SARS動(dòng)物感染模型-(1)課件

SARS動(dòng)物感染模型組員：陳彤彤、胡珣、李玉瑤點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本SARS？重癥急性呼吸綜合征（SARS）為一種由SARS冠狀病毒（SARS-CoV）引起的急性呼吸道傳染病。臨床表現(xiàn)為發(fā)熱,咳嗽,呼吸窘迫。該疾病傳染性強(qiáng)，

病死率高，大量病人死于呼吸衰竭，且出現(xiàn)肺纖維化及股骨頭壞死并發(fā)癥。主要傳播方式為近距離飛沫傳播或接觸患者呼吸道分泌物。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本SARS動(dòng)物感染模型的建立篩選動(dòng)物種類，確定敏感動(dòng)物。標(biāo)化一定劑量感染性病原。經(jīng)適當(dāng)途徑感染指定的動(dòng)物。記錄臨床表現(xiàn)，確定和檢測(cè)特征性指標(biāo)。評(píng)價(jià)模型點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本篩選動(dòng)物種類，確定敏感動(dòng)物恒河猴，別名獼猴、黃猴、廣西猴。是我國常見的一種猴類,分布地域范圍十分廣泛。適應(yīng)性強(qiáng)，容易馴養(yǎng)繁殖，生理上與人類較接近，因此是生物學(xué)、心理學(xué)、醫(yī)學(xué)等多種學(xué)科研究工作中比較理想的試驗(yàn)動(dòng)物。恒河猴標(biāo)化病原點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本病原體選取原則模型制備使用的病原體應(yīng)處于活化狀態(tài)的最好病原（實(shí)驗(yàn)室研究在培養(yǎng)48小時(shí)以后，到達(dá)頂峰，此時(shí)活性最好）導(dǎo)致相同感染性疾病的病原在不同地區(qū)存在差異，致病性也會(huì)不同，因此，應(yīng)選擇生物學(xué)特性明確，經(jīng)過鑒定的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行模型研究。SARSCoVNS—I株選擇感染途徑點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本SARS主要傳播方式為近距離飛沫傳播或接觸患者呼吸道分泌物選擇經(jīng)鼻吸入感染SARS病毒方法制作SARS感染的模型特征性指標(biāo)的確定和檢測(cè)點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本臨床表現(xiàn)病原學(xué)指標(biāo)病理生理性指標(biāo)免疫學(xué)指標(biāo)1.體溫:檢測(cè)體溫是否升高，正常猴體溫38℃。2.病毒分離培養(yǎng)：觀察細(xì)胞是否病變。3.病理檢查：取處死后的恒河猴組織，常規(guī)病理固定，HE染色，光鏡下觀察。4.病毒核酸檢測(cè)：在特定區(qū)域處出現(xiàn)特異性核酸擴(kuò)增帶者為陽性，反之陰性。5.間接免疫熒光檢測(cè):加FITC羊抗人IgG熒光抗體，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果，胞漿或胞膜上出現(xiàn)翠綠色熒光者為陽性，桔紅色者為陰性。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本恒河猴感染SARS病毒致病模型的建立點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備1.SARSCoVNS—I株，為國家認(rèn)可的SARSCoY標(biāo)準(zhǔn)株，由北京華特森基因科技有限公司提供。2.Vero細(xì)胞(163代)由武漢大學(xué)典型物保存中心提供，培養(yǎng)用MEM培養(yǎng)基+10％小牛血清，常規(guī)加入青、鏈霉素(自配)。3.普通恒河猴(MacacaRhesus)12只，2～3歲，約5kg左右，雌雄各半。健康良好，SARSCoVIgG檢測(cè)陰性，購自云南省動(dòng)物繁殖中心。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本動(dòng)物分組和病毒感染1.設(shè)病毒感染組和非病毒感染組各6只恒河猴。2.猴籠保持空氣新鮮，維持相對(duì)濕度60％，溫度(2O±5)℃。3.感染部位常規(guī)消毒后，將病毒用注射器經(jīng)氣管軟骨氣管內(nèi)滴注，病毒滴度為10PFU／mL，感染劑量為0.5mL／只。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本

病毒分離1.恒河猴感染病毒后，第2、5d分別靜脈采血2—3mL(不抗凝)；第3、5、7、9d采集鼻咽拭子和肛拭子，并置于1mL生理鹽水中；第1d后隔日采集尿液；上述標(biāo)本存4℃。2.第10d各處死3只恒河猴及第14d各處死另3只恒河猴，并取肺組織存一3O℃。3.病毒感染前分別留血液、鼻咽拭子、肛拭子和尿液作為對(duì)照。4.病毒分離程序?yàn)椋簩⒔M織制成10％勻漿或分泌物離心上清，取0．2mL／孔，接種到已長(zhǎng)成單層的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每份標(biāo)本接種4孔，37℃、5％CO2培養(yǎng)，觀察細(xì)胞病變，未病變標(biāo)本盲傳3代并作間接免疫熒光檢測(cè)。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本

病理檢查取處死后恒河猴的肺、肝、腎、脾、心臟和腦組織，常規(guī)病理固定、HE染色，光鏡下觀察。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本

病毒核酸檢測(cè)1.提取RNA的過程：上述病毒分離材料(包括SARSCoVNS-I株)用TRIzolRNA抽提試劑(Invitrogen生命公司)抽提RNA，所提RNA溶于20uL無RNA酶的水中備用。2.逆轉(zhuǎn)錄過程為：組織RNA或SARSCoVNS一1株RNA4uL,加Oligo(dT)(0.5ug／uL)2uL補(bǔ)水至10.5uL，65℃變性10min，后立即至冰浴，依次加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4uL、0.1mol／LDTT2uL、0.01mol／LdNTP2uL、RNasin(40U／uL)0．5uL及AMV(5U／pL)1uL，43℃水浴1h，后立即至冰浴。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本

病毒核酸檢測(cè)3.PCR擴(kuò)增的過程：取cDNA5uL、10xTaq酶緩沖液5uL、dNTPs(0.01mol/L)2uL、引物1，2各1(序列見下)、Taq酶(2U／uL)1uL，補(bǔ)水至總體積50uL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)為：94℃2min;94℃10s/55℃30s／68℃3min，共10個(gè)循環(huán)；94℃10s／55℃30s／68℃3min，共25個(gè)循環(huán)，后68℃7min延伸。引物序列為：5’CAGAGT-FGTGG1TCAAGTG3’(21431-21450)5’CACAGAGTAATCAGCAACAC3’(22538-22519)4.凝膠電泳的過程：反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)含EB的1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在1．1kb處出現(xiàn)特異性核酸擴(kuò)增帶者為陽性，反之陰性。正常組織、病毒標(biāo)準(zhǔn)株分別作陰陽性對(duì)照。點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本間接熒光免疫檢測(cè)1.感染細(xì)胞滴片晾干，冷丙酮固定30min。2.將己滅活的傳染性非典型性肺炎的恢復(fù)期病人血清標(biāo)本適當(dāng)稀釋后分別滴加到細(xì)胞抗原片上，置37℃濕盒中孵育30min，沖洗，PBS液中振蕩洗3次，晾干。3.然后加FITC羊抗人IgG熒光抗體，同前常規(guī)孵育、沖洗、晾干并封片，在熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果。4.胞漿或胞膜上出現(xiàn)翠綠色熒光者為陽性，桔紅色者為陰性。恒河猴SARS感染模型完成點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本點(diǎn)擊添加文本恒河猴