T-CRHA 052-2024 基于人源肝臟類器官的藥物肝臟毒性評價(jià)技術(shù)

ICS11.100CCSC04團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)Evaluationofdrug-inducedhepatotoxicitybasedonhumanliverorg中國研究型醫(yī)院學(xué)會發(fā)布IT/CRHA052—2024前言 Ⅱ Ⅲ 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14縮略語 25一般規(guī)定 26評價(jià)內(nèi)容及流程 57評價(jià)報(bào)告及結(jié)果解釋 附錄A（資料性）S藥物的肝臟毒性評價(jià)實(shí)驗(yàn)方案 附錄B（資料性）S藥物的肝臟毒性評價(jià)報(bào)告 參考文獻(xiàn) T/CRHA052—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本文件由中國研究型醫(yī)院學(xué)會肝膽胰外科專業(yè)委員會提出。本文件由中國研究型醫(yī)院學(xué)會歸口。本文件起草單位：清華大學(xué)附屬北京清華長庚醫(yī)院、中國食品藥品檢定研究院、中國計(jì)量科學(xué)研究院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所、中國科學(xué)院上海藥物研究所、南方醫(yī)科大學(xué)、上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司。本文件主要起草人：王韞芳、柳娟、陰雯臻、李迪、耿興超、王晶、傅博強(qiáng)、強(qiáng)桂芬、潘國宇、彭雙清、李樺、畢惠嫦。T/CRHA052—2024藥物不良反應(yīng)是一個(gè)重要的臨床問題，也是衛(wèi)生系統(tǒng)的主要經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和制藥行業(yè)面臨的巨大挑戰(zhàn)。藥源性肝損傷（drug—inducedliverinjury，DILI）是臨床上最常見的藥物不良反應(yīng)之一，也是當(dāng)前急性肝損傷最為常見的病因之一，嚴(yán)重者可導(dǎo)致急性肝衰竭、甚至死亡。目前的臨床前藥物試驗(yàn)程序難以有效的預(yù)測患者是否發(fā)生DILI，評價(jià)模型和技術(shù)的缺乏是造成藥物研發(fā)失敗率高的主要原因。采用合理、有效的模型預(yù)測藥物-藥物相互作用及潛在DILI是制藥領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻科學(xué)挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)二維培養(yǎng)的肝細(xì)胞（系）模型過于簡單、不具備生理特性而無法再現(xiàn)藥物體內(nèi)發(fā)生的相對復(fù)雜的代謝與毒性事件，而人源肝臟類器官作為藥物代謝及藥物毒性預(yù)測的模型，能夠更真實(shí)地反映候選藥物對人體的影響，同時(shí)可以減少動物研究所致的偏差。近期，美國食品藥品監(jiān)督管理局發(fā)布了減少藥物臨床試驗(yàn)前的動物試驗(yàn)，而鼓勵(lì)微組織與器官芯片列為替代模型的指導(dǎo)原則。實(shí)際上，人源肝臟類器官模型已有許多公司和機(jī)構(gòu)用于藥物篩選及評價(jià)，但其發(fā)展仍存在一些技術(shù)規(guī)范障礙。本文件的制定有助于推動基于人源肝臟類器官的藥物肝臟安全性評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)，助力行業(yè)規(guī)范發(fā)展。T/CRHA052—2024基于人源肝臟類器官的藥物肝臟毒性評價(jià)技術(shù)【警示】使用本文件的人員應(yīng)有正規(guī)實(shí)驗(yàn)室工作的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。本文件并未指出所有可能的安全問題。使用者有責(zé)任采取適當(dāng)?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關(guān)法規(guī)規(guī)定的條件。本文件給出了基于人源肝臟類器官開展藥物體外肝臟毒性評價(jià)的一般規(guī)定、評價(jià)內(nèi)容及流程、評價(jià)報(bào)告及結(jié)果解釋要求。本文件適用于醫(yī)藥企業(yè)、科研機(jī)構(gòu)等試驗(yàn)人員開展基于人源肝臟類器官肝細(xì)胞脂肪變和膽汁淤積相關(guān)的藥物肝臟毒性評價(jià)。本文件的試驗(yàn)方法適用于96孔板。其它孔數(shù)的多孔板可參考本文件。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T16886.5—2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（ISO10993-5:2009）T/CSCB0008—2021原代人肝細(xì)胞3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1人源肝臟類器官humanliverorganoid通過多能干細(xì)胞、組織前體細(xì)胞或者成體細(xì)胞，依靠細(xì)胞自組裝能力構(gòu)建的三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)，它具備類似于人類肝臟的生理結(jié)構(gòu)和功能，并能提供更準(zhǔn)確和可靠的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。注：人源肝臟類器官可被用于評估藥物對人肝臟的毒性影響，可以更好地預(yù)測藥物的代謝途徑、藥效和毒性反應(yīng)。3.2藥源性肝損傷drug-inducedliverinjury；DILI由藥物及其代謝物引起的肝細(xì)胞損傷和/或壞死，進(jìn)而導(dǎo)致肝酶升高、黃疸、肝功能衰竭等肝功能異常表現(xiàn)。3.3肝臟毒性評價(jià)hepatotoxicityevaluation用來評估某種物質(zhì)或藥物對肝臟功能的潛在危害程度的過程。這種評價(jià)可以通過多種方法進(jìn)行，包括體外實(shí)驗(yàn)、動物模型和臨床觀察。3.4劑量反應(yīng)關(guān)系dose-responserelationship藥物暴露劑量與生物效應(yīng)之間的關(guān)系，通常使用劑量反應(yīng)曲線來描述。2T/CRHA057—20243.5對照組controlgroup在進(jìn)行肝臟毒理學(xué)評價(jià)時(shí)，為便于與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較而設(shè)立的一組參照物質(zhì)或?qū)嶒?yàn)樣本。它是一種不含受試物的介質(zhì)，在進(jìn)行受試物處理時(shí)放置于與試驗(yàn)樣品相同的器皿中，并在與試驗(yàn)樣品相同的條件下進(jìn)行處理。3.6實(shí)驗(yàn)樣本experimentalsample在肝臟毒理學(xué)評價(jià)中用于進(jìn)行分析、觀察和驗(yàn)證的被測試物質(zhì)或物體的代表性樣品。3.7溶劑空白solventblank為檢測實(shí)驗(yàn)中可能產(chǎn)生的背景噪音或誤差而設(shè)置的，不含待測物或?qū)φ掌返慕橘|(zhì)，用以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。[來源：GB/T16886.5—2017，3.3，有修改]4縮略語下列縮略語適用于本文件。ALB——白蛋白（Albumin）ALT——谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alaninetransaminase）AOP——有害結(jié)局路徑（Adverseoutcomepathway）AST——谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartatetransaminase）CMFDA——5-氯甲基熒光素醋酸酯（5-chloromethylfluoresceindiacetate）CYPs——細(xì)胞色素酶P450（CytochromeP450enzymesystem）DMOS——二甲基亞砜（DimethylSulfoxide）FBS——胎牛血清(Fetalbovineserum)GSH——谷胱甘肽（Glutathione）HCS——高內(nèi)涵篩選（Highcontentscreening）MMP——線粒體膜電位（Mitochondrialmembranepotential）P/S——青霉素-鏈霉素（Penicillin-Streptomycin）ROS——活性氧（Reactiveoxygenspecies）5一般規(guī)定5.1試劑試劑選擇如下：a）細(xì)胞活力檢測試劑應(yīng)使用細(xì)胞活力檢測試劑盒；b）生化指標(biāo)檢測試劑應(yīng)使用谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)試劑盒和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)試劑盒；c）生化指標(biāo)檢測試劑宜根據(jù)肝臟損傷的毒性結(jié)局類型，優(yōu)先推薦檢測細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡、脂肪性病變和膽汁淤積4個(gè)肝毒性評價(jià)指標(biāo)，主要檢測指標(biāo)及對應(yīng)檢測試劑見下表1。T/CRHA052—2024表1HCS試驗(yàn)中熒光探針選擇注：通常選用幾個(gè)終點(diǎn)組合以獲得最準(zhǔn)確的DILI檢測結(jié)果，針對不同的檢測指標(biāo)選用不同的熒光染料，在同時(shí)檢測多個(gè)肝毒性評價(jià)指標(biāo)時(shí)，要求每種熒光染料的激發(fā)波長5.2材料和培養(yǎng)器皿5.2.1人源肝臟類器官的細(xì)胞人源肝臟類器官的細(xì)胞應(yīng)選用來源于肝細(xì)胞系（包括但不限于Huh7，HepG2-C3A，LO2，HepaRG）、原代肝細(xì)胞、原代肝細(xì)胞衍生的肝細(xì)胞、干細(xì)胞分化來源的肝細(xì)胞等新型肝細(xì)胞體系,包括但不限于:——胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化來源的肝細(xì)胞;——直接轉(zhuǎn)分化肝細(xì)胞;——退分化形成的肝細(xì)胞ProliHH。5.2.2待測藥物待測藥物的準(zhǔn)備應(yīng)按《人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會ICH三方協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則》，其工作時(shí)的最高濃度設(shè)置應(yīng)符合以下要求：——不受溶媒或培養(yǎng)液中的溶解度限制時(shí)，最高濃度是1mM或0.5mg/ml（選擇其中較低者）；——受到溶解度限制時(shí)，最高濃度應(yīng)采用培養(yǎng)液中產(chǎn)生最少可見沉淀的最低濃度（若其不干擾評分）。通過肉眼或光鏡檢查等方法對沉淀進(jìn)行評價(jià)，來說明在培養(yǎng)過程中沉淀持續(xù)存在或出現(xiàn)（至給藥結(jié)束）。5.2.3培養(yǎng)細(xì)胞所需溶液應(yīng)選取適當(dāng)配方的、含有必需營養(yǎng)物和輔助因子的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于支持人源肝臟類器官的生長和維持，包括：——0.05%胰蛋白酶-EDTA用于人源肝臟類器官的釋放和分離?！姿峋彌_液（PBS）用于洗滌和處理人源肝臟類器官樣本?！麴s水（或任何適合細(xì)胞培養(yǎng)的純化水）用于制備培養(yǎng)基、溶液和洗滌人源肝臟類器官。5.2.4培養(yǎng)器皿應(yīng)選用適用于細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，包括但不限于：——玻璃培養(yǎng)皿——塑料培養(yǎng)瓶或塑料多孔培養(yǎng)板——微量滴定板——96孔組織細(xì)胞培養(yǎng)級孔板。注：只要符合組織培養(yǎng)的要求，并可以用于動物細(xì)胞的培養(yǎng)，其他孔板（如384孔板、24孔板和6孔板）也可以替代使用。5.3儀器5.3.1培養(yǎng)箱穩(wěn)定的溫度（37℃)、穩(wěn)定的CO2水平（5%）、較高的相對飽和濕度（95%）。4T/CRHA057—20245.3.2多功能酶標(biāo)儀適用于96孔板培養(yǎng)器皿、波長范圍：400-1000nm、帶有發(fā)光檢測模塊。5.3.3高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)或熒光顯微鏡高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)或熒光顯微鏡應(yīng)符合以下要求：——高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)，包括全自動高速顯微成像、全自動圖像分析和數(shù)據(jù)管理?！獰晒怙@微鏡，包括光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)?！到y(tǒng)和顯微鏡的激發(fā)波長范圍為355-675nm，發(fā)射波長范圍為430-760nm。5.3.4離心機(jī)應(yīng)符合以下要求：——加速度大于等于2000rcf；——離心力1,000~10,000rcf。5.3.5超凈工作臺或生物安全柜應(yīng)提供高效的環(huán)境凈化，包括無菌空氣過濾、消毒和防護(hù)機(jī)制，以確保細(xì)胞培養(yǎng)過程中的無菌操作和確保細(xì)胞及操作者的生物安全。5.3.6倒置相差顯微鏡應(yīng)具有高分辨率和高清晰度（10倍、20倍、40倍或60倍物鏡），能夠顯示微小組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞；配備有高質(zhì)量物鏡和目鏡。5.3.7實(shí)驗(yàn)室天平應(yīng)使用電子式天平，量程為0.1mg~200g，分度值不大于1mg。5.3.8電子細(xì)胞計(jì)數(shù)儀或血細(xì)胞計(jì)數(shù)器應(yīng)能夠快速、精準(zhǔn)地計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，并具備高度重復(fù)性和準(zhǔn)確性。5.4準(zhǔn)備工作5.4.1評價(jià)方案準(zhǔn)備開展藥物肝臟毒性評價(jià)前應(yīng)制定評價(jià)實(shí)驗(yàn)方案，方案內(nèi)容及格式參見附錄A。5.4.2測試用試劑準(zhǔn)備5.4.2.1CTG試劑盒應(yīng)按以下步驟準(zhǔn)備：1)將試劑盒放置在4℃過夜，使試劑緩慢解凍；2)在使用前將試劑置于22℃水浴中約30min，將其溫度平衡至室溫；3)顛倒內(nèi)容物輕輕混勻，以獲得均質(zhì)溶液。5.4.2.2ALT和AST試劑應(yīng)按以下步驟準(zhǔn)備：1)使用前將試劑置于37℃水浴中預(yù)熱約30min；2)顛倒內(nèi)容物輕輕混勻，以獲得均質(zhì)溶液。5.4.3CalceinAM/EthD-1試劑應(yīng)按以下步驟準(zhǔn)備：1)-20℃避光保存，2)使用前用預(yù)熱好的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲存液配制2μMCalceinAM和4μMEthD-I的染色工作液。5.4.4Caspase-3/7試劑應(yīng)按以下步驟準(zhǔn)備：1)用DMSO配制2mM儲存液；2)使用前用預(yù)熱至37℃的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲存液，終濃度為200nM。5.4.5NileRed試劑應(yīng)按以下步驟準(zhǔn)備：1)用DMSO配制1mM儲存液；2)使用前用預(yù)熱好的無血清細(xì)胞培養(yǎng)基或PBS稀釋儲存液，終濃度為200-1000nM。5T/CRHA052—20245.4.6CMFDA試劑應(yīng)按以下步驟準(zhǔn)備：1)用DMSO配制10mM儲存液；2)使用前用無血清培養(yǎng)基稀釋儲存液至工作液濃度（0.5-25μM并將探針工作液于37℃預(yù)熱。5.4.7待測藥物準(zhǔn)備應(yīng)按以下步驟準(zhǔn)備：——根據(jù)藥物說明書，使用適當(dāng)?shù)娜軇⒋郎y藥物完全溶解，配置成一定濃度的儲備液；——通過文獻(xiàn)檢索等方式，確認(rèn)待測藥物的最佳濃度范圍，并在此范圍內(nèi)至少設(shè)計(jì)5個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)對照組；——如果藥物需冷凍儲存，避免3-4個(gè)以上的冷凍/融化周期；——準(zhǔn)備不含藥物的對應(yīng)溶劑用于溶劑空白對照。5.4.8儀器準(zhǔn)備在測定前確保酶標(biāo)儀讀數(shù)的一致性、高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)或熒光顯微鏡等儀器運(yùn)行正常。6評價(jià)內(nèi)容及流程6.1DILI肝毒性評價(jià)指標(biāo)主要的DILI肝毒性評價(jià)指標(biāo)包括：——細(xì)胞活性。通過評估細(xì)胞活性，可以了解藥物對肝細(xì)胞代謝活力和功能狀態(tài)的影響，若細(xì)胞的活力低于對照空白組的70%，則可以推斷該藥物可能具有潛在的細(xì)胞毒性效應(yīng)，并據(jù)此來衡量它對肝細(xì)胞生存力的具體損害程度；——生化指標(biāo)。生化指標(biāo)ALT和AST是反映細(xì)胞受損程度的重要指標(biāo)，可評估其對肝臟健康的潛在影響；——細(xì)胞活率。細(xì)胞活死評估通過考慮細(xì)胞死亡和存活的比例，能夠評估藥物對肝細(xì)胞的毒性效應(yīng)；——細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的程度可以衡量細(xì)胞程序性死亡的程度，是肝毒性的重要指標(biāo)之一；——脂肪變性。反映肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂的指標(biāo)，藥物引起的脂肪變性可能與肝臟損傷相關(guān)；——膽汁淤積。膽汁淤積相關(guān)的指標(biāo)對于鑒別是否存在膽道系統(tǒng)的損傷以及病情嚴(yán)重程度具有重要意義?！谠u價(jià)藥物肝毒性時(shí)，還需要考慮其他因素，例如藥物代謝能力、細(xì)胞通透性和藥物在體內(nèi)的輸送等。6.2操作流程藥物對人源肝臟類器官的毒性特征主要通過細(xì)胞活力讀數(shù)，生化指標(biāo)，以及細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡、脂肪變性和膽汁淤積這4個(gè)評價(jià)指標(biāo)來進(jìn)行表征。流程如圖1所示。6T/CRHA057—2024圖1操作流程6.3人源肝臟類器官培養(yǎng)板準(zhǔn)備6.3.1選用的人源肝臟類器官應(yīng)符合T/CSCB0008-2021中5.2要求，肝細(xì)胞的基礎(chǔ)形態(tài)與功能屬性，比如蛋白質(zhì)分泌、代謝解毒等，應(yīng)達(dá)到必要的安全標(biāo)準(zhǔn)。合格的人源肝臟類器官應(yīng)滿足以下條件：a)ALB陽性細(xì)胞比例≥90%，同時(shí)HNF4A陽性細(xì)胞比例≥90%；b)白蛋白分泌≥800ng/(106細(xì)胞/24h)；c)藥物代謝酶功能活躍，以CYP3A4為例，其對6-OH睪酮的內(nèi)在清除率需不低于100μL/(106細(xì)胞/h)；d)經(jīng)檢測確認(rèn)，無細(xì)菌、真菌、支原體污染，并且對HIV、HAV、HBV、HCV、HTLV、EBV、HCMV、TP等均為陰性。6.3.2將符合要求的人源肝臟類器官接種于96孔板，應(yīng)確保每孔接種細(xì)胞的一致性，每孔200μl培養(yǎng)基，確認(rèn)人源肝臟類器官的細(xì)胞生長狀態(tài)良好。6.3.3人源肝臟類器官培養(yǎng)板的布局應(yīng)按以下要求操作：a）96孔板的邊緣孔不接種細(xì)胞，并加入100μl的PBS，防止培養(yǎng)基蒸發(fā)，影響人源肝臟類器官的生長以及影響待測藥物的濃度；b）如圖2所示，在板①的第二列中，只加入培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度的待測藥物，不加入細(xì)胞。同樣地，在第九列中，只加入培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度的陰性藥物，不加入細(xì)胞，作為溶劑空白樣本。這樣做的目的是為了排除待測藥物可能產(chǎn)生的背景噪音。c）板②中除邊緣孔，均加細(xì)胞，如圖3所示。注：其中板①中涉及到的無肝毒性藥物（陰性藥物）主要包括：阿司匹林(Aspirin,ASP)、安倍生坦(Ambrisentan,AMB)、普萘洛爾(Propranolol,PRO)、華法林(Warfarin,WAR)、羅格列酮(Rosiglitazone,RLZ)等。圖2人源肝臟類器官培養(yǎng)板布局——板①T/CRHA052—2024圖3人源肝臟類器官培養(yǎng)板布局——板②6.4藥物處理人源肝臟類器官6.4.1設(shè)計(jì)待測藥物加樣板待測藥物加樣板的基本設(shè)計(jì)見圖4、圖5。每孔200μl的待測藥物，第二行為對照組，只加不含藥物的培養(yǎng)基；從第三行至第七行為藥物由低到高的5個(gè)濃度梯度（具體濃度梯度要根據(jù)該藥物的實(shí)際使用濃度來設(shè)置）。圖4待測藥物加樣板布局——板①圖5待測藥物加樣板布局——板②6.4.2藥物處理人源肝臟類器官應(yīng)按以下步驟操作：1）用200μl的吸頭將人源肝臟類器官培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基吸走100μl；2）按圖4和5所示，每孔加入100μl相應(yīng)的2倍濃度的藥物溶液；3）將加入藥物的加樣板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。4）24h后，用顯微鏡或高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)在明場下檢查人源肝臟類器官，觀察并記錄其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形狀、細(xì)胞核形態(tài)、組織密度以及組織的完整性。注：不同時(shí)間的三次重復(fù)試驗(yàn)，藥物溶液需要重新配制。8T/CRHA057—20246.5細(xì)胞活力檢測試劑處理細(xì)胞6.5.1添加CTG試劑應(yīng)按下列步驟加入CTG試劑：a)準(zhǔn)備不透明壁多孔板，多孔板必須與所用的發(fā)光檢測儀兼容；b)吸取待測藥物加樣板（板①)第二列至第五列，以及第九列至第十一列中100μl含有人源肝臟類器官的藥物溶液加入不透明壁多孔板對應(yīng)的孔中；c)將板及其內(nèi)容物平衡至室溫（22–25℃)約30min；d)添加與每孔中待測藥物溶液等體積（100μl）的CTG試劑；e)充分混合5min，使細(xì)胞裂解；f)將培養(yǎng)板在室溫再孵育25min，以穩(wěn)定發(fā)光信號。6.5.2測量CTG發(fā)光值應(yīng)按下列步驟使用酶標(biāo)儀測量CTG發(fā)光值：a)在每個(gè)待測孔中確保沒有氣泡。b)設(shè)置酶標(biāo)儀，以記錄每個(gè)待測孔的發(fā)光值。c)確定背景發(fā)光值，記錄第二列不含有細(xì)胞只含培養(yǎng)基的對照孔的發(fā)光值。d)確定讀數(shù)時(shí)間，每孔整合讀數(shù)時(shí)間設(shè)為（0.25-1）s可作為設(shè)置參考。e)等待適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)時(shí)間，以便反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)，然后記錄每個(gè)孔的發(fā)光值。6.6測定生化指標(biāo)ALT和AST轉(zhuǎn)移酶6.6.1ALT/AST標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)按照以下步驟制備ALT/AST標(biāo)準(zhǔn)曲線：a)準(zhǔn)備一系列濃度的丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為0、2、4、6、8、10μmol/L。每個(gè)濃度配制20ml。b)在96孔板中按照以下順序加入試劑：——每孔加入0.1mol/L磷酸緩沖液5μl；——按照濃度梯度，每孔分別加入2μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl；——每孔加入基質(zhì)緩沖液18μl、16μl、14μl、12μl、10μl；——每孔加入2,4-二硝基苯肼20μl。c)將96孔板輕輕水平搖動，使溶液混合均勻。d)室溫放置15min。e)使用酶標(biāo)儀測量每個(gè)孔在波長為510nm時(shí)的吸光度值。6.6.2數(shù)據(jù)處理各孔吸光度減去零孔吸光度，所得差值為絕對OD值作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的丙酮酸鈉濃度作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。6.6.3細(xì)胞上清中ALT和AST測定應(yīng)按照以下步驟測定細(xì)胞上清中ALT和AST：a)準(zhǔn)備酶標(biāo)儀檢測板。b)向酶標(biāo)儀檢測板的測定孔和對照孔中加入20μL已預(yù)溫至37°C的ALT或AST基質(zhì)液，將5μL待測藥物加樣板（板①)第六列至第八列中的待測上清加入測定孔中，混勻后在37°C下孵育30min。c)向每個(gè)孔中加入20μL二硝苯肼液，對照孔中加入5μL待測藥物加樣板（板①)第六列至第八列中的待測上清，混勻后在37°C下孵育20min。d)向每個(gè)孔中加入200μL濃度為0.4mol/L的氫氧化鈉溶液，混勻后在室溫下孵育15min。T/CRHA052—2024e)在波長為510nm的條件下，使用酶標(biāo)儀測定各個(gè)樣品孔的光密度（OD）值。6.7評價(jià)藥物肝臟毒性6.7.1利用熒光分子探針孵育人源肝臟類器官待測藥物與人源肝臟類器官共培養(yǎng)24h以后，用PBS洗滌1次，為防止人源肝臟類器官的損失，每孔剩余100μl的PBS。加入探針染料，按下列步驟進(jìn)行染色:a）Live/dead染色1）在藥物加樣板（見圖5，板②)的第二列至第四列加入100μl含2×的CalceinAM探針（2μM）和EthD-1探針（4μM）的無血清培養(yǎng)基37℃(避光)孵育30min；2）用無熒光探針的空白培養(yǎng)基進(jìn)行多次重復(fù)半數(shù)換液操作以去除未結(jié)合游離探針的干擾；3）每孔加入100μl含2×的Hoechst（10μg/ml）的無血清培養(yǎng)基37℃(避光)孵育10min。b）Caspase-3/7和NileRed染色1）在藥物加樣板（見圖5，肝臟毒性檢測板）的第五列至第七列加入100μl含2×的Caspase-3/7探針（200nM）和NileRed探針（5μM）的無血清培養(yǎng)基37℃(避光)孵育30min；2）用無熒光探針的空白培養(yǎng)基進(jìn)行多次重復(fù)半數(shù)換液操作以去除未結(jié)合游離探針的干擾；3）每孔加入100μl含2×的Hoechst（10μg/ml）的無血清培養(yǎng)基37℃(避光)孵育10min。c）CMFDA染色1）在藥物加樣板（見圖5，肝臟毒性檢測板）的第八列至第十一列加入100μl含2×的CMFDA探針（30μM）的無血清培養(yǎng)基37℃(避光)孵育30min；2）用無熒光探針的空白培養(yǎng)基進(jìn)行多次重復(fù)半數(shù)換液操作以去除未結(jié)合游離探針的干擾；3）在無血清培養(yǎng)基中孵育45min；4）每孔加入100μl含2×的Hoechst（10μg/ml）的無血清培養(yǎng)基37℃(避光)孵育10min。6.7.2洗滌細(xì)胞用無熒光探針的空白培養(yǎng)基進(jìn)行多次重復(fù)半數(shù)換液操作以去除未結(jié)合游離探針的干擾。6.7.3采集熒光圖像使用高內(nèi)涵細(xì)胞定量成像分析系統(tǒng)或熒光顯微鏡的對應(yīng)通道對人源肝臟類器官進(jìn)行成像，其中CalceinAM的激發(fā)波長/發(fā)射波長為495/515nm、EthD-1的激發(fā)波長/發(fā)射波長為495/635nm、Caspase-3/7的激發(fā)波長/發(fā)射波長為502/530nm、NileRed的激發(fā)波長/發(fā)射波長為543/598nm，CMFDA的激發(fā)波長/發(fā)射波長為492/517nm，Hoechst的激發(fā)波長/發(fā)射波長為346/460nm。6.8數(shù)據(jù)分析6.8.1細(xì)胞活力分析a）計(jì)算CTG法細(xì)胞相對活力，見公式（1RCV=(FI加藥組-FI空白)/(FI對照組-FI空白]×100%………………式中:RCV：細(xì)胞相對活力；FI加藥組：具有細(xì)胞、CTG試劑和藥物溶液的孔的發(fā)光值；FI空白：具有培養(yǎng)基和CTG試劑而沒有細(xì)胞的孔的發(fā)光值；FI對照組：具有細(xì)胞、CTG試劑而沒有藥物溶液的孔的發(fā)光值；b）使用Excel或GraphPadPrism繪制每種藥物的樣品劑量反應(yīng)關(guān)系曲線。6.8.2生化指標(biāo)分析6.8.2.1計(jì)算細(xì)胞上清ALT1）根據(jù)6.6.1中所測標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照試劑盒說明書提供的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算；T/CRHA057—20242）使用Excel或GraphPadPrism繪制每種藥物的樣品劑量反應(yīng)關(guān)系曲線。6.8.2.2計(jì)算細(xì)胞上清AST1）根據(jù)6.6.1所測標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照試劑盒說明書提供的計(jì)算方法進(jìn)行計(jì)算；2）使用Excel或GraphPadPrism繪制每種藥物的樣品劑量反應(yīng)關(guān)系曲線。6.8.3多參數(shù)分析6.8.3.1使用高內(nèi)涵圖像分析軟件或者ImageJ軟件定量每個(gè)視野下各通道（CalceinAM、EthD-1、NileRed、Caspase-3/7、CMFDA和Hoechst）陽性（染色）細(xì)胞的數(shù)量和熒光強(qiáng)度，至少計(jì)數(shù)25個(gè)視野。應(yīng)計(jì)算以下內(nèi)容：1）計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量與死細(xì)胞數(shù)量的百分比，見公式（2式中：X：活細(xì)胞數(shù)量與死細(xì)胞數(shù)量的百分比；NCalceinAM_PC：活細(xì)胞數(shù)量；NEthD1PC：死細(xì)胞數(shù)量。2）計(jì)算Caspase-3/7陽性（染色）細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，見公式（3式中：FICaspase-3/7+：Caspase-3/7陽性（染色）細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；FICaspase-3/7總：Caspase-3/7陽性細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度；S：微組織的面積。3）計(jì)算NileRed陽性（染色）細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，見公式（4式中：FINileRed+：NileRed陽性（染色）細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；FINileRed總：NileRed陽性細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度；S：微組織的面積。4)計(jì)算CMFDA陽性（染色）細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，見公式（5式中：FICMFDA+：CMFDA陽性（染色）細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；FICMFDA總：CMFDA陽性細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度；S：微組織的面積。6.8.3.2計(jì)算陽性細(xì)胞的百分比和陽性細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度（以為x-±s表示），并用Excel或GraphPadPrism繪制待測藥物的樣品劑量反應(yīng)關(guān)系曲線。7評價(jià)報(bào)告及結(jié)果解釋7.1評價(jià)報(bào)告應(yīng)記錄藥物評價(jià)試驗(yàn)相關(guān)信息，撰寫評價(jià)報(bào)告，評價(jià)報(bào)告內(nèi)容和格式參見附錄B，評價(jià)報(bào)告內(nèi)容包括但不限于：a)試驗(yàn)概述，包括對肝臟毒性評價(jià)的基本目的和原則的闡述，以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的相關(guān)信息。b)藥物信息，包括藥物的名稱、理化性狀、配制方法和所用濃度等。T/CRHA052—2024c)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，詳細(xì)描述人源肝臟類器官的制備過程，藥物的種類、濃度以及試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)間等信息，以確保試驗(yàn)的科學(xué)性和可靠性。d)試驗(yàn)方法，簡述肝臟毒性評價(jià)的操作步驟和所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，以及結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。e)測定指標(biāo)及設(shè)備，詳細(xì)列出本試驗(yàn)中測定的各指標(biāo)，包括細(xì)胞活力讀數(shù)，生化指標(biāo)，以及細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡、脂肪變性和膽汁淤積這四種染色評價(jià)指標(biāo)的測定方法及主要檢測儀器的名稱和型號。f)檢測結(jié)果，用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)表格列出各項(xiàng)指標(biāo)的測定結(jié)果，包括細(xì)胞活力讀數(shù)，生化指標(biāo)，以及細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡、脂肪變性和膽汁淤積四種染色評價(jià)指標(biāo)的結(jié)果。g)評價(jià)結(jié)果解讀，對所使用的藥物對人源肝臟類器官的毒性進(jìn)行合理解釋，包括對毒性機(jī)制進(jìn)行分析和討論，并提出所得結(jié)論。h）其它，包括貢獻(xiàn)者、參考文獻(xiàn)等內(nèi)容。7.2結(jié)果解釋應(yīng)從試驗(yàn)結(jié)果給出藥物對人源肝臟類器官毒性影響結(jié)論，解釋肝臟損傷與劑量響應(yīng)關(guān)系。給出毒性具體表現(xiàn)及肝臟減毒反應(yīng)，解釋藥物對肝臟表現(xiàn)出的劑量依賴關(guān)系的毒性作用。T/CRHA057—2024（資料性）S藥物的肝臟毒性評價(jià)實(shí)驗(yàn)方案A.1實(shí)驗(yàn)概述本實(shí)驗(yàn)以HepaRG細(xì)胞三維培養(yǎng)形成的人源肝臟類器官為例，針對藥物S進(jìn)行肝臟毒性評價(jià)的實(shí)驗(yàn)需求，擬定如下具體操作方案。通過此評價(jià)，旨在充分了解S藥物對人體肝臟的潛在毒性，并為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供實(shí)證支持。A.2材料和方法A.2.1概述用此標(biāo)準(zhǔn)評估S藥物對人源肝臟類器官的肝臟毒性作用。A.2.2試劑A.2.2.1細(xì)胞活力檢測試劑CellTiter-Glo?LuminescentCellViabilityAssay(CellTiter-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒，簡稱CTG)A.2.2.2谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)試劑盒和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)試劑盒A.2.2.3用于細(xì)胞影像檢測肝毒性篩選的檢測試劑檢測指標(biāo)Detectionindicator熒光探針Fluorescentprobe激發(fā)波長/發(fā)射波長Excitationwavelength/emissionwavelength細(xì)胞活率CalceinAMEthD-1495/515nm（green）495/635nm（red）細(xì)胞凋亡Caspase-3/7502/530nm(green)脂滴面積與微組織面積的比值；脂滴總熒光強(qiáng)度與微組織面積的比值NileRed543/598nm(red)形成的微膽管面積與微組織面積的比值；微膽管平均熒光強(qiáng)度CMFDA492/517nm(green)A.2.3材料a）構(gòu)建人源肝臟類器官的細(xì)胞：HepaRG，無支原體污染b）待測藥物：S藥物c）Williams’EMedium培養(yǎng)基(不含谷氨酰胺)d）FBS（胎牛血清）e）青霉素f）鏈霉素T/CRHA052—2024g）0.05%胰蛋白酶-EDTAh）磷酸緩沖液（PBS）i）蒸餾水或任何適合細(xì)胞培養(yǎng)的純化水j)谷氨酰胺k)胰島素l)氫化可的松A.2.4儀器見第7章。A.3準(zhǔn)備工作A.3.1概述所有涉及的溶劑(培養(yǎng)基以外)、玻璃器皿及其他實(shí)驗(yàn)材料都應(yīng)進(jìn)行滅菌處理，以防止細(xì)菌和其他微生物的污染。此外，所有操作都必須在無菌條件下，使用符合生物安全標(biāo)準(zhǔn)的無菌操作臺進(jìn)行，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果不受到外界干擾因素的影響。A.3.2培養(yǎng)基用于培養(yǎng)HepaRG細(xì)胞系和人源肝臟類器官的培養(yǎng)基：——10%胎牛血清（FBS）;——90%DMEM；——100IU/mL青霉素；——100μg/mL鏈霉素;——2mM谷氨酰胺;——5μg/mL胰島素;——0.5mM氫化可的松。A.3.3細(xì)胞培養(yǎng)A.3.3.1細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)a)從冷凍細(xì)胞庫中取出需要恢復(fù)的細(xì)胞樣本，并放置于低溫水浴中快速融解；b)將融解后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有適當(dāng)培養(yǎng)基的離心管中，并進(jìn)行短暫離心使細(xì)胞沉淀在離心管底部，去除上清液；c)用5ml培養(yǎng)基(10%FBS)重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到10cm的培養(yǎng)皿中，放置在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；d)每兩天用PBS洗三次細(xì)胞，并換液。注：復(fù)蘇后的第一代培養(yǎng)過程中，細(xì)胞可能生長緩慢。所以一旦復(fù)蘇，在實(shí)驗(yàn)之前細(xì)胞要傳代至少兩次。A.3.3.2細(xì)胞傳代a)用PBS洗滌3次細(xì)胞以去除細(xì)胞外活性物質(zhì)和培養(yǎng)基殘留。b)加入適量的胰酶，進(jìn)行細(xì)胞消化。在消化過程中控制消化時(shí)間，待細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)圓縮時(shí)停止消化，并加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基以終止消化。c)用吸管輕輕吹打細(xì)胞，將細(xì)胞從培養(yǎng)皿中吹打下來，并將細(xì)胞和培養(yǎng)基等混合物轉(zhuǎn)移至離心管中。注意避免吸入過多液體，以免影響后續(xù)離心效果。T/CRHA057—2024d)進(jìn)行輕柔的離心，一般建議采用400rcf離心2min的程序。過程中應(yīng)盡量避免離心速度太高，以減少對細(xì)胞的機(jī)械損傷。e)棄去上清液，用新鮮的培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，使細(xì)胞能夠恢復(fù)生長并繼續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。f)選擇1:4或1:5的比例來進(jìn)行傳代，以確保細(xì)胞在新的培養(yǎng)條件下能夠獲得更好的生長狀態(tài)。注：細(xì)胞傳代培養(yǎng)通常應(yīng)該控制傳代次數(shù)，不應(yīng)超過3個(gè)月，以避免細(xì)胞發(fā)生異常。A.3.3.3確保細(xì)胞生長狀態(tài)良好a)取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，采用一般傳代方法進(jìn)行消化，制成細(xì)胞懸液；b)計(jì)數(shù)，精確地將細(xì)胞分別接種于21～30個(gè)大小一致的培養(yǎng)瓶內(nèi)或培養(yǎng)孔（以24孔培養(yǎng)板為宜每瓶或孔細(xì)胞總數(shù)要求一致，加入培養(yǎng)液的量也要一致；c)每天取出3瓶（孔）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算均值。培養(yǎng)7天。d)以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸（對數(shù)），描繪在半對數(shù)座標(biāo)紙上，連接成曲線后即為該細(xì)胞的生長曲線，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出細(xì)胞生長規(guī)律，生長曲線斜率即為細(xì)胞生長速率。T/CRHA052—2024按照9.2章的步驟用不同濃度的待測S藥物處理人源肝臟類器官24h。用顯微鏡或高內(nèi)涵在明場下檢查人源肝臟類器官，記錄下細(xì)胞的狀態(tài)和形態(tài)。A.6評價(jià)S藥物對人源肝臟類器官的肝臟毒性作用a）按照9.4章使用細(xì)胞活力試劑CTG處理人源肝臟類器官，檢測人源肝臟類器官的活性。b）按照9.5章使用ALT和AST試劑盒檢測人源肝臟類器官的培養(yǎng)上清，檢測人源肝臟類器官的受損程度。c）按照9.6章使用CalceinAM探針和EthD-1探針、Caspase-3/7探針和NileRed探針，以及CMFDA探針處理人源肝臟類器官，利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)或熒光顯微鏡的對應(yīng)通道對人源肝臟類器官進(jìn)行成像，多參數(shù)評價(jià)藥物S的肝臟毒性。A.7數(shù)據(jù)采集及評價(jià)結(jié)果解讀見附錄B。T/CRHA057—2024（資料性）S藥物的肝臟毒性評價(jià)報(bào)告B.1試驗(yàn)概述本研究的主要目的是評估S藥物對人源肝臟類器官的肝臟毒性作用。以HepaRG培養(yǎng)出的人源肝臟類器官為實(shí)驗(yàn)對象，使用不同濃度的S藥物進(jìn)行處理，通過細(xì)胞活性檢測，以及細(xì)胞死亡、細(xì)胞凋亡、脂肪變性以及膽汁淤積等多參數(shù)評價(jià)方法，進(jìn)行全面的肝臟毒性評估。B.2藥物信息根據(jù)藥物說明書用培養(yǎng)基充分溶解S藥物到儲存濃度10mM。本試驗(yàn)中的使用濃度分別為：1.92μM,9.6μM,100μM,440μM,1500μM。B.3試驗(yàn)設(shè)計(jì)見A.4章。以下是用HepaRG培養(yǎng)的人源肝臟類器官的質(zhì)控結(jié)果：a.ALB陽性率：98%、HNF4A陽性率：95%；b.白蛋白分泌：1000ng/（106細(xì)胞/24h）;c.藥物代謝酶功能，內(nèi)在清除率：280μL/(106細(xì)胞/h)B.4試驗(yàn)方法見A.5-A.6章。B.5測定指標(biāo)及設(shè)備測定指標(biāo)見第10章。本試驗(yàn)中檢測用到的主要儀器是：高內(nèi)涵圖像采集分析工作站，T7820。使用OperattaHigh-ContentImagingSystem獲取細(xì)胞球圖像，harmonysoftware分析數(shù)據(jù)。B.6檢測結(jié)果B.6.1S藥物對人源肝臟類器官活性的影響通過用CellTiter-Glo?發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑盒檢測不同濃度的S藥物和ASP（陰性對照）對人源肝臟類器官的影響，結(jié)果如圖B.1所示，隨著S藥物濃度逐漸升高，細(xì)胞活力逐漸下降。S藥物的IC504242」S藥物 nASPB.6.2S藥物對人源肝臟類器官生化指標(biāo)的影響通過用ALT和AST檢測試劑盒檢測不同濃度的S藥物對人源肝臟類器官生化指標(biāo)的影響，結(jié)果如圖B.2所示，隨著S藥物濃度逐漸升高，ALT和AST釋放量顯著增加。T/CRHA052—202400010100100010101001000B.6.3多參數(shù)評價(jià)藥物的肝臟毒性為了探索S藥物相關(guān)的肝毒性的潛在損傷途徑，將人源肝臟類器官暴露于6種不同濃度的S藥物24h后，用選定的熒光探針染色用于高內(nèi)涵分析。基于獲得的共聚焦圖像，對3D層掃圖像多層疊加后計(jì)算每個(gè)參數(shù)的指標(biāo)。B.6.3.1S藥物對人源肝臟類器官細(xì)胞活率的影響用CalceinAM探針和EthD-1探針孵育不同濃度的S藥物處理的人源肝臟類器官，使用高內(nèi)涵成像并使用高內(nèi)涵分析軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖所示，隨著S藥物濃度逐漸升高，人源肝臟類器官中的活細(xì)胞與死細(xì)胞的比例顯著降低。B.6.3.2S藥物對人源肝臟類器官細(xì)胞凋亡和脂肪變性的影響用Caspase-3/7探針和NileRed探針孵育不同濃度的S藥物處理的人源肝臟類器官，使用高內(nèi)涵成像并使用高內(nèi)涵分析軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖所示，隨著S藥物濃度逐漸升高，人源肝臟類器官中的細(xì)胞凋亡和脂肪變性增加。B.6.3.3S藥物對人源肝臟類器官膽汁淤積的影響用CMFDA探針孵育不同濃度的S藥物處理的人源肝臟類器官，使用高內(nèi)涵成像并使用高內(nèi)涵分析軟件分析數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖所示，隨著S藥物濃度逐漸升高，人源肝臟類器官平均熒光強(qiáng)度顯著降低。T/CRHA057—2024B.7評價(jià)結(jié)果解讀從試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，S藥物對人源肝臟類器官具有顯著毒性，且肝臟損傷呈劑量響應(yīng)關(guān)系，即S藥物劑量越高，對肝臟造成的損害就越嚴(yán)重。這種毒性具體表現(xiàn)為細(xì)胞活性的降低、ALT和AST釋放量增加、活細(xì)胞與死細(xì)胞的比例變化、凋亡細(xì)胞和脂肪變性細(xì)胞數(shù)量的增加以及膽汁淤積增加等肝臟減毒反應(yīng)，說明S藥物對肝臟表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系的毒性作用。肝臟在體內(nèi)扮演著非常重要的角色，參與了多種代謝過程，包括藥物代謝和解毒。然而，隨著S藥物濃度的增加，肝臟遭受到破壞，并引發(fā)了肝臟減毒反應(yīng)。降低細(xì)胞活性和活細(xì)胞與死細(xì)胞比例的變化，可能是因?yàn)镾藥物干擾了肝臟細(xì)胞的正常代謝功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死和功能喪失。凋亡細(xì)胞和脂質(zhì)變性細(xì)胞數(shù)量的增加表明，S藥物會導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和脂質(zhì)沉積，導(dǎo)致肝細(xì)胞逐漸失去完整性，產(chǎn)生脂肪變性等形態(tài)學(xué)改變。另外，膽汁淤積的增加顯示S藥物干擾了肝細(xì)胞正常的生理功能，干擾其產(chǎn)生膽汁和調(diào)節(jié)膽汁的流動。此外，生化指標(biāo)ALT和AST釋放量的增加也表明S藥物對肝細(xì)胞造成了直接的損害。總的來說，這些結(jié)果表明S藥物對肝臟表現(xiàn)出劑量依賴的毒性作用。這些發(fā)現(xiàn)對于進(jìn)一步了解S藥物對人體肝臟的毒性影響以及相關(guān)的安全評估和防護(hù)措施具有重要的意義。T/CRHA052—2024參考文獻(xiàn)[1]GB/T16886.5—2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)（ISO10993-5:2009）[2]人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會ICH三方協(xié)調(diào)指導(dǎo)原則，人用藥物遺傳毒性試驗(yàn)和結(jié)果分析指導(dǎo)原則S2（R12011年11月9日第四階段版本.[3]S.Russmann,A.Jetter,G.A.Kullak-Ublick,Pharmacogeneticsofdrug-inducedliverinjury.Hepatology52,748-761(2010).[4]N.Chalasanietal.,FeaturesandOutcomesof899PatientsWithDrug-InducedLiverInjury:TheDILINProspectiveStudy.Gastroenterology148,1340-1352e1347(2015).[5]E.S.Bjornsson,O.M.Bergmann,H.K.Bjornsson,R.B.Kvaran,S.Olafsson,Incidence,presentation,andoutcomesinpatientswithdrug-inducedliverinjuryinthegeneralpopulationofIceland.Gastroenterology144,1419-1425,1425e1411-1413;quize1419-1420(2013).[6]R.J.Andradeetal.,Drug-inducedliverinjury:ananalysisof461incidencessubmittedtotheSpanishregistryovera10-yearperiod.Gastroenterology129,512-521(2005).[7]T.Shenetal.,IncidenceandEtiologyofDrug-InducedLiverInjuryinMainlandChina.Gastroenterology156,2230-2241e2211(2019).[8]E.S.Bjornsson,J.H.Hoofnagle,Categorizationofdrugsimplicatedincausingliverinjury:Criticalassessmentbasedonpublishedcasereports.Hepatology63,590-603(2016).[9]I.Ayvaz,D.Sunay,E.Sariyar,E.Erdal,Z.F.Karagonlar,Three-DimensionalCellCultureModelsofHepatocellularCarcinoma-aReview.JGastrointestCancer52,1294-1308(2021).[10]E.Goulartetal.,3Dbioprintingofliverspheroidsderivedfromhumaninducedpluripotentstemcellssustainliverfunctionandviabilityinvitro.Biofabrication12,015010(2019).[11]R.Sharma,S.Greenhough,C.N.Medine,D.C.Hay,Three-dimensionalcultureofhumanembryonicstemcellderivedhepaticendodermanditsroleinbioartificialliverconstruction.JBiomedBiotechnol2010,236147(2010).[12]S.R.Khetani,S.N.Bhatia,Microscalecultureofhumanlivercellsfordrugdevelopment.NatBiotechnol26,120-126(2008).[13]