剩余百分比使用公式（B.3）計算，見B.11.3。表B.1經(jīng)測試的STPs的驗收標準被測試的STPs上殘留的污染物剩余蛋白質應為12%且≥2%GB/T35267.5—XXXX被測試的STPs上殘留的污染物F.3STP準備F.3.1概述B.3.1.1和B.3.1.2中規(guī)定了STP的材料和尺寸以及試驗所需的STPs數(shù)量。F.3.1.1所需STPs數(shù)量測試總共需要12個STPs。這包括：a)8個帶涂層的STPs-在純水中進行兩個測試，兩個溫度和兩個時間點，每個測試條件重復兩次；b)2個帶涂層的STPs-陽性對照測試；c)2個無涂層的STPs-陰性對照測試。F.3.1.2材料和尺寸STPs由厚度為0.127mm的退火316L不銹鋼箔制成。最終尺寸為50mm×50mm。F.3.2不銹鋼箔制備不銹鋼箔條應切割成長（220~250）mm×寬200mm，用5號邁耶棒（見表B.2）清潔并涂上試驗污染物，然后干燥。然后將不銹鋼箔從箔的中心切成50mm×50mm的STPs（每邊留有25mm的余量/用于處理用于試驗，然后進行處理。STPs只能使用一次，并且測試系列所需的所有STPs應同時準備。F.3.2.1不銹鋼箔表面處理F.在用測試污染物涂覆之前，應清洗長（220~250）mm×寬200mm的不銹鋼箔，并確認不含蛋白質。F.為便于不銹鋼箔的背面識別，清洗前需要使用劃線器將不銹鋼箔背面劃線分割為50mmx50mm的標準測試方格（STPs）并編號，如圖B.1所示。圖B.1不銹鋼箔裁至大約250mm×200mm，刻在一面劃線識別F.3.2.2不銹鋼箔的清洗過程GB/T35267.5—XXXX劃線的不銹鋼箔和所有直接相關的設備應按以下方法清洗。表B.2所示為過程所需設備、表B.3所示為過程所需化學品。具有相似參數(shù)的設備和化學品可以代替表B.2和表B.3中所列的設備或藥品，但是所用的不銹鋼應與表B.2中規(guī)定的相同。表B.2設備———Faithfull工具，StockNDartford,KentDA26QE,長度（230~270）mm— Litlington,Royston,Hwww.rubbersuckers.co.http://suctioncupsu用于實驗室間研究的設備可以來自所列供應商；也可以使用其他供應商。表B.3清洗不銹鋼箔和相關設備所需的化學品———用于實驗室間研究的化學品來自所列供應商；可以使用其他供應商。F.3.2.3步驟按照如下步驟將不銹鋼箔與設備分開清洗：a)將需要清洗的不銹鋼箔或設備放入適當大小的清潔塑料容器內(nèi)；b)在大燒杯中準備足量的質量比為5%的Decon90清洗液；c)將溶液加熱至45℃至50℃,加熱過程一直攪拌；d)將加熱的溶液加入塑料容器中，確保所有設備完全浸入；GB/T35267.5—XXXXe)靜置10min，偶爾搖晃容器；f)倒出清洗劑溶液；g)用純水沖洗設備兩次，同時保持搖擺運動，以確保所有的清洗劑都從設備上清除；h)用異丙醇沖洗設備，以便于干燥；i)小心地將清洗過的設備取出并放置在適當?shù)臒o蛋白質環(huán)境中。F.3.3STPs涂層F.3.3.1注意事項應采取預防措施，以確保將規(guī)定量的測試污染物僅施加到不銹鋼箔未劃刻側的指定區(qū)域上，不能覆蓋劃定的一側，并確保測試污染物不會溢出箔的邊緣。注意有關涂層STPs的視頻指南可從以下鏈接獲得：https:www.youtube.com/watch？v=V6-1v0aM-P0https:www.youtube.com/watch？v=Y-iDF1pKJJAF.3.3.2步驟如下對不銹鋼箔進行涂層：a)確保使用新鮮制作的測試污染物；b)將有劃痕的不銹鋼箔的面朝下放在無蛋白的防滑表面上；c)在不銹鋼箔的一面（無劃痕的一側）均勻地涂抹約5mL的測試污染物（見圖B.2），不要超出邊緣；d)用5號邁耶棒（K涂層機）壓力均勻平穩(wěn)地攤開測試污染物；e)在20℃至25℃（室溫）下，使涂層的不銹鋼箔干燥至少2至4個小時；f)用干凈的剪刀小心地將涂層的不銹鋼箔切成單獨的STPs（如B.所述，約50mmx50mm），沿劃線（反面）切割，同時避免污染涂層側；g)在受控條件下，將各個STPs置于20℃至25℃和40％至60％相對濕度（RH）的條件下并存儲24小時±2小時（請參閱B.3.5）；h)檢查STPs，并放棄所有未完全覆蓋的STPs；i)用精度是4位數(shù)實驗分析天平上稱重所有STPs，并記錄重量[見表E.4（陽性對照）和表E.5（浸沒STPs）]；注2：可以使用干凈的不含蛋白質的塑料一次性培養(yǎng)皿或類似物來稱量和儲存STPs，確保測試污染物涂層面一直朝上，以防止STPs背面被蛋白質污染，并且在使j)在受控條件下，24小時內(nèi)使用涂層并稱重的STPs，并確保不使用時將其保持在上述條件下；k)確保STPs在運輸過程中和使用前保持覆蓋。圖B.2邁耶棒方向顯示的涂有涂層的一面朝上GB/T35267.5—XXXXF.3.4陰性對照STPsF.3.4.1步驟如下準備陰性對照STPs：a)將一塊不銹鋼箔劃成兩個50x50mmSTPs，并標識為N1和N2。切成單獨的STPs并清潔（請參閱B.3.2.3）；b)在實驗室分析天平上稱量各個STPs的重量，并記錄重量（見表E.3）。注意可以使用干凈的無蛋白的塑料一次性培養(yǎng)皿或類似物稱重并存儲切好的STPs，以防止STPs的蛋F.3.5STPs保存F.3.5.1概述對STPs的進行保存的條件：溫度在20℃至25℃之間，相對濕度（RH）在40％至60％之間進行。保存的設備和試劑應至少準備2小時，然后再用測試污染物對不銹鋼箔進行涂層。F.3.5.2步驟保存STPs的條件如下：a)使用適當尺寸的干燥器或密閉室，在適當尺寸的容器中邊攪拌邊向100mL的純水中添加足夠的硝酸鎂[Mg(NO3)2]，以得到飽和溶液，確保未溶解的硝酸鎂殘留在容器中；b)將飽和溶液轉移到更大的容器（例如大培養(yǎng)皿）中，并將其放在干燥器/腔室的底部；c)固定干燥器/腔室并關閉，確保其氣密；d)保持至少2小時的相對濕度穩(wěn)定；e)在受控條件下，將各個STPs置于20℃至25℃和40％至60％相對濕度（RH）的條件下并保存24h±2h。F.4浸漬試驗裝置F.4.1概述進行浸漬測試所需的設備和附件在下面列出，并在圖B.3中以圖形方式表示。F.4.2裝置a)有固定速度設置（50rpm）的磁力攪拌爐；b)長度25mm，直徑6mm的磁力攪拌棒；c)純水；d)玻璃燒杯（400mL深蹲型，直徑80mm）；e)玻璃燒杯溫度測量系統(tǒng)[(0-100)℃±0.5℃]；f)鐵支架、蒸餾瓶夾及固定PVC吸帽的裝置，并將夾具和STPs固定在適當位置，避免與涂覆區(qū)域直接接觸；g)秒表；h)長鑷子；i)PVC吸帽。GB/T35267.5—XXXX1—溫度探頭或溫度計；2—蒸餾瓶夾（和長鑷子一起固定3—鐵支架；4—長鑷子；5—PVC吸帽；6—玻璃燒杯；7—STPs（標準測試件8—純水（平衡）；9—磁子；10—磁力攪拌爐。圖B.3浸漬試驗裝置F.5浸漬試驗過程F.5.1概述浸漬測試過程在兩個溫度，25℃±2℃和75℃±2℃,兩個時間間隔30s和90s下進行。F.5.2步驟進行浸漬試驗如下：a)將100mL純水放入400mL燒杯中。調(diào)整攪拌速度到50rpm；b)確保燒杯中的溫度處于所需的測試溫度，并在±2℃的公差范圍內(nèi)；c)將受污染的STPs一面朝下放置在適當清潔、無蛋白質的表面上，將40mm的PVC吸帽附著在未涂覆的一面上，并將長鉗固定在PVC吸帽上（見圖B.4）；d)將STPs以水平方向懸浮在燒杯中的純水中（見圖B.3深度足夠完全浸沒（大約10mm到15mm），但也不要接觸磁力攪拌棒，并啟動秒表。有必要在浸入STPs之前暫時關閉攪拌器，以防止在STPs被污染的一面表面形成氣泡；GB/T35267.5—XXXXe)在規(guī)定的浸泡時間后，停止攪拌，取下夾緊的STPs，輕輕剝離測試溶液；f)將STPs固定在PVC吸力帽上，用長鉗固定，將STPs的一側放在無蛋白吸水性紙巾上30s（見）；g)置于含有洗脫液和b.6.2中配制的玻璃微珠的500mL玻璃燒杯上。使用無蛋白鑷子拉上吸帽邊緣的吸脫扣片，讓STPs落入洗脫液中（見圖B.6）；h)每次浸泡溫度和浸泡時間重復浸泡測試兩次。圖B.4將長鉗和吸帽安裝到STPs上圖B.5STPs浸泡30s后放置圖B.6將STPs放置在洗脫溶液中，并拆卸吸帽GB/T35267.5—XXXXF.6STPs洗脫過程F.6.1概述將洗脫過程中殘留的蛋白質提取到洗脫溶液中，然后用OPA試劑使用紫外-可見光譜法對其進行分析。應戴無蛋白質非乳膠手套，以避免蛋白質污染。F.6.2步驟洗脫STPs中殘留蛋白如下：a)將10mL洗脫溶液（1%SDS溶液見B.12.2）倒入500mL燒杯中；b)向燒杯中加入2.0g（200~400）μm的玻璃珠；c)將STPs放入洗脫溶液后（見B.5.2g），蓋上燒杯以減少蒸發(fā)；d)在20℃至25℃的軌道振動篩上攪拌（20~30）min；注1：攪拌時間是為了讓所有殘留蛋白有足夠的時間從STPs中洗脫出來，其他測試污染物可e)停止攪動，使用無蛋白鑷子去除STPs，確保玻璃珠保留在燒杯中，把STPs放在蛋白質不吸收組織上，保留STPs，通過重量分析確定STPs的涂層重量（見B.10）；f)讓洗脫的溶液靜置，直到玻璃珠沉淀到燒杯底部。小心地將洗脫液倒入小瓶（如閃爍小瓶蓋上蓋子，確保玻璃珠保留在燒杯中。在瓶子上貼上STPs編號和測試條件，例如STPs#1,25℃,30秒，重復1；g)用UV-VisOPA方法分析洗脫溶液（見B.9）。F.7UV-Vis鄰苯二甲醛（OPA）法F.7.1概述用OPA法萃取后，直接用紫外－可見分光光度法定量測定洗脫液中的殘留蛋白質含量。應使用該方法獲得UV-Vis吸光度讀數(shù)。這一過程需要校準曲線和UV-VIS標準/控制。F.7.2設備執(zhí)行UV-Vis分析需要以下設備和附件：a)紫外-可見分光光度計，波長340nm；b)可校準的移液槍；c)一次性吸液管；d)相同類型和品牌的比色皿；或用于300nm以上分析的高質量一次性比色皿，由耐刮擦材料制成，消光系數(shù)變化最??；e)適當?shù)膶嶒炇也Ａ骶撸ɡ鐭⑷萘科康龋?。F.7.3校準曲線對于復雜蛋白質樣品的定量，測試污染物中的蛋白質濃度應參照牛血清白蛋白V（BSA）進行評估。這使得可以通過使用BSA校準曲線來定量STPs上的蛋白質。注1：所獲得的量化值僅表示以牛血清白蛋白當量F.7.4牛血清白蛋白原液制備GB/T35267.5—XXXXF.7.4.1概述牛血清白蛋白（BSA）校準曲線用于測定STPs上的蛋白質含量。表B.4列出了所需的材料，用于制備校準曲線的稀釋樣品。表B.4BSA原液所需化學用品--F.7.4.2步驟按如下方式準備BSA原液：a)稱出100mg±0.1mg固體牛血清白蛋白，記錄重量，加入100mL容量瓶中；b)在裝有固體牛血清白蛋白的容量瓶中加入1%SDS溶液，輕輕攪拌，標定至100mL，確保完全溶解，原液濃度為1.0mg/mL(1000μg/mL)；注1：該原液用于進行所有后續(xù)稀釋，以構建BSA校準曲線，并c)使用校準移液槍從BSA原液中制備稀釋液，使用1%SDS溶液作為稀釋劑以便覆蓋2.5μg/mL至800μg/mL的初始濃度范圍（參見表E.2）；注2：濃度不應超過800μl/mL(+20μl/mL)，d)不使用時，稀釋液應保持在20℃至25℃（室溫），遠離光線，F(xiàn).7.5OPA法的UV-Vis系統(tǒng)和試劑兼容性F.7.5.1概述在分析之前，有必要確定試劑和稀釋劑是否適合使用，以最大限度地減少錯誤結果。應使用四（4）種因素來確定設備（分光光度計和比色皿）是否合格，并使用兩（2）種試劑來確定測試期間獲得的吸光度是否可靠。這可確保：a)使用的稀釋劑是可接受的（即未降解）；b)測量的吸光度被歸一化以用于計算，并考慮了用于制備樣品的試劑和稀釋劑的吸光度。F.7.5.2系統(tǒng)適宜性控制F.應在使用UV-VIS分光光度計進行分析之前和之后執(zhí)行四（4）個系統(tǒng)適宜性控制。表B.5中列出了控制方法和典型吸收值。表B.5系統(tǒng)適宜性測試在儀器中沒有比色皿的情況下，從UV-Vis分光光度計（在如果獲得的值不在-0.001和+0.001之間，則只需在儀器上-在進行樣品計算時，當用于后續(xù)分析時，試管的任何吸光-典型吸收：-0.001至0.001（或自動調(diào)零時為0.000）GB/T35267.5—XXXX-只用1%的SDS溶液裝滿試管，并從溶液中獲得三個讀數(shù)。-典型吸光度：0.03至0.05-僅將SDS/硼酸鹽溶液裝入試管，并從溶液中獲得三個讀-典型吸光度：0.03至0.05-只用OPA試劑裝滿試管，從溶液中獲得三個讀數(shù)。-典型吸收：0.09至0.11，應為≤0.15F.對于每個對照組，在構建BSA校準曲線（見B.7.6）和平均值（見表E.1）之前，獲得三（3）個值。對于系統(tǒng)適用性和試劑控制（B.7.5.3），使用相同的比色皿被認為是標準做法。但是，在不可行的情況下，應采取措施避免比色皿內(nèi)不一致和比色皿之間的差異。F.在每次分光光度分析之前，應將比色皿用1％SDS溶液沖洗兩次。F.7.5.3試劑對照F.在使用UV-Vis分光光度計進行分析之前和之后，應進行兩次試劑的對照。表B.6列出了控制方法和典型吸收值。表B.6試劑控制試驗/硼酸鹽溶液（1：1v/v比例）填充比色皿。使用一次性—用已校準的自動移液器向試管中加入等體積的1％SDS溶F.對于兩個對照，在構建BSA校準曲線之前（參見B.7.6）獲得三（3）個值并記錄平均值（參見表E.1）F.在每次分光光度分析之前，應將比色皿用1％SDS溶液沖洗兩次。如果在同一過程中試劑對照A溶液的吸光度大于試劑對照B的吸光度，則應重新制備溶液。F.7.6繪制BSA校準曲線以下步驟用于標稱體積為3.0mL的比色皿。如果比色皿的標稱體積大于或小于此值，請相應地調(diào)整體積。使用等體積的樣品和稀釋劑（1：1體積比的混合物）。如果使用的所有比色皿對所用試劑的吸光度相近，則可以使用多個比色皿確定樣品的吸光度。F.7.6.1樣品制備和紫外數(shù)據(jù)采集步驟準備樣品以獲取數(shù)據(jù)，如下所示：a)確保在進行前的同一天已執(zhí)行系統(tǒng)適用性控制（請參閱B.7.5.2）和試劑控制（請參閱B.7.5.3GB/T35267.5—XXXXb)使用已校準的自動移液器，將等體積的對照試劑A和準備好的待測BSA稀釋液（例如1.50mL的對照試劑A和+1.50mLBSA稀釋液）添加到比色皿中；c)用一次性移液器混合比色皿中的內(nèi)容物。應注意盡量減少氣泡的形成，因為這會干擾分光光度計的讀數(shù)；d)靜置60s至90s，并確保樣品不渾濁；e)將比色皿放在UV-Vis分光光度計中，并從溶液中獲得三個讀數(shù)。記錄平均值（見表E.2注2：所獲得的吸光度是針對BSA樣品/在使用的稀釋f)移開比色皿，丟棄內(nèi)容物并用1％SDS溶液沖洗兩次；g)使用校準的自動移液器向試管中加入等體積的OPA試劑和準備好的待測BSA稀釋液（例如1.50mLOPA試劑和+1.50mLBSA稀釋液）；h)用一次性移液器混合比色皿中的內(nèi)容物，應注意盡量減少氣泡的形成，因為這會干擾分光光度計的讀數(shù)；i)靜置60s至90s，并確保樣品不渾濁；j)將比色皿放在UV-Vis分光光度計中，并從溶液中獲得三個讀數(shù)，記錄平均值（見表E.2注3：所獲得的吸光度是使用稀釋濃度的BSA樣品/Ok)移開比色皿，丟棄內(nèi)容物，并用1％SDS溶液沖洗兩次；l)對準備覆蓋2.5μg/mL至800μg/mL范圍的所有BSA稀釋液重復B.7.6.1b）至B.7.6.1注4：用比色皿中的稀釋劑將BSA溶液樣品的濃度（BSA初始濃度）有效地減半（稱F.7.6.2校正標準化平均樣品吸光度（NEBSA）計算每個BSA稀釋樣品的平均吸光度，然后使用試劑對照進行減法歸一化（見表E.2）。a)標準化BSA樣品/自身吸光度（SAEn）是平均吸光度值－平均試劑對照A；b)標準化BSA樣品/OPA試劑（OPAEn）是平均吸光度值－平均試劑對照B；c)校正標準化平均樣品吸光度（NEN）為OPAEn-SAEn。式中，“n”是被測樣品的BSA初始濃度，單位為μg/mL。F.7.6.3繪制BSA標準曲線繪制BSA標準曲線方法如下：a)將標準化BSA濃度(μg/mL,x軸)與校正標準化樣本平均吸光度(NEBSA,y軸)進行繪圖，并用線性趨勢擬合的方法(y=mx+c類型)擬合成一條最佳擬合線。b)確定并記錄（見表E.1）曲線圖斜率（x-系數(shù)項）、曲線圖截距（c-截距項）和r2值（R2要求＞0.990）。曲線圖的代數(shù)式項用于計算陰性、陽性和浸泡試驗STPs樣品中污染物的蛋白質濃度。F.8陰性和陽性對照F.8.1陰性對照STPs無涂層的STPs作空白測定，用來確定干擾物質的背景水平。在檢測前，確保作為陰性對照的兩種STPs（N1,N2）的重量都已確定并記錄。應在構建BSA校準曲線后進行陰性對照STPs蛋白測定。使用洗脫法完成STPs提取，然后使用OPA方法獲得校正標準化平均樣本吸光度（NE），然后從BSA標準曲線推導出代數(shù)式的項，確定兩個單獨STPs上的蛋白質（作為BSA當量）的數(shù)量。GB/T35267.5—XXXX注意檢測極限是試劑對照A的吸光度（見B.7.5.3）。F.8.1.1測量陰性對照STPs上蛋白質的含量測量陰性對照STPs蛋白質含量的方法如下：a)通過洗脫法完成STP的提?。ㄒ夿.6）。對保留的STP進行重量分析（見B.10）。b)確保系統(tǒng)適宜性控制（見b.7.5.2）和試劑控制（見b.7.5.3）在進行前的同一天執(zhí)行。c)用一個標有刻度的自動移液管將等體積的試劑對照品a和提取的陰性對照STP洗脫溶液（各1.50mL）加入比色皿中。d)用一次性吸管混合比色皿內(nèi)的物質。應盡量減少氣泡的形成，氣泡會干擾分光光度計讀數(shù)的準確性。e)靜置(60~90)s，確保樣品不渾濁/模糊。f)將樣品放入紫外－可見分光光度計中，得到溶液的三次讀數(shù)。記錄平均值（見表E.3）。g)取出比色皿，棄去內(nèi)容物，用1%SDS溶液沖洗兩次。h)使用標有刻度的自動吸管將等體積的OPA試劑和提取的陰性對照STP洗脫溶液（各1.50mL）加入比色皿中。i)用一次性吸管混合比色皿內(nèi)的物質。應盡量減少氣泡的形成，氣泡會干擾分光光度計讀數(shù)的準確性。j)靜置(60~90)s，并確保樣品不渾濁/模糊。k)將比色皿放入紫外－可見分光光度計中，從溶液中獲得三次讀數(shù)。記錄平均值（見表E.3）。l)取出比色皿，棄去內(nèi)容物，用1%SDS溶液沖洗兩次。m)重復B.8.1.1a）到B.8.1.1l)，建立另一個陰性對照STP。F.8.1.2校正標準化陰性對照樣品的吸光度（NEn）F.計算每個陰性對照樣品各自吸光度的平均值，然后使用試劑對照進行減法的歸一化（見表a)標準化樣品/自吸光度(SAEn）=平均吸光度值-平均試劑對照A；b)標準化樣品/OPA試劑(OPAEn）=平均吸光度值-平均試劑對照B；c)陰性對照的校正標準化樣本平均吸光度STPs:NEn=OPAEn-SAEn。其中，對于STP為N1或N2，n的值是1或2。F.每個陰性對照STP試驗的蛋白質含量（mg）使用下面的公式（B.1）計算，其中項x（系數(shù)）和c（截距）之前已通過BSA校準曲線確定：xNxNE?c然后計算陰性對照STPs的平均蛋白含量（見表E.3）。F.8.2陽性對照STPsGB/T35267.5—XXXX確保在試驗前確定并記錄兩種作為陽性對照的STPs的重量[見B.3.3.2i)]。陽性對照STPs蛋白試驗應在BSA標準曲線建立后進行。使用洗脫法完成STP提取，然后使用OPA方法獲得校正標準化平均樣本吸光度（NE然后使用從BSA校準曲線推導出代數(shù)式的項，確定兩個單獨STPs上的蛋白質（作為BSA當量）的數(shù)量。應計算兩個陽性對照STPs的平均蛋白質含量，然后結合STPs涂層平均重量（見B.10）來確定每一污染物上的蛋白質含量（mg蛋白質/mg污染物涂層）。該值用于計算在浸泡試驗中所使用的涂層STPs上蛋白質的理論涂層量。檢測的極限為試劑對照A獲得的吸光度（見B.7.5.3）。F.8.2.1檢測陽性對照STPs的蛋白含量檢測陽性對照STPs蛋白含量如下：a)通過洗脫法完成STP提?。ㄒ夿.6）。對保留的STP進行重量分析（見B.10）。除了已規(guī)定的STP編號外，還要將洗脫內(nèi)容標記為P1和P2。b)在進行對照之前，準備好適合的材料（見B.7.5.2）和試劑用量（見B.7.5.3）。c)使用校準的自動移液管將1000μl陽性對照STP洗脫溶液添加到含有4mL（4000μl）1%SDS溶液的小瓶中，并充分混合。這是必要的稀釋步驟，以確保獲得的吸光度值在BSA校準曲線的線性范圍內(nèi)。d)用經(jīng)校準的自動移液管，向試管中加入等量的試劑對照組A和1號稀釋樣品（見B.8.2.1c）各50mL。e)使用一次性移液管混合試管中的試劑。應注意盡量減少氣泡的形成，因為這會干擾分光光度計的讀數(shù)。f)放置60秒至90秒，確保樣品不混濁/模糊。g)將樣品放置于紫外可見分光光度計中，并讀取溶液的三個讀數(shù)。記錄其平均值（見表E.4）。h)倒掉試管中的溶液，并用1%SDS溶液沖洗兩次試管。i)使用經(jīng)校準的自動移液管，向試管中加入等量的OPA試劑和1號稀釋樣品（見B.8.2.1c）各50mL。j)使用一次性移液管混合試管中的試劑。應注意盡量減少氣泡的形成，因為這會干擾分光光度計的讀數(shù)。k)放置60秒至90秒，確保樣品不混濁/模糊。l)將試管放置于紫外可見分光光度計中，并讀取溶液的三個讀數(shù)。記錄其平均值（見表E.4）m)倒掉試管中的溶液，并用1%SDS溶液沖洗兩次試管。n)重復B8.2.1a）至B8.2.1m）步驟，來獲得另一個陽性對照STP。F.8.2.2校正標準化陽性對照樣品吸光度值（NEn）F.對于所使用的每個陽性對照樣品，計算各自的平均吸光度值，然后使用試劑對照品通過減法進行歸一化，如下：a)標準化樣品/自身吸光度值（SAEn）是記錄的陽性對照試劑A組的平均吸光度值；b)標準化樣品/OPA試劑（OPAEn）是記錄的陽性對照試劑B組的平均吸光度值；c)陽性對照STPs的校正標準化平均樣品吸光度值NEn）=（OPAEn）-（SAEn其中，n為1或2時是相對于STPs的P1或P2，如B.8.2.1a）中所述。GB/T35267.5—XXXXF.每個被檢測樣品的蛋白質含量（mg）由以下公式（B.2）得出，其中公式中的x（系數(shù)）和c（截距）已由BSA校準曲線確定：xNxNE?c然后計算出所有檢測的陽性對照組STPs的平均蛋白質含量。F.9浸泡試驗STPs殘留蛋白質的測定-紫外可見光譜分析法對于經(jīng)過浸泡試驗（見B.5）洗脫萃取（見B.6）的STPs，如果樣品吸光度大于1.200，則在進行紫外可見光譜分析之前，洗脫溶液可能需要額外稀釋[見B.9b]。用紫外可見分光光度法測定殘余蛋白質，如下所示。a)按照陰性對照STPs的蛋白質含量測定方法（見B.8.1.1并利用公式（B.1見B.）計算殘余蛋白質含量；b)如果發(fā)現(xiàn)吸光度值大于1.200，則按照包括額外稀釋步驟的陽性對照STPs蛋白質含量測量方法（見B8.2.1），并使用公式（B2）計算殘余蛋白質含量（見B.）；c)記錄結果（見表E.5）。F.10STP涂層重量的測定F.10.1清潔使用過的STPs應徹底清潔、干燥和稱重試驗使用的所有STPs，以確定STP的實際污染物涂層重量。F.10.2步驟測定STP涂層重量如下：a)向干凈的玻璃燒杯（500mL）中加入300mLSDS清洗液（見B.12.3），并加熱至40℃;b)將STPs上所有松散的玻璃珠去除；c)將所有STPs放入清洗液中；d)連續(xù)攪拌溶液（10～15）min，確保STPs不會粘連在一起；e)使用鑷子取出單個的STP，浸入含有500mL純水的燒杯中，同時旋轉STPs，然后浸入含有500mL純水的第二個干凈燒杯中，再次旋轉；f)用鑷子將STP浸入含有100mL丙酮或70%異丙醇的燒杯中，并旋轉溶液；g)用鑷子取出STP，放在無絨布或紙巾上，讓兩邊風干；h)檢查STP的清潔度（使用鑷子操作STP）。如果有可見微粒/殘留物，重復B.10.2的步驟；i)對其余所有的STPs重復B.10.2e）至B.10.2h）的操作步驟。F.10.3STPs涂層重量（重量分析）進行重量分析如下：a)使用干凈并且干燥的鑷子或鉗子，用精確到小數(shù)點后4位的實驗室分析天平分別稱量已徹底清潔和干燥（見B.10.2）的所有處理后的STPs，并記錄重量（見表E.3、E.4和E.5）；b)從B.3.3.2i陽性對照和浸泡STPs）或B.3.4.1B陰性對照）中確定的STPs總重量減去清潔的STP重量[見B.10.3a）]來計算STP涂層重量。見表E.3、E.4和E.5。F.11浸泡后STPs上蛋白質殘留量的計算GB/T35267.5—XXXXF.11.1使用以下計算方法計算每片的蛋白質含量，并記錄結果（詳見表格E.4）。陽性對照蛋白平均含量（詳見B.）÷平均陽性對照毛重（詳見B.10.3）。F.11.2使用以下方式計算并記錄結果，計算用于浸泡試驗的STP的理論計算蛋白質含量（mg詳見表STPn重量（見B.10.3）x每片的蛋白質含量（見B.11.1）。其中“n”是選定的STP編號。F.11.3使用公式（B.3）計算測試STP上剩余的蛋白質百分比，如下所示 理論計算蛋白質含量詳見B.11.2)F.11.4根據(jù)公式（B.3）計算的剩余蛋白質百分比應符合B.2中規(guī)定的驗收標準。F.12溶液的制備F.12.1概述下面制備的溶液，尤其是含有十二烷基硫酸鈉（SDS）作為組分的溶液，偶爾會變得渾濁，通常在20℃以下或長期儲存時。使用前，應檢查所有溶液是否有沉淀。如果觀察到沉淀，在溫水下將溶液加熱至35℃并攪拌，直到所有固體溶解。制備的溶液，尤其是用于進行紫外光可見光控制的溶液（詳見B.7.5）應清澈無可見雜質。F.12.2含量1%SDS溶液的制備1%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液（見表B.7）應用作已處理STPs浸泡的洗脫溶液，以及用于UV-Vis分析的稀釋劑和比色皿沖洗溶液。該溶液也用作UV-Vis對照品（系統(tǒng)適用性試驗）。以下方法適用于2.0通常足以進行試驗。溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無需特殊儲存。表B.71%十二烷基硫酸鈉溶液所需的成分--制備1%十二烷基硫酸鈉溶液如下：a)稱取20.000g±0.002g十二烷基硫酸鈉并記錄重量；b)在2L燒杯中加入1800mL純水；c)向純水中加入十二烷基硫酸鈉，攪拌直至得到溶液；d)如果需要，使用氫氧化鈉溶液測量并調(diào)節(jié)pH至11.0–11.1；e)將溶液轉移到2L容量瓶中；f)用150mL純水沖洗2L燒杯，并向容量瓶中添加洗滌液；g)用更多的純水補充至容量瓶上的2L標記；h)塞住容量瓶并混合內(nèi)容物；i)將2L容量瓶中的物質轉移到合適的瓶子中；j)在瓶子上貼上準備日期和內(nèi)容物的標簽。F.12.3處理后的STPs清洗液的制備GB/T35267.5—XXXX在測定涂層重量（見B.10）之前，用10%w/w十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液（見表B.8）清洗處理過的STPs。以下方法適用于2.0L，通常足以進行清潔。溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無需特殊儲存。表B.810%（w/w）十二烷基硫酸鈉溶液所需的成分--制備STP清洗液如下：a)稱取200.0g±0.5g十二烷基硫酸鈉并記錄重量；b)向2L燒杯中添加1800g±0.5g純水（按重量計）；c)向純水中加入十二烷基硫酸鈉，攪拌直至得到溶液。如果需要幫助溶解，加熱至50℃;d)轉移到一個合適的瓶子里，貼上內(nèi)容物和制備日期的標簽；e)溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無需特殊儲存。F.12.4含量20%（w/w）十二烷基硫酸鈉溶液的制備使用20%（w/w）SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液（見表B.9）作為成分制備SDS/硼酸鹽（見B.12.6）和OPA試劑（見B.12.7）。以下方法適用于200mL。溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，無需特殊儲存。表B.920%（w/w）十二烷基硫酸鈉溶液所需的成分 按如下方法制備20%（無重量）SDS溶液：a)將140mL的純水加入一個200mL的容量瓶中；b)稱量40.00g±0.02gSDS，并記錄重量；c)將SDS部分加入體積瓶，同時輕輕攪拌以幫助溶解（如需要可加熱至50℃);d)溶解后，加入純水，達到200mL；e)停止使用容量瓶，輕輕混合內(nèi)容物，以減少發(fā)泡；f)將容量瓶中的內(nèi)容物轉移到合適的瓶子和標簽內(nèi)容物中。制備20%（w/w）SDS溶液使溶液攪拌泡沫?；旌蠎３衷谧畹拖薅龋阋詭椭腆w溶解。F.12.50.1M硼酸鹽溶液的制備0.1M硼酸鹽溶液（見表B.10）用作制備SDS/硼酸鹽（見B.12.6）和OPA試劑（見B.12.7）.該溶液在20℃至25℃（室溫）下保持穩(wěn)定，不需要特殊存儲。表B.100.1M硼酸鹽溶液所需的組分--按如下方法制備0.1M的硼酸鹽溶液：a)稱量76.20g±0.01g十水合四硼酸鈉，并記錄重量；b)將1500mL的純水（已加熱至40℃至45℃)加入一個2L的燒杯中；c)將十水合四硼酸鈉加入含有純水的燒杯中，攪拌至溶解；d)將溶液轉移到一個2L的容量瓶中；GB/T35267.5—XXXXe)用3x100mL純水沖洗出2L燒杯，并在2L容量燒瓶中加入洗滌液；f)允許2L容量瓶中的內(nèi)容物平衡到20℃至25℃（室溫）；g)用純水、塞子和混合物配制到2L標記；h)將0.1M硼酸鹽溶液轉移到瓶子中，并標明內(nèi)容物和準備日期。F.12.6SDS/硼酸鹽溶液的制備SDS/硼酸鹽溶液（見表B.11）作為稀釋劑，以確定測試樣品的自吸光度，并構建BSA校準曲線（見B.7.6）該溶液也用作紫外－可見控制（系統(tǒng)適用性測試）。以下方法為1.0l，溶液在20℃至25℃（室溫）下穩(wěn)定，不需要特殊存儲。表B.11SDS/硼酸鹽溶液成分組成---->99.0%-->99.0% 配置SDS/硼酸鹽溶液，方法如下：a)將以下溶液依次加入1L容量瓶中，倒入時輕輕攪拌；1)20%(w/w)SDS溶液50mL，3)純水20mL；b)向1L容量瓶中緩緩加入0.1M硼酸鹽溶液，直至瓶內(nèi)溶液體積達到1L；c)塞住容量瓶并使瓶內(nèi)各溶劑充分混合，然后將溶液轉移到合適的瓶子中，并貼上溶劑名稱和制備日期的標簽；d)使用1M氫氧化鈉溶液將溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.3±0.1。F.12.7OPA試劑的制備以OPA試劑（見表B.12）為稀釋劑，測定供試品和為構建BSA校準曲線而制備的稀釋樣品的OPA吸光度。試劑也是紫外－可見對照品（系統(tǒng)適用性試驗）。以下方法適用于1.0L。將OPA試劑儲存在20℃至25℃（室溫）的暗處，直至需要使用，并在14天內(nèi)使用。表B.12OPA試劑所需成分>99.0%>98.0%-- >99.0%>99.0%->99.0% 制備OPA試劑溶液，方法如下：a)稱取1.6g±0.01gOPA和4.64g±0.005g2-巰基乙磺酸鈉分別放在小瓶中并記錄重量；b)向OPA中添加20mL甲醇并溶解固體，視情況在純水下短暫加熱，以幫助溶解；c)向2-巰基乙磺酸鈉中加入20mL純水，溶解固體；GB/T35267.5—XXXXd)在1L燒杯中，添加50mL20%（w/w）SDS溶液和750mL0.1M硼酸鹽溶液，并輕輕攪拌混合；e)向燒杯中加入OPA/甲醇溶液[見B.12.7B）]，并用20mL0.1M硼酸鹽溶液沖洗小瓶。向燒杯中加入沖洗液；f)向燒杯中加入2-巰基乙磺酸鈉鹽溶液[見B.12.7c）]，并用20mL0.1M硼酸鹽溶液沖洗小瓶。向燒杯中加入沖洗液；g)蓋上燒杯并繼續(xù)攪拌，直到所有固體溶解并獲得完整的溶液；h)將燒杯中的液體倒入1L容量瓶中；i)每次使用50mL0.1M硼酸鹽溶液沖洗燒杯兩次，并向燒瓶中添加沖洗液；j)用0.1M硼酸鹽溶液補充至1L標記；塞住并混合溶液；k)將溶液轉移到適當大小的瓶子中（首選黃褐色玻璃）；l)使用1M氫氧化鈉溶液將溶液的pH值調(diào)節(jié)至9.3±0.1；m)用鋁箔包裹容量瓶底部和頸部，以避免溶液降解。GB/T35267.5—XXXX附錄H（資料性）附錄I檢測和評估殘留蛋白質污染物試驗方法的示例型式檢驗（以及性能和常規(guī)檢測）中清潔效果的初步檢查采用目視檢查法。殘留蛋白質的定量分析應只適用于目測清潔的產(chǎn)品。定量檢測方法的選擇應考慮其檢測范圍、準確性和特異性，且應與驗收標準和被檢產(chǎn)品相適應。改良的鄰苯二甲醛（OPA）法（見參考文獻[57]、[74]和[75]）和二喹啉甲酸（BCA）方法（見參考文獻[90]和[92]）是取樣后蛋白質定量的首選方法。由于OPA和BCA方法不直接測定蛋白質，殘留的過程化學品或其他物質可能會干擾蛋白質的測定。因此，需要檢測陰性對照（即與檢測器械相同處理和提取的未受污染的醫(yī)療器械）以排除干擾。I.1.1樣品處理通過用1%十二烷基硫酸鈉（SDS）的水溶液沖洗（或提?。┊a(chǎn)品或產(chǎn)品的指定區(qū)域，來獲得殘留蛋白質分析樣品。應優(yōu)先提取產(chǎn)品中與患者組織接觸并在重復使用過程中產(chǎn)生轉移風險的區(qū)域。這樣可避免結果來自產(chǎn)品非關鍵區(qū)域。應將用于提取的1%SDS溶液應將pH值調(diào)節(jié)到11，并使用刻度至少為0.5pH單位的pH試紙，或用0.1N的氫氧化鈉溶液校準過的pH計進行測定。蛋白質提取方法的有效性應通過確保所有殘留物都溶解來檢驗，例如，通過使用蛋白染色劑對非溶性殘留物進行染色，如考馬斯亮藍R-250、氨基黑、SYPRORuby、STAINSALL（廣譜染色劑）、PonceauS（麗春紅S）。注1：所描述的光譜檢測方法不能有效地檢測到提取物應用最小體積的1%SDS溶液進行提取，以避免因使用大體積提取而引起的任何分析誤差，并有一個適當?shù)臋z測限來評估檢測樣品表面蛋白質殘留的實際情況。大體積提取會因稀釋效應而顯著降低總靈敏度。因此，提取體積應盡可能小的同時確保所有被污染的表面能不斷被浸濕或浸沒，允許提取液在取樣表面上流動。然而，過少體積提取會降低蛋白質回收率。因此，需要仔細地平衡漂洗體積。浸濕產(chǎn)品比將提取體積降低到給定限度以下更重要。此外，小體積重復提取比大體積單次提取更有效。若染色顯示有不溶解的蛋白質，可以通過加熱SDS溶液（如，40℃)和超聲的方式來提高提取效率。注2：在參考文獻[94]公布的數(shù)據(jù)表明，在溫度高的pH=11SDS溶液可以用于溶解來自血樣中高分子量纖維蛋白殘留不能使用光譜檢測方法來測定任何沒有經(jīng)過過濾或單獨的濁度測量校正的混濁溶液中的蛋白質。如果渾濁是由于后處理中的錯誤造成的，則應確定產(chǎn)生渾濁的原因并加以糾正。渾濁樣本可使用0.2μm注射過濾器過濾除去混濁，但必須確保濾膜不吸附蛋白質。膜過濾應與蛋白質測定的所有其他步驟一起進行驗證。使用SDS溶液的提取應在一段確定的時間內(nèi)進行，期間應進行密集攪拌（無論是手工攪拌還是使用渦旋器）或沖洗。例如，SDS提取可以通過浸泡30分鐘，每10分鐘進行30秒的密集攪拌/沖洗來完成。也GB/T35267.5—XXXX可以使用其他驗證過的提取方法。提取方法應確保獲得適當?shù)奶崛⌒手?。?：用2-5mLSDS溶液的聚苯烯袋提取產(chǎn)品表面的蛋白質?？梢允褂醚b有2-5mL1%SDS溶液的密封、牢固且大到可容納產(chǎn)品的聚苯烯（pp）袋來提取整個產(chǎn)品上的殘留污染物。一旦產(chǎn)品密封在有1%SDS溶液的袋中，就可通過翻轉或搖動袋和通過袋操作產(chǎn)品來提取。鉸鏈產(chǎn)品應通過袋子操作，以使SDS溶液與鉸鏈的隱藏表面接觸。注3：聚丙烯、其他袋材料和塑料管通常用助滑劑或脫模劑（例如脲酰胺）進行處理，從而使在產(chǎn)品密集混合過程中從塑料表面釋放出來，并在提取液中產(chǎn)生渾濁。這是測試陰性對照的很好做法（即與測試產(chǎn)品相同處理和提取的未污染產(chǎn)品），以識別任何干擾。帶有腔體或者大且容易接近空腔的產(chǎn)品（如穿刺套管）的提取用一個合適的聚丙烯塑料袋也是可行的。通過來回傾斜，SDS溶液可以定向例2：用2-3mLSDS溶液從鉸鏈產(chǎn)品中部分提取蛋白質一些鉸鏈產(chǎn)品（如：Crile夾具）被用于標準化測試，以評估關鍵功能區(qū)域的清潔效果，如鉸鏈。在SDS溶液中萃取時，鉸鏈需要對接點進行密集活動。例3：用2-5mLSDS溶液從軸管中提取提取具有狹長腔體的產(chǎn)品時，可以將其末端放置在燒杯中并用實驗室支架夾子固定直立。使用移液管或注射器將2-5mL的SDS溶液注入沖洗產(chǎn)品管腔中。從燒杯中抽取SDS溶液。在提取過程中，每間隔一段時間（如5min），使用同一SDS溶液來回沖洗循環(huán)5次。類似的提取過程也可以用于可拆卸的微創(chuàng)外科（MIS）產(chǎn)品，通過將軸與具有功能端的插入件分離，并將插入件放置在長度和內(nèi)徑都足以容納產(chǎn)品的一段試管中。夾緊或密封一端，加入SDS溶液進行提取。同樣夾緊或密封另一端并旋轉產(chǎn)品，使SDS溶液來回流動。內(nèi)部通道可能接觸到污染物質且無法目測的樣品，應用SDS溶液沖洗以收集樣品。I.1.2蛋白質檢測方法的校準殘留蛋白的準確定量取決于用于該方法制備的標準蛋白。用于校準的標準蛋白為牛血清白蛋白（BSA，分數(shù)V）。準備或購買濃度為200mg/mL的BSA標準原液。使用1%SDS溶液中稀釋此原液制備濃度梯度的稀釋液（例如200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL），并儲存在干凈的試管中。產(chǎn)品提取物的蛋白質含量通過比較提取物的測量值與通過已知濃度的標準溶液標準曲線的回歸線計算得出的標準曲線來決定。標準樣品和提取物樣品應以相同的方式進行分析。I.2評價殘留蛋白污染物的改良OPA法改良的鄰苯二甲醛（OPA）法是一種測定一級氨基團的定量方法，它們存在于蛋白質多肽鏈的游離α-氨基和賴氨酸(ε-）上。OPA法在N，N-二甲基-2-巰基乙基氯化銨和一級氨基團的存在下，形成穩(wěn)定的熒光色烷基硫-2-烷基異吲哚，在340nm處可用分光光度法檢測。伯胺普遍存在自然界中，且可出現(xiàn)在加工過程中使用的化學物質中，因此要將陰性對照的確定包括在內(nèi)，以排除可能干擾的物質。注可以使用類似或更高精度的方法，例如：熒光計（見參考文獻[82]）。制備OPA試劑溶液時，應將40mg鄰苯二甲醛溶于1mL甲醇中（混合至完全溶解），然后加入50mL的0.1M四硼酸二鈉緩沖液（pH為9.3）100mg的N，N-二甲基-2-巰基乙基氯化銨和1.25mL的20%SDS水溶液。應將溶液儲存在不透明的瓶子中以避免光線照射，且配制當天使用有效。GB/T35267.5—XXXX用1%SDS溶液以相同比例稀釋OPA試劑來制備分光度計空白組，用于標準溶液和產(chǎn)品提取物的蛋白質測定。使用空白試驗值將分光光度計調(diào)零。調(diào)整分光光度計波長為340nm，并使用光程1cm的石英比色皿（或適用于此波長的一次性半微量比色皿）。在測量標準溶液和產(chǎn)品提取物樣品時，使用相同比例的樣品和OPA試劑。例如，加入200μl標準溶液或提取樣品到1mL（1：5）新制備的OPA溶液中。只要反應混合物的pH保持在9.3（用pH試紙確認），樣品與OPA試劑的比例可降到1：1。較低的稀釋濃度會導致OPA試劑的pH發(fā)生變化，并有可能使結果無效。使用吸液管混合反應液，或使用瓶蓋蓋住比色皿，并輕輕搖晃對溶液進行完全混合。反應5min并將混合后產(chǎn)生的所有氣泡除去后，測定其吸光度值。當吸光度值＞0.010時，所分析的樣品可能含有可吸收340nm波長光的物質。因此，應確定自吸光度值并從OPA測量結果中減去。自吸光度的測定采用相同比例的樣品加入1%SDS溶液中（代替OPA試劑）。吸取200μl的1%SDS產(chǎn)物提取液到1mL的1%SDS溶液中，混合并測定1%SDS溶液的吸光度。從OPA反應后樣品的吸光度和相對于牛血清白蛋白稀釋系列的校準確定的蛋白質量中減去（見C.1.2）。I.2.3蛋白質含量的計算為了計算產(chǎn)品或提取部分上的總殘留蛋白，應考慮提取中所使用的SDS溶液的體積。提取樣品中蛋白質的濃度(μg/mL）乘以用于提取被測產(chǎn)品/區(qū)域的1%SDS的總體積（mL）。例如，如果測定的蛋白質濃度為10μg/mL，提取液體積為5mL，則總殘留蛋白質為50μg。如上述，不必要的高提取液體積會導致蛋白質計算結果倍增、分析干擾及干擾蛋白質測定方法。I.2.4驗收標準/結果解釋查閱有關干擾物質的相關文獻。I.3評價殘留蛋白質污染物的BCA方法二喹啉甲酸法與雙縮脲反應相似，在堿性環(huán)境中，蛋白質將Cu2+還原成Cu+，Cu+與2分子的二喹啉甲酸結合生成在562nm波長處有最大吸收的紫色生色團。在試驗環(huán)境下，可將Cu2+還原成Cu+的其他物質也會形成BCA生色團。因此，進行陰性對照組有助于排除干擾。I.3.2材料/試劑試劑A和B的配制如下：試劑A：將1g的2,2-聯(lián)喹啉-4,4－二甲酸二鈉，2g的碳酸鈉，0.16g的酒石酸鈉，0.4g的NaOH和0.95g的碳酸氫鈉加入100mL蒸餾水中，并用10M的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至11.25。試劑B：將0.4g五水硫酸銅加入10mL蒸餾水中。將100份試劑A與2份試劑B混合制備成標準溶液（SWS）。將SWS溶液儲存在不透光的瓶子中以避免光線照射，且配制當天使用有效。將100μl提取液或標準溶液加入1mLSWS（或200μl提取物或標準溶液和2mLSWS）作為試驗，將100μl純水加1mLSWS作為空白對照組?；旌喜⒃谑覝叵路磻獌尚r（20℃±1℃)。然后在10分鐘內(nèi)用分GB/T35267.5—XXXX光光度計在562nm波長下測量空白對照、標準BSA溶液和產(chǎn)品提取樣品，通過在清潔的試管中測量純化水來重置為零，通過從測量值中減去空白值來調(diào)整測量值。注意：BCA試驗的顯色依據(jù)反應速率（沒有真正反應終點反應顏色隨著反應物（Cu2+和過量BCA）的消耗變深。生色團在10min內(nèi)無明顯偏差。產(chǎn)品提取物的蛋白質濃度是通過與牛血清白蛋白標準比較進行確定（見C.1.2）。產(chǎn)品提取物的蛋白濃度相對于牛血清白蛋白標準。I.3.4總蛋白含量的計算計算產(chǎn)品提取物的總蛋白（見C.2.3）。I.3.5驗收標準/結果解釋查閱有關干擾物質的相關文獻。GB/T35267.5—XXXX附錄K（資料性）附錄L檢測血紅蛋白以評估清潔效果的測試方法示例L.1血紅蛋白檢測方法L.1.1原理除了通過目視檢查對清潔效果進行初步檢查外，還可在殘留蛋白測試的基礎上，進行殘留血紅蛋白測試。殘留血紅蛋白的檢測可以根據(jù)污垢的種類的調(diào)整。方法的選擇應考慮其檢測范圍、準確性和特異性，并應適合驗收標準和待測試的產(chǎn)品。血紅蛋白化學定量中，所有的反應都發(fā)生在非蛋白血紅素成分中，其中心位置的鐵分子是氧結合的位置。由于下面描述的定量方法不能直接測量血紅蛋白（或直接在特定波長測量殘留的工藝化學品或其他物質可能會干擾血紅蛋白反應或可能在相同的波長吸收。而測試陰性對照（即與測試產(chǎn)品相同加工和提取的未污染樣品）有助于排除化學或光學干擾。L.1.2樣品用于殘留血紅蛋白分析的樣品是通過用1%十二烷基硫酸鈉（SDS），pH為11的水溶液對產(chǎn)品或產(chǎn)品的目標區(qū)域進行沖洗（洗脫）或擦拭得到的。關于殘留蛋白提取方法的詳細信息，請參照本文檔的C.1.1部分，這些方法同樣適用于血紅蛋白。L.2微血尿測試條對血紅蛋白的半定量分析L.2.1原理市售的檢測試紙非常靈敏，是快速獲得半定量殘留血紅蛋白評估結果的簡便方法，可作為初步篩查試驗。這些產(chǎn)品不需要特殊設備，在幾分鐘內(nèi)給出檢測結果，檢出限（LOD）<1μg/mL。這些檢測試紙使用了一種基于血紅蛋白假過氧化物酶活性的化學物質。因為LOD與允許的殘留血紅蛋白限值相比非常低，因此對于確認清洗后的手術器械上是否殘留血紅蛋白十分有用。例如，如果測試產(chǎn)品的表面積為100cm2，干預水平為2ug/cm2，則允許的殘留血紅蛋白為220μg。L.2.2程序a)將一滴產(chǎn)品提取液（見D.1.2）滴在測試區(qū)域（檢測試紙的末端），然后擦拭（從測試條的側邊）或輕敲試紙，去除多