第9章 目的基因的獲取

第九章

目的基因的獲取目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲基因、人胰島素基因、人干擾素基因、種子貯藏蛋白基因、植物抗病基因等。目的基因：人們所需要研究的基因。目的基因目的基因需要克隆的DNA片段建立高效表達(dá)系統(tǒng)研究某基因結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系研究某基因與疾病的關(guān)系確定其表達(dá)調(diào)控機(jī)制和生物學(xué)功能目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建APCR法B基因文庫的構(gòu)建法C化學(xué)合成法

1、概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段2、原理：DNA復(fù)制1、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因DNA擴(kuò)增儀四種脫氧核苷酸

一對引物：耐熱的DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

3、條件：一對寡核苷酸序列：與目的基因的起始段互補(bǔ)。一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物4、前提：能量

5、過程高溫變性（解旋為單鏈）低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸（在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈）重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（增加DNA變性的概率）引物脫氧核苷酸5、具體過程①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：_______________________、

、

_______________、___________、___________.等②原理：__________④方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）⑤結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制四種脫氧核苷酸一對引物DNA聚合酶指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增模板DNA（含目的基因）ATP⑥過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則原料條件不同點(diǎn)解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子基因庫（genepool）特定生物體全基因組的集合（天然存在）基因文庫（genelibraryorgenebank）從特定生物個體中分離的全部基因，這些基因以克隆的形式存在（人工構(gòu)建）根據(jù)構(gòu)建方法的不同，基因文庫分為：基因組文庫（含有全部基因）cDNA文庫（含有全部蛋白質(zhì)編碼的結(jié)構(gòu)基因）2、基因文庫的構(gòu)建及目的基因的篩選基因文庫構(gòu)建的基本戰(zhàn)略構(gòu)建基因組文庫，材料來自染色體DNA構(gòu)建cDNA文庫，材料來自mRNA在高度分化的生物體中，不同組織和細(xì)胞在不同時段的mRNA種類不同（即基因的表達(dá)譜不同），因此同種生物體的cDNA文庫一般還有組織細(xì)胞的界定，如肝組織cDNA文庫或胚胎組織cDNA文庫等。很顯然，cDNA文庫的信息量遠(yuǎn)小于基因組文庫?；蚪M文庫的構(gòu)建基因組DNA的制備為了最大限度地保證基因在克隆過程中的完整性，用于基因組文庫構(gòu)建的DNA在分離純化操作中應(yīng)盡量避免過度的斷裂。制備的DNA分子量越大，經(jīng)切割處理后樣品中含有不規(guī)則末端的DNA片段的比率就越低，重組率和完備性也就越高。鳥槍法克隆目的基因1.目的基因組DNA片斷的制備超聲波處理：片段長度均一，大小可控，平頭末端。當(dāng)染色體DNA上目的基因區(qū)域的限制性酶切圖譜未知時，采用合適這超聲處理強(qiáng)度和時間，可以將切割的DNA片段控制在一定在大小范圍內(nèi)，其上限是載體的最大裝載量，下限應(yīng)至少大于目的基因的長度，否則無法在一個重組克隆中獲得完整的目的基因。一般來說，原核生物的基因長度大都在2kb以內(nèi)，真核生物的基因長度變化很大，最大的基因可達(dá)100kb以上，因而將外源基因片段處理成略小于載體裝載量上限的長度始終是正確的，外源DNA片段越大，后續(xù)篩選的規(guī)模越小。外源DNA片段很難完整地從重組分子上卸下。基因組文庫的構(gòu)建鳥槍法克隆目的基因1.目的基因組DNA片斷的制備全酶切：片段長度不均一，粘性末端便于連接，但有可能使目的基因斷開，大小不可控。如采用識別序列為4個堿基對的限制性內(nèi)切酶（如AluⅠ,MboⅠ）部分降解染色體DNA，這些限制性內(nèi)切酶的識別順序在任何生物基因組中頻繁出現(xiàn)，因此只要采取合適的酶解條件就可能獲得大片段的DNA分子。DNA片段具有粘性末端，可以直接與載體分子拼接?；蚪M文庫的構(gòu)建

內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的堿基數(shù)——影響所切出的產(chǎn)物的長度和隨機(jī)程度。

4bp的內(nèi)切酶平均每44（256）bp一個切點(diǎn)。隨機(jī)程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。

6bp的內(nèi)切酶平均每46（4096）bp一個切點(diǎn)。限制性內(nèi)切酶的選用原則鳥槍法克隆目的基因1.目的基因組DNA片斷的制備部分酶切：片段長度可控，含有粘性末端，目的基因完整。如果染色體上DNA上目的基因的兩側(cè)含有已知的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，而且兩者之間距離不超過載體裝載量的上限，用這一（兩）種限制性內(nèi)切酶全酶解染色體DNA片段可能更為有利，所產(chǎn)生的片段呈非隨機(jī)化，在某些程度上可以簡化后續(xù)的重組和篩選操作?；蚪M文庫的構(gòu)建鳥槍法克隆目的基因2.外源DNA片斷的全克隆根據(jù)外源DNA片段的末端性質(zhì)和大小確定克隆載體，一般選擇質(zhì)?；颚薉NA，受體細(xì)胞一般選擇大腸桿菌。如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體。如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測法篩選，則選擇表達(dá)型載體，受體細(xì)胞選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞。3.重組子的篩選與鑒定抗生素抗性篩選蘭-白斑篩選PCR篩選DNA雜交篩選

鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識不能獲得的最小長度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)3、cDNA文庫的構(gòu)建及目的基因的獲得1、cDNA文庫的構(gòu)建（1）分離提取細(xì)胞總RNA（2）mRNA與其他RNA的分離，mRNA僅占總RNA的1~2%，可利用mRNApoly(A)與其他RNA分開。mRNA與其他RNA的分離(3)以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈

mRNA純化后，加入oligo(dT)作為引物，以提供3’-OH引導(dǎo)DNA鏈的合成，同時加入逆轉(zhuǎn)錄酶和四種dNTP，形成RNA-DNA雜合分子。以mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一條鏈（4）cDNA第二鏈的合成

自身引導(dǎo)法

獲得的雙鏈cDNA5’端會有幾對堿基缺失（4）cDNA第二鏈的合成

置換合成法

獲得的雙鏈cDNA5’端也會有幾對堿基缺失,還會有一小段RNA,但不影響后續(xù)的克隆操作。cDNA第二鏈的合成引導(dǎo)合成法

獲得的雙鏈cDNA

能保留完整的5’端序列cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略（5）雙鏈cDNA的克隆平頭末端直接與載體連接，但插入的片段無法回收加裝人工接頭引入酶切口，以便插入片段回收cDNA法分離目的基因差異分離將兩種不同組織來源的mRNA進(jìn)行比較，用扣除雜交（subtractivehybridization)排除相同部分，即共同表達(dá)的那部分mRNA，選出有差異的、特異表達(dá)的mRNA，構(gòu)建成的cDNA文庫。因而這種程序較適用于分離克隆新基因，進(jìn)而研究其生物學(xué)功能。對已知序列目的基因的篩選DNA探針篩選：構(gòu)建的cDNA文庫，每個噬菌斑或菌落中含有一個被克隆的cDNA片段。然后，利用原位DNA探針進(jìn)行篩選目的基因。PCR法篩選（6）從cDNA文庫中篩選目的基因核酸探針篩選cDNA文庫目的基因未知序列目的基因的篩選（1）從蛋白質(zhì)尋找基因?早期尋找基因的方法，對特異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行序列分析，并推測一段核苷酸序列，合成DNA探針，篩選分離相應(yīng)的基因。

（2）同源性序列搜索在Genebank等網(wǎng)站中收錄了大量DNA序列的數(shù)據(jù)，用同源性比較工具Blastn軟件，搜索基因之間存在著的一些保守序列，可以判斷某些新基因的存在。未知序列目的基因的篩選

（3）差示篩選組織特異的cDNA是利用一對組織基因表達(dá)的差異，篩選出其中一種組織中受某種因素調(diào)控表達(dá)的一種或一組基因。制備兩種細(xì)胞群體，目的基因在其中一種細(xì)胞中表達(dá)或高表達(dá)，在另一種細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)，然后通過雜交對比找到目的基因。未知序列目的基因的篩選（4）DNA微列陣技術(shù)篩選基因把某一生物體內(nèi)全部已知基因分別點(diǎn)到DNA芯片上，再用不同發(fā)育階段的cDNA與之雜交，就能了解某些基因?qū)μ囟ㄉL發(fā)育階段的表達(dá)情況。?建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號圖。用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，檢查哪些基因的表達(dá)受抑制或激活

----基因診斷。未知序列目的基因的篩選

（5）用抗體篩選目的基因

cDNA應(yīng)克隆在表達(dá)載體中表達(dá)載體有使外源基因表達(dá)的必要調(diào)控部分。如啟動子、SD序列等。通過表達(dá)產(chǎn)物與抗體特定的結(jié)合來識別和分離目的cDNA克隆。未知序列目的基因的篩選用抗體篩選目的cDNA克隆cDNA法克隆目的基因的局限性并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)細(xì)菌或原核生物的mRNA半衰期很短mRNA在細(xì)胞中含量少，對酶和堿極為敏感，分離純化困難僅限于克隆蛋白質(zhì)編碼基因3、化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略全基因合成a.小片段粘接法根據(jù)目的基因全序列，將目的基因分成若干12-15堿基長的小片斷，兩條互補(bǔ)鏈分別設(shè)計成交錯覆蓋的兩套小片斷。容易在退火時發(fā)生錯配化學(xué)合成法的基本戰(zhàn)略b.補(bǔ)釘延長法將目的基因的一條鏈分成若干40-50堿基的片斷，另一條設(shè)計成與之交錯互補(bǔ)的20個堿基小片段。c.大片段酶促法

根據(jù)目的基因的全序列，分別合成40-50堿基長的單鏈DNA