HCN2陽性細胞在胃腸道的分布變化-第三軍醫(yī)大學學報

1/1HCN2陽性細胞在胃腸道的分布變化-第三軍醫(yī)大學學報HCN2陽性細胞在小鼠消化管肌間神經叢內的分布熊承杰，梅峰，韓鵑，田衍平，江忠勇，周德山（第三軍醫(yī)大學組織學與胚胎學教研室，重慶400038）摘摘要：

目的探討（問題1：

中文全稱?）(Asubtypeofchannelsofhyperpolarization-activatedcyclicnucleotide-gatedfamily,HCN2)陽性細胞在小鼠胃腸道肌間神經叢的分布。

方法成年昆明小鼠的胃腸道，包括胃、小腸、結腸，制作全層鋪片免疫細胞化學染色HCN2陽性細胞和膽堿能神經及cajal間質細胞(interstitialCajalcells,ICCs)。

結果成年小鼠胃腸道肌間神經叢的HCN2陽性細胞成簇緊密排列，多數陽性細胞為DogielI型神經元，陽性產物分別在細胞質和細胞膜，每個神經節(jié)內可見數十個至數百個陽性細胞；神經突起雖可見HCN2陽性產物，但主要存在于較粗的突起。

HCN2陽性神經元分布密度在胃腸道各段差異較大：

結腸密度最高，胃次之，小腸比胃低；胃腸道的各截斷表達量也不一樣。

利用膽堿能神經元標志物(ChAT,膽堿乙酰轉移酶)和ICCs的標志物（c-kit蛋白）與HCN2進行雙重免疫染色可見HCN2與膽堿能神經元共存，而未見HCN2與ICCs共存。

結論HCN2離子通道廣泛表達于肌間神經叢，存在于膽堿能神經元，可能參與調控胃腸神經的興奮性，神經遞質的釋放以及胃腸道神經網絡的建立。

關鍵詞：

HCN2；肌間神經叢；膽堿能神經；cajal間質細胞；c-kit中圖法分類號：

R322.8；R329.1ThedistributionofimmunoreactivecellsforHCN2inthemyentericnerveplexusofdigestivetractofmiceAbstract:Objectivetoinvestigatethedistributionofimmunoreactive(IR)cellsforHCN2,whichisonesubtypeofchannelsofhyperpolarization-activatedcyclicnucleotide-gatedfamily,inthemyentericnerveplexusofgastrointestinaltractofmice.Methods:gastrointestinaltractsamples,whichincludestomach,smallintestineandcolon,frommatureKMmicewerecollectedforthepreparationofwhole-mountpreparationsexaminedbyimmunocytochemistryforIRcellsforHCN2andCholinergicnervesandICCs.ResultsMostofIRcellsforHCN2withinthemyentericplexusofmaturemicewereDogielItype-neuronsandIRproductsoccurredonthecellmembranesandcytoplasm.theyoftengatheredinclusterintheganglia,whichcontainsdozenstohundredsofIRcellsforHCN2.IRproductscanalsobeseenonnervousprocess,butmajorityoccurredonthosewhichwerethicker.ThedensityofdistributionforIRcellsforHCN2inthegastrointestinaltractisdifferent::colonishighest,stomachislowerthancolon,smallintestineislowest,andquantityofexpressionofeachcutofgastrointestinaltractisalsodifferent.ThemarkersofCholinergicnerves(ChAT)andICCs(c-kit)wereusedtodouble-immunostainingwithHCN2,collocationofHCN2positivenervesandCholinergicnervescanbefound,butnocollocationofHCN2positivenervesandICCscanbefound.conclusionHCN2channelsarewidelydistributedinthemyentericnerveplexusandexpressonCholinergicnerves.HCN2maybeinvolvedinregulationofexcitabilityofnervous，releaseofneurotransmitterandestablishmentofnetworkofnervousofgastrointestinaltract.Keywords:HCN2;MyentericNervePlexus;Cholinergicnerves;interstitialcellsofcajal;c-kit問題2：

刪去概念性的文字，壓縮前言至500字以內。

超級化激活環(huán)核苷酸調控的陽離子通道（hyperplarzation－activatedcyclicnucleotide－gatedcationchannel,HCN）表達于心臟、中樞神經系統(tǒng)、視網膜和背根神經節(jié)等。

根據不同的電生理學特性，如通道被激活的速度、電壓依賴性以及受cAMP的調控程度等，HCN可以被分4個亞型（HCN1-4）。

各亞型表達部位不完全相同，HCN1表達于光感受器、背根神經節(jié)等，HCN2表達于竇房結、背根神經節(jié)、基底神經節(jié)，HCN3廣泛表達于大腦，但表達量低，HCN4主要表達于心臟竇房結和皮層下區(qū)域等[1]。

HCN通道為四聚體結構，可由同種亞型組成同源四聚體（homomers），也可以由不同亞型組成異源四聚體（heteromultimericchannels）。

兩者間在電生理學特性存在顯著差異，如HCN1和HCN2組成的異聚體與單獨由HCN1或HCN2組成的同聚體的電壓依賴性、及對cAMP的反應程度等均有明顯差異[2]。

HCN通道參與機體許多重要生理功能的調節(jié)，如維持心臟自主節(jié)律的起搏活動、調節(jié)神經元的功能活動，參與突觸遞質釋放等神經信號傳遞調控[1]。

與其它類型的離子通道相比，HCN可被超級化激活、被胞內環(huán)核苷酸（cAMP和cGMP）調控,可將胞內信號分子環(huán)核苷酸濃度變化轉化為膜電位的變化[1]。

另外，HCN通道允許K＋和Na＋以及少量的Ca2+通過，可被Cs2+和一些阻斷劑，如ZD7288阻斷。

據報道HCN2通道亦存在于小腸的肌間神經叢[3]，但在胃腸道的分布規(guī)律和功能意義尚不清楚。

膽堿能神經元是一種興奮性的運動神經元，廣泛分布于肌間神經叢，能表達分泌多種化學物質，包括鈣視網膜蛋白、神經微絲蛋白、物質P、五羥色胺等[4]。

膽堿能神經元的功能多樣，包括支配平滑肌的興奮性運動神經元、內在感覺神經元、中間神經元等[5]。

興奮性的運動神經元通過乙酰膽堿來傳遞信息，乙酰膽堿通過標記膽堿乙酰轉移酶（ChAT，分解乙酰膽堿）來識別。

HCN2表達于神經元,但具體表達于何種類型的神經元還少有報道，本實驗通過闡明HCN2通道及膽堿能神經在胃腸道肌間神經叢內的分布規(guī)律，為理解和研究HCN2通道在胃腸道生理功能中的作用提供了形態(tài)學基礎。

另外，ICCs是胃腸道的起搏細胞和興奮傳導細胞。

它可以產生一種自發(fā)性的起搏電流，使胃腸道產生自主起搏性活動；同時它還和胃腸道的神經密切接觸，可以將胃腸神經的信息傳遞給平滑肌細胞，調控胃腸道的活動[6]。

ICCs的起搏機制自今還未得到解釋。

HCN所形成的超級化電流可以引起的心臟的自動去極化，進而產生自主起搏性活動。

HCN2被證明參與了小鼠心臟的自主起搏性活動[7]。

鑒于HCN2參與小鼠心臟自主節(jié)律調節(jié)，是否與胃腸起搏有關也是一個非常有趣的科學問題。

HCN2是否參與了胃腸道自主起搏活動還少有報道（有報道嗎？），本實驗對HCN2通道及ICCs在胃腸道肌間神經叢內的分布規(guī)律進行描述，為研究和推測ICCs在胃腸道的起搏機制有一定的意義。

1材料與方法1.1材料及標本制備昆明小鼠（45～55d齡，雌雄不限，問題3：

來源？）27只，斷頸處死，無菌下開腹，將整個消化管取出，置于預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）中。

經PBS反復沖洗去除內容物后，100％丙酮充盈固定12h（4℃），將胃分為胃底、胃體、幽門部；小腸分為十二指腸、空腸、回腸；結腸分為升結腸、橫結腸、降結腸；解剖顯微鏡下分別制作肌間神經叢附著的縱肌全層鋪片和粘膜下層含粘膜下神經節(jié)的全層鋪片后，按間接法進行免疫細胞化學法染色。

1.2試劑兔抗HCN2抗體（1：

100，Alomone）、controlantigen（1：

100，Alomone）、鼠抗c-kit抗體（1：

100，DAKO）、山羊抗ChAT抗體（1：

100，chemicon）、羊抗兔IgGHRP酶標抗體（1：

100，DAKO）、驢抗兔CY3抗體（1：

100，chemicon）、驢抗兔FITC抗體（1：

100，chemicon）、驢抗山羊FITC抗體（1：

100，chemicon）、兔抗小鼠CY3抗體（1：

100，DAKO）、DAB試劑盒（北京中杉金橋）。

1.3免疫細胞化學染色根據解剖學部位，分為胃底、胃體、胃竇、十二指腸、空腸、回腸、升結腸、橫結腸、降結腸9個實驗組，全層鋪片經含0.5％Triton的0.01mol/LPBS漂洗后，0.3％H2O2甲醇封閉內源性過氧化物酶20min（25℃），1％BSA孵育30min，HCN2多克隆抗體孵育48h（4℃），PBS漂洗后，HRP酶標羊抗兔IgG抗體孵育45min（25℃），PBS漂洗后，0.5%H2ODABTris緩沖液顯色，鏡下觀察，適時終止反應，終產物為棕黃色。

對照試驗，預先用HCN2對照抗原吸收一抗后代替一抗，孵育，結果為陰性。

免疫熒光法：

標本處理同上，鋪片經PBS漂洗后，1％BSA孵育30min，直接HCN2多克隆抗體孵育24h（4℃），但二抗為驢抗兔CY3熒光抗體，1h（25℃），PBS重復漂洗，DAPI復染，熒光顯微鏡下觀察。

對照試驗，同免疫酶標染色。

免疫雙標法：

鋪片先進行HCN2染色，PBS重復漂洗后，加入一抗（山羊抗ChAT抗體）24℃24h，二抗（驢抗山羊FITC抗體），熒光顯微鏡和激光共聚交顯微鏡下分別用不同的激發(fā)波長觀察；鋪片先進行ICCs染色，PBS重復漂洗后，加入一抗（兔抗HCN2抗體）24℃24h，二抗（驢抗兔FITC抗體），熒光顯微鏡和激光共聚交顯微鏡下分別用不同的激發(fā)波長觀察。

1.4半定量分析及統(tǒng)計學處理每部位選取HCN2細胞化學染色鋪片各3張，100倍視野下，每張鋪片上隨機（問題4：

具體的隨機方法？）選取9個視野，分別用Image-ProPlus5.1軟件進行測量，以HCN陽性細胞與鋪片面積比為變量，采用SPSS12.0軟件進行單因素方差分析。

2結果2.1HCN2陽性神經為DogielI型神經元HCN2多克隆抗體的間接免疫酶標化學染色反應產物為棕黃色。

全層鋪片可見胃腸道HCN2陽性產物反應較強，主要位于細胞質和細胞膜，細胞核未著色，陽性細胞輪廓清晰，神經突起著色不明顯。

陽性細胞直徑大小不等，數量從幾十個至上百個位于同一神經節(jié)內，連接于神經節(jié)之間的節(jié)間束也為HCN2染色陽性，偶見少數HCN2染色陽性細胞位于節(jié)間束內（圖1）。

胃內HCN2陽性細胞較小，突起不明顯，細胞膜著陽性，未見細胞質著色。

小腸內HCN2陽性細胞較大，一部分細胞質、細胞膜均陽性，另一部分細胞僅細胞膜陽性，形狀為圓形或者卵圓形，軸突細長,樹突不明顯，多為DogielI型神經元。

結腸內HCN2陽性細胞形態(tài)與小腸內HCN2陽性細胞相似，較小腸內細胞小。

圖1小腸肌間神經叢的HCN2陽性神經節(jié)問題5：

圖A為胃；圖C為結腸？2.2HCN2陽性神經在小鼠胃腸道壁內的分布規(guī)律胃內的HCN2陽性神經節(jié)數量較多，面積較小，多個神經節(jié)間界限常不清，形狀不規(guī)則，節(jié)間神經突起較短較少，神經網絡稀疏，網狀分布，節(jié)內細胞胞體較小，數量較多，排列致密；小腸內HCN2陽性神經節(jié)數量少，只有1到2個神經節(jié)/mm2，面積大，呈長梭形分布，節(jié)間神經突起較多，神經網絡致密，節(jié)內細胞胞體較大，數量較少，排列致密；結腸內的HCN2陽性神經節(jié)數量較多，面積較小，多個神經節(jié)之間界限不清，呈長梭形，多沿平滑肌束呈平行排列，節(jié)間神經突起豐富，神經網絡致密，節(jié)內細胞胞體較小，數量較多（圖2）。

統(tǒng)計結果顯示，從胃底到胃竇，HCN2陽性細胞增加；十二指腸HCN2陽性細胞最少，從十二指腸到回腸，HCN2陽性細胞增加；橫結腸的數目最多,升結腸和降結腸陽性細胞數相差不明顯（圖3）；在盲腸也發(fā)現了HCN2陽性神經。

對照標本均為陰性，預先用HCN2抗原吸收一抗后代替一抗，孵育，結果為陰性。

圖2HCN2陽性神經在小鼠胃腸道各段的分布圖A、B、C、D、E、F、G、H分別代表胃底、胃體、胃竇、十二指腸、空腸、回腸、升結腸、橫結腸、降結腸050100150200250300350400450500胃底胃體胃竇HCN2陽性神經元數/mm2050100150200250十二指腸空腸回腸HCN2陽性神經元數/mm20100200300400500600700800升結腸橫結腸降結腸HCN2陽性神經元數/mm20200400600800胃小腸結腸HCN2陽性神經有數/mm2圖3A、B、C、D分別顯示胃、小腸、結腸不同截斷單位面積陽性神經細胞數的變化。

圖A示胃底、胃竇，胃竇的陽性神經元數，胃竇多于胃體（P0.05），胃體多于胃底（P0.05）。

圖B示，回腸的陽性神經元數多于十二指腸和空腸的（P0.05），十二指腸和空腸沒有明顯差異。

圖C示，橫結腸的陽性細胞數最多，橫結腸的陽性細胞數多于升結腸和降結腸的（P0.05），升結腸和降結腸沒有顯著性差異。

圖D示，結腸的陽性細胞數多于胃的（P0.05），而胃又多于小腸的（P0.05）。

問題6：

可否用表格列舉出？2.3肌間神經叢內膽堿能神經的分布模式ChAT顯色結果顯示：

膽堿能陽性神經廣泛的分布于整個消化道的肌間神經叢中，構成神經節(jié)、節(jié)間束及神經纖維縱橫交織成網（圖5）。

膽堿能陽性神經元輪廓較為清晰，形狀為圓形或者卵圓形，軸突細長,樹突不明顯，多為DogielI型神經元；細胞質著色，細胞核未觀察到著色，數十個至數百個膽堿能陽性神經元成簇分布在神經節(jié)中，數個膽堿能陽性神經元散在分布在節(jié)間束上。

圖5橫結腸肌間神經叢的膽堿能神經問題7：

A,B,C分別是什么？2.4HCN2陽性神經與膽堿能神經免疫熒光雙標HCN2陽性神經與膽堿能神經免疫熒光雙標的結果顯示：

HCN2陽性神經和膽堿能神經多為DogielI型神經元。

HCN2陽性神經元與膽堿能神經元的細胞質、細胞膜和突起均重合，HCN2陽性神經節(jié)間的突起和膽堿能神經的突起也重合（圖6）。

圖6膽堿能神經和HCN2陽性神經的共標A：

膽堿能神經；B：

HCN2陽性神經；C：

膽堿能神經和HCN2陽性神經的共標箭頭所示共標的細胞質和神經突起2.5HCN2陽性神經與ICC間質細胞免疫熒光雙標HCN2陽性神經與ICCs免疫熒光雙標的結果顯示：

全層鋪片可見c-kit陽性的ICC間質細胞為梭形或卵圓形，細胞質較少，細胞質著色淺，有2～3個細長的突起，突起間形成完整的獨立的細胞網絡（圖7B）。

HCN2陽性神經元聚集形成神經節(jié)，與ICCs各自形成完整的細胞網絡，未見兩者存在明顯的共存現象，僅見ICCs的突起與HCN2陽性神經元有少量共標（圖7C）。

圖7cajal間質細胞與HCN2陽性神經的共標問題8：

圖7A文中未標引？A：

HCN2陽性神經；B：

ICC間質細胞；C：

ICCs與HCN2陽性神經的共標B中箭頭示ICCs的胞體和突起，C中箭頭示ICCs的突起與HCN2陽性神經元的細胞質共標3討論HCN是一種特殊類型的陽離子通道，由超極化激活，環(huán)核苷酸調控。

活化后的HCN通道通過進出的陽離子改變神經元的興奮性、調節(jié)神經遞質的釋放、影響神經元的可塑性和神經網絡的發(fā)育成熟。

在中樞神經系統(tǒng)，HCN與睡眠、醒覺等生理功能密切相關，同時它的功能失常與癲癇等疾病的發(fā)生也密切相關[8]。

HCN2通道表達于胃腸道神經，但是國內外對其在胃腸道具體的表達和分布模式還少有研究。

本實驗通過免疫細胞化學觀察HCN2陽性細胞的胞漿和細胞膜均著色，輪廓清晰，神經突起少，多數為DogielI型神經元，廣泛地分布于胃腸道肌間神經叢，且分布趨勢為結腸單位面積的陽性神經元最多，胃次之，小腸最少。

我們同時對胃腸道各個截斷的具體分布情況進行了比較發(fā)現，從胃底到胃竇，單位面積的陽性神經元數有逐漸增加；從十二指腸到回腸，十二指腸和空腸單位面積的陽性神經元數無統(tǒng)計學差異，而與回腸差異顯著；從升結腸到橫結腸，單位面積的陽性神經元數顯著增加，而降結腸單位面積的陽性神經元數又顯著減少。

我們的結果與國外學者研究神經元在胃腸神經系統(tǒng)的分布模式相似[9，10]。

可見HCN2通道在胃腸道多種類型的神經元表達，而HCN通道具有高度的功能可塑性，可以適應不同類型神經元的功能變化。

盡管現在沒有直接證據證明HCN2通道在胃腸道功能中發(fā)揮作用，但是有學者發(fā)現了HCN2參與了胃腸炎癥性疾病的異常放電。

根據不同的電生理學特性，胃腸道的神經元可以分為兩種不同的類型，AH神經和S神經。

J.XIAO等在AH神經記錄到了Ih(HCN通道產生的電流)，同時他們還對AH神經進行了標記，發(fā)現了這些神經都為HCN2陽性。

AH神經元被證明在腸道炎癥的疾病動物模型中對調節(jié)神經的興奮性發(fā)揮重要作用，在這一過程中，AH神經被記錄到了Ih[11]，HCN2參與了AH神經的異常放電現象，影響胃腸神經的興奮性。

我們進一步使用了ChAT對膽堿能神經進行標記研究HCN2陽性神經元與膽堿能神經的關系,發(fā)現所有通過ChAT標記的膽堿能神經的分布模式與HCN2陽性神經一致，同時共標結果顯示兩者高度重合。

由于膽堿能神經是胃腸道的一種重要的神經，它分化出多種功能，包括中間神經、內在感覺神經和支配平滑肌收縮的興奮性運動神經；根據表達鈣結合蛋白（calciumbindingproteins）的種類不同，它還可以被分為表達鈣視網膜蛋白（calretinin）和鈣結合蛋白（calbindin）的兩種膽堿能神經[5]。

XIAO等發(fā)現鈣視網膜蛋白（calretinin）陽性神經在遠端結腸全部表達HCN2,然而只有33％的HCN2陽性神經表達鈣視網膜蛋白[3]。

J.XIAO的結果證實了HCN2在部分膽堿能神經的表達。

基于J.XIAO的觀察結果與本實驗的研究結果相似，推測HCN2通道可能與胃腸道生理功能有一定的關系。

HCN通道具有高度的功能可塑性，這種可塑性可能是膽堿能神經功能多樣性的分子基礎。

另外，在這些神經中，HCN2通道主要位于軸突終末，還可能調節(jié)膽堿能神經遞質的釋放[8]。

我們沒有發(fā)現ICCs與HCN2神經元共標,ICCs與HCN2陽性神經各自形成獨立的網絡，僅見ICCs的突起與HCN2有少量共標，并未發(fā)現ICCs的胞體與HCN2共標。

HCN2表達于神經元，參與神經元的電活動，調控神經元的興奮性，介導神經遞質的釋放。

而ICCs作為胃腸道的起搏細胞，產生起搏電流，引起胃腸道的自主節(jié)律性活動。

它與神經元和平滑肌細胞關系密切，可以接受神經元的信息并傳達到平滑肌細胞，對胃腸道的運動功能進行調控。

ICCs的突起與HCN2陽性神經元共同表達HCN2通道，而胞體并未表達HCN2通道，可能是HCN2陽性神經元通過ICCs的突起對ICCs的電活動進行調控，或者將神經元的信息通過ICCs傳遞給胃腸道的平滑肌細胞。

最近有研究顯示HCN通道對于神經元的發(fā)育和神經網絡的建立至關重要。

神經網絡成熟的過程需要發(fā)育中的神經元不斷的調節(jié)自身的特性以及它們的放電行為來適應不斷變化的神經元微環(huán)境，HCN通道高度的功能可塑性尤其適合這個過程。

在中樞神經系統(tǒng)，由不成熟階段的神經網絡發(fā)育到成熟階斷的神經網絡伴隨著HCN表達量的變化[8]。

HCN參與了體內一系列的生理、病理過程，與神經功能的建立、神經網絡的形成以及神經元的興奮性密切相關，我們認為HCN2在胃腸道的生理、病理過程中發(fā)揮重要作用。

本實驗通過對HCN2在胃腸道的分布模式進行詳細研究，為深入探討胃腸道生理功能提供了新的形態(tài)學依據，對理解臨床胃腸道相關疾病的發(fā)病機制具有重要的理論意義。

問題9：

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參考文獻：

問題10：

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