非水相生物催化-(1)省公開課一等獎全國示范課微課金獎課件

第4章非水相生物催化第1頁概述生產(chǎn)工藝優(yōu)化是降低資源消耗和環(huán)境污染必定要求，即“化工過程生物化”或“化學-生物一體化”。生物催化系統(tǒng)主要由底物及產(chǎn)物、反應介質(zhì)、生物催化劑三個基本要素組成。能夠經(jīng)過對基本要素改變到達優(yōu)化反應目標。第2頁非水相生物催化是將生物催化劑應用于非水介質(zhì)來實現(xiàn)所期望化學反應或化學轉(zhuǎn)化，這些技術(shù)和方法人們稱之為非水相生物催化。早在1913年，Bousquelt等就發(fā)覺酶在有機溶劑（乙醇、丙酮等）中含有一定催化活性，但傳統(tǒng)觀念認為酶催化反應需要在水溶液中進行，只有在水溶液里酶才能維持其催化活性結(jié)構(gòu)，有機溶劑將使酶變性失活或抑制其活性，所以這一發(fā)覺在當初并未受到應有重視。1966年，Dostoli和Siegel報道Chymotrypsin、Horseradishperoxidase在含有機溶劑介質(zhì)中含有催化活性。1975～1983年，微生物細胞、游離酶和固定化酶在有機溶劑中合成酯、內(nèi)固醇以及甾醇轉(zhuǎn)化。第3頁直到1984年，Klibanov等在《Science》上報道了脂肪酶在有機介質(zhì)中不但含有較高催化活性，而且含有極高熱穩(wěn)定性，同時同種酶在不一樣有機溶劑中能夠表現(xiàn)出不一樣立體選擇性。之后，非水相生物催化研究才引發(fā)人們廣泛關(guān)注和重視，相關(guān)研究報道日漸增多，并取得了突破性進展。開辟了非水相酶學（Non-aqueousenzymology)這一嶄新研究領(lǐng)域，拓展了酶應用范圍。年，Klibanov在《Nature》上綜述了酶在有機溶劑中催化特征以及展望未來非水相生物催化發(fā)展趨勢第4頁酶活性和選擇性實質(zhì)上取決于酶空間結(jié)構(gòu)，尤其是高級結(jié)構(gòu)；而酶結(jié)構(gòu)又取決于其分子內(nèi)部以及它與周圍環(huán)境之間各種作用力，如離子鍵、氫鍵等。改變酶一級結(jié)構(gòu)是從根本上改變酶空間結(jié)構(gòu)，而構(gòu)象改變能夠經(jīng)過微環(huán)境調(diào)整來實現(xiàn)。介質(zhì)多樣化才能適應底物和催化劑多樣化。水100%有機溶劑99.9%第5頁非水介質(zhì)酶催化研究內(nèi)容基本理論研究，包含影響非水介質(zhì)中酶催化主要原因以及非水介質(zhì)中酶學性質(zhì)經(jīng)過非水介質(zhì)中結(jié)構(gòu)和功效研究，說明非水介質(zhì)中酶催化機制，建立完善基本理論利用上述理論指導非水介質(zhì)中酶催化反應應用

第6頁酶非水相催化幾個類型有機介質(zhì)中酶催化有機介質(zhì)中酶催化是指酶在含有一定量水有機溶劑中進行催化反應。適合用于底物、產(chǎn)物二者或其中之一為疏水性物質(zhì)酶催化作用。酶在有機介質(zhì)中因為能夠基本保持其完整結(jié)構(gòu)和活性中心空間構(gòu)象，所以能夠發(fā)揮其催化功效。氣相介質(zhì)中酶催化酶在氣相介質(zhì)中進行催化反應。適合用于底物是氣體或者能夠轉(zhuǎn)化為氣體物質(zhì)酶催化反應。超臨界介質(zhì)中酶催化酶在超臨界流體中進行催化反應。超臨界流體是指溫度和壓力超出某物質(zhì)超臨界點流體。第7頁有機相酶反應優(yōu)點有利于疏水性底物反應可提升酶熱穩(wěn)定性能催化在水中不能進行反應可改變反應平衡移動方向可控制底物專一性可預防由水引發(fā)副反應可擴大反應pH值適應性酶易于實現(xiàn)固定化酶和產(chǎn)物易于回收可防止微生物污染第8頁單一水或緩沖溶液系統(tǒng)有利于溶解和傳質(zhì)，各組分分布均勻。因為酶構(gòu)象與其離子化狀態(tài)親密相關(guān)，所以酶體外試驗研究通常在一定濃度緩沖溶液體系中進行，這么可確保酶在最正確pH附近發(fā)揮最大活力。緩沖溶液種類很多，在酶催化中使用最多可能是磷酸鹽和Tris-HCl，因為大多數(shù)酶最正確pH在中性范圍內(nèi)(pH5~9)，但也有例外情況。第9頁水-有機溶劑單相系統(tǒng)這種均一體系是由水和極性較大有機溶劑相互混溶組成反應體系。有機溶劑百分比對反應體系含有主要影響。酶和底物都是以溶解狀態(tài)存在于均一體系中。不存在傳質(zhì)妨礙，但因為極性大有機溶劑對普通酶催化活性影響較大，所以能在該反應體系進行催化反應酶較少。假如該系統(tǒng)中有機溶劑百分比高過某一閾值，將奪去酶分子表面結(jié)構(gòu)水，使酶失活第10頁水-有機溶劑兩相系統(tǒng)水-有機溶劑兩相系統(tǒng)是指由水相和非極性有機溶劑相(烴、醚、酯等)組成非均相反應系統(tǒng)，體積比能夠在很寬范圍內(nèi)變動。底物和產(chǎn)物則主要溶于有機相中；酶溶解于水相中，這么可使酶與有機溶劑在空間上相分離，以確保酶處于有利水環(huán)境中，而不直接與有機溶劑相接觸。在兩相系統(tǒng)中，分配系數(shù)(熱力學參數(shù))和質(zhì)量傳遞系數(shù)(動力學參數(shù))決定了酶反應擬一級速率常數(shù)kcat(=Vmax/KM)。所以整個反應速率主要由這兩個原因(溶解度、攪拌速度等)所決定，而與酶催化能力關(guān)系不大。第11頁值得注意是增加攪拌能夠增加質(zhì)量傳遞以提升酶催化反應速度，但不正確攪拌會產(chǎn)生機械和化學張力而造成酶失活。經(jīng)過選擇適當有機溶劑以及適度水相調(diào)整(如pH、鹽濃度等)能夠控制反應物在兩相中分配。假如在均相系統(tǒng)中存在嚴重底物或產(chǎn)物抑制，那么使用兩相系統(tǒng)可望在很大程度上緩解這一問題。第12頁TopphaseBottomphase

SubstratesProductProduct

Sideproduct

BiocatalystAquousTwoPhaseSystem--ATPS構(gòu)建兩相體系實現(xiàn)在線產(chǎn)物分離第13頁乳狀液與微乳液系統(tǒng)在一些疏水性底物生物轉(zhuǎn)化反應中，還經(jīng)常使用表面活性劑穩(wěn)定乳狀液系統(tǒng)。比如，在脂肪酶催化拆分酮基布洛芬酯水解反應中，發(fā)覺添加適量非離子表面活性劑Tween-80，不但有利于難溶底物酯分散，使酶反應速度提升了13倍，而且酶反應對映選擇性也大幅度提升，最多可提升兩個數(shù)量級。類似地，在環(huán)氧水解酶催化反應中，也發(fā)覺添加乳化劑Tween-80要比添加助溶劑DMSO效果要好，不但改進了酶活性和選擇性，而且提升了酶穩(wěn)定性。第14頁原理：形成反膠束系統(tǒng)，水分子聚集在反膠束內(nèi)核中形成“微水池”，里面容納了酶分子，這么酶被限制在含水微環(huán)境中，而底物和產(chǎn)物能夠自由進出膠束。優(yōu)點：①組成靈活性；②熱力學穩(wěn)定性和光學透明性；③逆膠束有非常高比界面積；④逆膠束相特征隨溫度而改變。第15頁正膠束體膠束又稱為正膠束或正膠團，是在大量水溶液中含有少許與水不相混溶有機溶劑，加入表面活性劑后形成水包油微小液滴。表面活性劑極性端朝外，非極性端朝內(nèi)，有機溶劑包在液滴內(nèi)部。反應時，酶在膠束外面水溶液中，疏水性底物或產(chǎn)物在膠束內(nèi)部。反應在膠束兩相界面中進行。第16頁反膠束體系含有表面活性劑與少許水有機溶劑系統(tǒng)。反向微團：疏水尾部向外，與非極性有機溶劑接觸；極性頭部向內(nèi)，形成一個極性核。反應時，酶分子在反膠束內(nèi)部水溶液中，疏水性底物或產(chǎn)物在反膠束外部，催化反應在兩相界面中進行。第17頁霧點系統(tǒng)當一個非離子表面活性劑水相膠束溶液溫度到達其霧點以上，或者在存在一些添加劑情況下，會造成相分離，形成一個表面活性劑稀少相(水包油乳液)和一個表面活性劑富集相(油包水乳液)，后者又稱凝聚相，其中包含許多大水泡，可容納細胞或溶解酶分子。這么系統(tǒng)被稱為霧點系統(tǒng)(cloud-pointsystem)，它曾被用于分離技術(shù)中，即所謂霧點萃取。第18頁微水有機溶劑單相系統(tǒng)均相有機溶劑體系是指用與水不互溶有機溶劑取代全部溶劑水(＞98%)，形成固相酶分散在有機溶劑中非均相反應體系。處于這種體系中酶，其表面必須有殘余結(jié)構(gòu)水，才能確保其催化活性。普通有機溶劑中含有小于2%微量水。慣用與水不互溶有機溶劑有烴類、醚、芳香族化合物、鹵代烴等，它們疏水指數(shù)(logP)較大。固相酶在有機溶劑中含有催化活性是酶一項主要特征，在過去二十多年研究中，已證實這種體系是可行、可靠和多用途。第19頁固相酶在結(jié)構(gòu)上仍是柔性，酶分子內(nèi)部柔性足以確保酶和底物結(jié)合時酶能產(chǎn)生微小構(gòu)象改變，形成酶和底物結(jié)合中間復合體。酶分子比表面積約為(1～3)×106m2·kg－1，與活性炭相當；酶分子體積1/3～2/3是空，充滿了溶劑；所以足夠攪拌將確保底物能與酶表面或內(nèi)部活性中心結(jié)合，并起催化反應。第20頁就應用而言，顯著降低反應混合物含水量是有利。因為酶在低含水系統(tǒng)中通常不溶，故得到是非均相反應混合物。酶既能夠以游離酶粉(不論純度怎樣)形式直接使用，也可先固定在固相載體上再使用。但二者都必須使酶處于對催化最適合離子化狀態(tài)，所以必須在將酶制備成粉末或固定化顆粒之前將溶液pH調(diào)整到最正確值。第21頁超臨界流體超臨界流體概念指溫度和壓力均在本身臨界點以上高密度流體，含有和液體一樣凝聚力、溶解力；然而其擴散系數(shù)又靠近于氣體，是通常液體近百倍。除了親脂性有機溶劑外，超臨界流體(supercriticalfluids)，如二氧化碳、氟里昂(CF3H)，烷烴類(甲烷、乙烯、丙烷)或無機化合物(SF6，N2O)等，都能夠作為酶催化親脂性底物溶劑，酶在這些溶劑中就像在親脂性有機溶劑中一樣穩(wěn)定。第22頁超臨界流體對多數(shù)酶都能適用，酶催化酯化、轉(zhuǎn)酯、醇解、水解、羥化和脫氫等反應都可在此體系中進行，但研究得最多是水解酶催化反應。這種溶劑體系最大優(yōu)點是無毒、低粘度、產(chǎn)物易于分離。超臨界流體粘度介于氣體與液體之間，其擴散性比普通溶劑高1~2個數(shù)量級。超臨界氣體在臨界點附近溫度或壓力有一點微小改變都會造成底物和產(chǎn)物溶解度極大改變，因而很輕易調(diào)控超臨界流體中酶催化反應特征，如反應速率和選擇性。該體系缺點是需要有能耐受幾十個兆帕高壓容器，而且減壓時易于使酶失活。另外，有些超臨界流體如二氧化碳可能會與酶分子表面活潑基團發(fā)生反應而引發(fā)酶活性喪失。第23頁離子液體在最近10年中，離子液體(ionicliquids,ILs)作為一個新型反應介質(zhì)，被用于各種類型反應，并經(jīng)常產(chǎn)生顯著效果，從而引發(fā)人們廣泛注意。離子液體實質(zhì)上是一些凝固點較低(m.p.<100oC)鹽，比如1-烷基-3-甲基咪唑與PF6或BF4形成鹽。離子液體作為一類極性溶劑，能溶解許多有機化合物。第24頁與普通有機溶劑最大區(qū)分在于：①離子液體不會揮發(fā)(沒有蒸氣壓)，對環(huán)境比較友好，用于工業(yè)生產(chǎn)也相對比較安全；②它們與許多有機溶劑互不相溶，能夠形成有機溶劑-離子液體兩相系統(tǒng)或者有機溶劑-水-離子液體三相系統(tǒng)，從而為溶劑工程在生物催化反應中應用提供了新可能。普通而言，離子液體通常有三種方式被應用于生物催化過程：①作為單一溶劑；②作為共溶劑添加于水相系統(tǒng)中；③與水形成兩相系統(tǒng)。第25頁無溶劑或少溶劑反應系統(tǒng)在許多情況下，反應系統(tǒng)最正確選擇可能是根本不用溶劑，或者只用極少許溶劑。在最少有一個反應物為液體情況下，反應物之間質(zhì)量傳遞能夠經(jīng)過流體相進行。第26頁在無溶劑系統(tǒng)中適當提升反應溫度，能夠促進反應物分子擴散和混合，從而提升酶反應速度。當反應物均為固體顆粒時，也不一定非要用溶劑使其溶解。反應完全能夠在含酶液相中進行，盡管該液相有可能完全隱藏在反應物固體顆粒之間縫隙中而看不見。為了形成這一隱形液相，普通只需加入極少許(比如反應物重量10%)某種“溶劑”，而最好溶劑可能就是水，因為水通常會使酶產(chǎn)生最高催化活力。第27頁酶在有機介質(zhì)中催化特征酶在有機介質(zhì)中起催化作用時，因為有機溶劑極性與水有很大差異，對酶表面結(jié)構(gòu)、活性中心結(jié)合部位和底物性質(zhì)都會產(chǎn)生一定影響，從而顯示出與水相介質(zhì)中不一樣催化特征.底物特異性；立體選擇性；區(qū)域選擇性；鍵選擇性；熱穩(wěn)定性；活性；pH值第28頁底物專一性在有機介質(zhì)中，因為酶分子活性中心結(jié)合部位與底物之間結(jié)合狀態(tài)發(fā)生一些改變，致使酶底物特異性會發(fā)生改變。有機介質(zhì)使一些酶專一性發(fā)生改變，是酶活性中心構(gòu)象剛性增強結(jié)果。酶促反應底物專一性本質(zhì)是因為酶能夠利用它與底物結(jié)合能和酶與水分子之間結(jié)合能差值。第29頁從酶和底物間或鍵間自由能利用來分析：在水溶液中，酶活性中心極性基團和極性強底物分子之間形成強氫鍵，需要更多能量來破環(huán)它們之間氫鍵，以利于酶-底物絡(luò)合物形成，造成對應反應速度降低（即酶與底物復合物結(jié)合能高，故在水溶液中傾向于選擇極性低底物）；而在有機相中，因其不能形成氫鍵，酶對底物選擇性朝相反方向進行。酶和底物之間結(jié)合能是酶催化反應主要推進力，底物必須從反應介質(zhì)中解析出來與酶活性中心結(jié)合。很多酶活性中心都是疏水性，它們與疏水底物反應最有利，因為疏水性底物更輕易從水中解析抵達疏水性活性中心。然而以有機溶劑替換水后，疏水性底物與有機溶劑間相互作用增強，底物從溶劑抵達活性中心就比在水中困難，從而減慢了酶催化反應速度。而親水性底物在疏水性較強溶劑中則輕易進入酶活性中心，從而加緊酶催化反應速度。第30頁從熱力學角度看，底物專一性改變原因是因為溶劑改變造成底物在有機溶劑與酶活性中心之間分配系數(shù)發(fā)生了改變。不一樣有機溶劑含有不一樣極性，所以在不一樣有機介質(zhì)中，酶底物專一性也不一樣。第31頁立體選擇性酶對映體選擇性（enantioselectivity）又稱為立體選擇性或立體異構(gòu)專一性，是酶在對稱外消旋化合物中識別一個異構(gòu)體能力大小指標。酶立體選擇性隨溶劑疏水性增加而降低。酶在有機介質(zhì)中催化，與在水溶液中催化比較，因為介質(zhì)特征發(fā)生改變，而引發(fā)酶對映體選擇性也發(fā)生改變。有機溶劑中酶對映選擇性降低。第32頁原因之一：是因為在水和有機溶劑中，底物兩種對映體將水從酶分子疏水性結(jié)合位點上置換出來能力有所不一樣。原因之二：在疏水性差溶劑里，疏水性基團進入酶疏水袋中比暴露在溶劑中熱力學平衡更為有利，所以，酶分子中親核基團易于進攻位置適當?shù)孜锓肿恿u基，這么得到某個構(gòu)型產(chǎn)物。而在疏水性強溶劑中，疏水性基團更傾向于暴露在溶劑中，而不易進入酶疏水袋，從而失去了酶對底物立體選擇性。第33頁化學鍵選擇性酶在有機介質(zhì)中進行催化另一個顯著特點是含有化學鍵選擇性。鍵選擇性與酶起源和有機介質(zhì)種類相關(guān)。（與氫鍵參數(shù)相關(guān)，易于形成氫鍵基團，不易進行反應；不易形成氫鍵基團易于反應。）第34頁熱穩(wěn)定性許多酶在有機介質(zhì)中熱穩(wěn)定性比在水溶液中熱穩(wěn)定性更加好。酶在有機介質(zhì)中熱穩(wěn)定性還與介質(zhì)中水含量相關(guān)。通常情況下，伴隨介質(zhì)中水含量增加，其熱穩(wěn)定性降低。在有機介質(zhì)中，酶熱穩(wěn)定性之所以增強，可能是因為有機介質(zhì)中缺乏引發(fā)酶分子變性失活水分子所致。第35頁加熱后酶活力改變第36頁非水溶劑選擇有機溶劑選擇要適當，其主要是經(jīng)過對體系中水、酶及底物和產(chǎn)物作用直接或間接地影響到酶活性。酶在低極性溶劑中含有較高活性和穩(wěn)定性。有機溶劑極性強弱能夠用疏水參數(shù)lgP表示。P是指溶劑在正辛烷與水兩相中分配系數(shù)。疏水參數(shù)越大，表明其疏水性越強；反之疏水參數(shù)越小，則極性越強。第37頁logP是衡量物質(zhì)疏水性強弱一個特征參數(shù),P=C正辛醇/C水第38頁有機溶劑極性選擇要適當，極性過強（lgP<2）溶劑，會奪取較多酶分子表面結(jié)合水，影響酶分子結(jié)構(gòu)，并使疏水性底物溶解度降低，從而降低酶反應速度，在普通情況下不選??；極性過弱（lgP≥5）溶劑，即使對酶分子必需水奪取較少，疏水性底物在有機溶劑中溶解度也較高，不過底物難于進入酶分子必須水層，催化反應速度也不高。通常選取2≤lgP≤5溶劑作為催化反應介質(zhì)。第39頁第40頁酶與水酶都溶于水，只有在一定量水存在條件下，酶分子才能進行催化反應。所以酶在有機介質(zhì)中進行催化反應時，水是不可缺乏成份之一。有機介質(zhì)中水含量多少對酶空間構(gòu)象、酶催化活性、酶穩(wěn)定性、酶催化反應速度等都有親密關(guān)系，水還與酶催化作用底物和反應產(chǎn)物溶解度相關(guān)。第41頁酶分子只有在空間構(gòu)象完整狀態(tài)下，才含有催化功效。在無水條件下，酶空間構(gòu)象被破壞，酶將變性失活。故此，酶分子需要一層水化層，以維持其完整空間構(gòu)象。維持酶分子完整空間構(gòu)象所必需最低水量稱為必需水（essentialwater）。第42頁干燥酶水合過程：（1）與酶分子表面帶電基團結(jié)合到達0-0.07g/g（水/酶）（2）與表面極性基團結(jié)合(0.07-0.25g/g)（3）凝聚到表面相互作用較弱部位（0.25~0.38g/g）（4）酶分子表面完全水化，被一層水分子覆蓋。第43頁酶活與水關(guān)系：酶活最大時——蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)動力學剛性和熱力學穩(wěn)定性（柔性）之間到達最正確平衡點?！皠?cè)岵辈灰粯用感杷坎灰粯油粋€酶在不一樣有機溶劑中需水量不一樣，溶劑疏水性越強，需水量越少第44頁胰脂肪酶活性與含水量關(guān)系：第45頁熱力學水活度指特定溫度和壓力條件下，反應體系中水摩爾分數(shù)Xw與水活度系數(shù)гw乘積：аw=гw*Xw水活度系數(shù)гw是溶劑疏水性函數(shù)，溶劑疏水性越大，гw越大。аw是在平衡狀態(tài)時，反應體系中各組分（酶、溶劑、底物和產(chǎn)物）аw是相同。第46頁第47頁研究水活度意義：最正確水活度與溶劑極性幾乎無關(guān)，大約在0.55左右能夠排除溶劑對最適含水量影響水活度可由反應體系中水蒸汽壓除以在相同條件下純水蒸汽壓而測得。第48頁取得恒定水活度方法：用一個飽和鹽水溶液分別預平衡底物溶液和酶制劑。向反應體系中直接加一個水合鹽向每一溶劑中加入不一樣量水第49頁添加劑對非水相生物催化反應影響改變微環(huán)境條件；影響溶解和分散情況，降低傳質(zhì)阻力；也會增加反應體系復雜性。無機鹽類添加劑；有機助溶劑；多醇類添加劑；表面活性劑。第50頁有機溶劑中酶擴散與可取得性酶顆粒對底物含有擴散限制；相鄰酶分子之間存在屏蔽現(xiàn)象。結(jié)構(gòu)改變有機溶劑輕易使酶構(gòu)象發(fā)生改變底物去溶劑化和過渡態(tài)穩(wěn)定化能量學酶與底物結(jié)合過程所包括難易程度構(gòu)象可塑性酶分子結(jié)構(gòu)適當改變靈活性pH第51頁pH記憶現(xiàn)象在水溶液中：pH決定酶離子化狀態(tài)，從而影響酶構(gòu)象，而酶構(gòu)象又關(guān)系到酶活性和選擇性；在有機溶劑中酶不能電離，所以必須進行預處理：將酶先溶解在少許最適pH值緩沖溶液中，然后沉淀或凍干。這么能夠保持酶最正確電離狀態(tài)，被稱為“pH記憶”。從最適pH值水溶液中沉淀酶在有機溶劑介質(zhì)中也表現(xiàn)出較高酶活性，有時可提升一個數(shù)量級。第52頁離子強度影響伴隨凍干時用緩沖溶液離子強度增大，酶活會增大。第53頁第54頁制訂固定催化劑方法凍干粉末固定化酶在有機溶劑中直接沉淀増溶酶第55頁非水相生物催化主要特點有利于許多新酶促反應發(fā)生無水環(huán)境下沒有可造成酶失活共價反應，同時酶剛性增強。溶劑對酶選擇性含有調(diào)控作用“分子記憶”、“印跡”現(xiàn)象、經(jīng)過暫時增大底物分子體積增加酶對映選擇性第56頁酶非水相催化應用手性藥品拆分生物能源手性高分子聚合物制備酚樹脂合成導電有機聚合物合成食品添加劑生產(chǎn)甾體轉(zhuǎn)化第57頁酶催化反應應用脂肪酶肽合成青霉素G前體肽合成酯合成醇與有機酸合成酯類轉(zhuǎn)酯各種酯類生產(chǎn)聚合二酯選擇性聚合?；蚀减；鞍酌鸽暮铣珊铣啥嚯孽；穷愼；u基化酶氧化甾體轉(zhuǎn)化過氧化物酶聚合酚類、胺類化合物聚合多酚氧化酶氧化芳香化合物羥