OGDCE2和BCOADAE2的二聯(lián)體檢測(cè)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的意義

1/1OGDCE2和BCOADAE2的二聯(lián)體檢測(cè)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的意義OGDCE2和BCOADAE2的二聯(lián)體檢測(cè)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的意義作者：

陳燕，婁加陶，姚定康，周曄，吳傳勇，錢琤，蔣天舒，陳波，仲人前，鄧安梅【摘要】目的通過重組表達(dá)抗原OGDCE2和BCOADCE2的二聯(lián)體融合蛋白(B0)，并用于檢測(cè)自身抗體及臨床意義。

方法重組表達(dá)的融合蛋白(B0)，通過NiNTA親和柱純化，經(jīng)過免疫印跡法(IBT)和酶鏈免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)56份PBC患者血清，以48份自身免疫病患者、50份其他肝病患者、70例正常人血清為對(duì)照組。

結(jié)果56例確診的PBC患者中，42例陽性，陽性率為75．0%。

而健康體檢者和疾病對(duì)照組血清中的M2抗體均為陰性。

結(jié)論通過用重組表達(dá)的二連體B0檢測(cè)PBC患者血清中的M2抗體，具有一定的特異性及敏感性，為臨床進(jìn)一步研究PBC，輔助診斷提供一些輔助參考。

【關(guān)鍵詞】BCOADAE2OGDCE2二聯(lián)體(B0)；免疫印跡；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；原發(fā)性膽汁性肝硬化原發(fā)性膽汁性肝硬化(primarybiliarycirrhosis，PBC)是以進(jìn)行性膽汁淤積伴有肝損傷為特點(diǎn)，并逐漸形成肝硬化及其并發(fā)癥。

其肝組織病變特征是以淋巴細(xì)胞為主的大量炎性細(xì)胞浸潤，肝內(nèi)小葉間膽管的慢性非化膿性破壞性膽管炎，最終發(fā)展為肝硬化甚至肝功能不全。

血清線粒體抗體M2(AMAM2)診斷PBC的敏感性和特異性均超過90%~95%，為本病最突出的免疫學(xué)指標(biāo)異常，也是重要的診斷手段[1]。

M2抗體的靶抗原主要為線粒體上的2氧酸脫氫酶復(fù)合體(2OADC)的其中一些組分：

側(cè)鏈二氧酸脫氫酶復(fù)合體E2(BCOADCE2)、丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2(PDCE2)、2氧戊二酸脫氫酶(OGDC)[2~3]。

我們通過采用重組抗原(BCOADCE2)和2氧戊二酸脫氫酶(OGDC)的復(fù)合體BO來檢測(cè)M2抗體，以利于PBC的早期診斷。

1材料和方法1．1標(biāo)本來源PBC患者組56例，為本院2004年8月2006年6月間，經(jīng)住院檢查確診的PBC患者。

其中女54例，男3例，男女比例為1：

18。

年齡32~65歲。

并且PBC的診斷符合2000年美國肝臟病學(xué)會(huì)(AASLD)推薦的診斷指南：

排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能異常，有膽汁淤積的生化改變(主要是堿性磷酸酶、谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶升高)且無其他原因解釋；血清抗線粒體抗體或M2抗體陽性，同時(shí)AMA1：

40[4]。

患者并行穿刺病理檢查，匯管區(qū)有大量淋巴細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞聚集，光鏡下可見小葉結(jié)構(gòu)完整，實(shí)質(zhì)內(nèi)可見凋亡小體形成及散在點(diǎn)狀壞死，均符合PBC早期病理學(xué)特征。

70例正常對(duì)照均為本院的健康體檢者，50例其他肝病患者和自身免疫病患者48例(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎15例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡20例，強(qiáng)直性脊柱炎3例，自身免疫性膽管炎10例)為疾病對(duì)照組，均為本院住院患者。

1．2純化重組抗原將特異性擴(kuò)增OGDCE2和BCOADCE2的二聯(lián)體BOcDNA定向插入高效表達(dá)載體PET28a(+)，轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主菌大腸埃希菌(E．coli)．BL21，經(jīng)異丙基硫代D半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后表達(dá)，在變性條件下用帶6個(gè)組氨酸的NiNTA瓊脂糖純化，獲得高純度的重組BO，方法參見文獻(xiàn)[5]。

1．3利用重組融合抗原IBT檢測(cè)M2抗體將重組蛋白BO經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素(NC)膜，封閉后依次加入血清、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗人IgG，顯色劑3．3二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽底物和H2O2，觀察反應(yīng)條帶。

同時(shí)用正常人血清作陰性對(duì)照。

1．4ELISA法檢測(cè)M2抗體ELISA方法檢測(cè)PBC患者，健康體檢者和疾病對(duì)照組血清中的M2抗體。

純化后的重組蛋白，用碳酸鹽緩沖液CBS(pH9．5)稀釋后分別包被酶標(biāo)板。

OP為4mg/L，4℃過夜(16h)，吐溫-20碳酸鹽緩沖液洗滌3次后，加入小牛血清封閉，洗滌后依次加入待檢血清、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG、顯色劑3．3二氨基聯(lián)苯胺和H2O2，經(jīng)酶標(biāo)比色儀吸光度450nm比色，讀取吸光度值，判定值為陰性對(duì)照A值+5倍標(biāo)準(zhǔn)差。

15統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用StlJderlts檢驗(yàn)分析均值間差異。

第2期OGDCE2和BCOADAE2的二聯(lián)體檢測(cè)在原發(fā)性膽汁性肝硬化中的意義陳燕，等2結(jié)果2．1免疫印跡檢測(cè)結(jié)果用重組融合抗原BO經(jīng)IBT檢測(cè)，56例確診的PBC陽性病人，檢測(cè)出抗BO抗體陽性的為42例，陰性14例。

正常對(duì)照和其他非膽汁性肝硬化患者抗BO抗體均為陰性。

48例自身免疫病患者中，10位自身免疫性膽管炎患者中2例AMA陽性；但其血清中抗BO抗體均為陰性。

結(jié)果見表1。

表1抗BO抗體與AMA抗體檢測(cè)結(jié)果(略)22常規(guī)方法檢測(cè)采用常規(guī)方法檢測(cè)，自身免疫病患者和其他肝病患者、健康對(duì)照者中M2抗體均為陰性。

而56例確診的PBC患者中，其M2抗體為陽性42例，陰性14例；與我們采用的IBT法和ELISA法檢測(cè)結(jié)果完全符合。

23ELISA法檢測(cè)抗BO血清用ELISA法檢測(cè)時(shí)，正常對(duì)照組值為(8935)U，因此以gt;289U(5s)為陽性標(biāo)準(zhǔn)，lt;289U為陰性標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果顯示，在56例確診的PBC患者中42例陽性，14例陰性；其他疾病對(duì)照組和健康體檢者均為陰性。

3討論原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)的特征是血中線粒體抗體為陽性，而高滴度的抗線粒體抗體(AMA)是PBC的重要血清學(xué)指標(biāo)。

根據(jù)其靶抗原不同，AMA可分為M1~M9共9個(gè)亞型，其中M2對(duì)PBC的診斷最具特異性。

PBC在任何年齡段均可發(fā)病，其中90%~95%為女性，大部分集中在30~70歲之間，兒童少見[6]。

AMA對(duì)PBC具有診斷意義。

95%~98%的患者AMA陽性，因此抗體出現(xiàn)可早于臨床表現(xiàn)多年，所以具有早期診斷價(jià)值。

近年來研究顯示，M2亞型對(duì)PBC具有較高的特異性和診斷價(jià)值。

PBC的發(fā)病率在我國鮮見報(bào)道，近年來國外報(bào)道PBC也呈上升趨勢(shì)。

1987年以來鑒定出M2靶抗原為線粒體上的2氧酸脫氫酶復(fù)合體(2OADC)的一些組分：

丙酮酸脫氫酶(PDC)、2氧酸脫氫酶(BCOADC)、2氧戊二酸脫氫酶(OGDC)等，BCOADC和OGDC的抗原表位位于內(nèi)酯酰區(qū)。

在PBC患者血清中OGDC的陽性率為39%~88%，而BCOADC的陽性率為53%~55%[4~7]。

我們采用重組表達(dá)的BCOADCE2和OGDCE2的二聯(lián)體BO，作為靶抗原來檢測(cè)PBC患者血清中的M2抗體。

56例PBC患者檢查出BO抗體陽性42例，陰性的12例，其陽性率為75．0%。

自身免疫病患者、其他肝病患者和健康體檢者血清中均未檢測(cè)出BO抗體。

通過早期檢測(cè)M2抗體，有助于早期確診PBC患者，對(duì)指導(dǎo)治療有一定參考價(jià)值。

【參考文獻(xiàn)】\[1\]王蕓,范紅,郭強(qiáng).原發(fā)性膽汁性肝硬化與抗線粒體抗體M2檢測(cè)的臨床意義\[J\].中華現(xiàn)代內(nèi)科學(xué)雜志,2005,2(3):211-222.\[2\]VandeWaterJ,GersbwonME,LeungP,etal.Theautoepitopeofthe74kDmotochondrialautoantigenofprimarybiliarycirrhosiscorrespondstothefunctionalsiteofdibydrolipoamideacetyltransferase\[J\].JExpMed,1988,167:1791-1799.\[3\]JophnRE,NeubergerJM.Immmuopathologyofprimarybiliarycirrhosis\[J\].EnrJGastroenterolHepatol,1999,11:587-593.\[4\]NakanoT,InoueK,HiroharaJ,etal.Longtermprognosisofprimarybiliarycirrosis(PBC)inJapanandanalysisofthefactorsofstageprogressioninasymptomaticPBC(PBC)\[J\].HepatolRes,2002,22(2):250-260.\[5\]夏睛,仲人前,鄧安梅,等.胰腺癌相關(guān)自身抗原47原核表達(dá)、純化及其抗體檢測(cè)胰腺癌的價(jià)值初探\[J\].中華檢驗(yàn)醫(yī)