2021年版植物生理學實驗指導書

PGE\*MERGEFORMTPGE\*MERGEFORMT120XX年版植物生理學實驗指導書農(nóng)學院

[自編教材指導書]《植物生理學》實驗指導

（20XX版）

李奕松姬謙龍馬蘭XX

葛秀秀楊明峰王文平趙筱萌編

農(nóng)學院生物科學與工程學院

20XX.2

目錄

★★★實驗室特別提醒

實驗一質(zhì)壁分離法測定細胞滲透勢(4)

實驗二小液流法測定植物組織水勢(5)

實驗三葉綠體色素的提取分離理化性質(zhì)及定量測定(7)

實驗四植物根系活力的測定（TTC法）(10)

實驗五過氧化氫酶（CT）活性的測定(12)

實驗六植物硝酸還原酶（NR）活性的測定(14)

實驗七植物細胞膜透性的測定(16)

實驗八植物光合速率的測定(17)

★★★實驗室特別提醒

一、實驗室紀律要求

1.按照規(guī)定，穿好實驗服進入實驗室。

2.不同意將食品和飲用水帶進實驗室。

3.按照教師指定的實驗XX進行實驗，不同意私自調(diào)換位置。

4.實驗課中禁止大聲喧嘩、跑動和打鬧。

二、實驗安全注意事項

5.注意電源使用安全，禁止?jié)袷职尾宀孱^。

6.水浴鍋鍋蓋開啟關閉時，注意幸免蒸汽燙傷。

7.注意抽氣泵安全使用。

8.注意使用分光光度計時參比液體樣品不能滿溢灑漏。

三、實驗課程要求

9.提前預習實驗指導內(nèi)容，熟悉實驗原理和步驟。

10.檢查XX面用具是否完好，若否，須報告進行補充調(diào)整。

11.清洗器皿程序：“自來水→去污粉→自來水→去離子水”。

12.實驗原始結果記錄需要指導教師審查簽字。

13.實驗后填寫儀器使用記錄。

14.實驗完畢清潔實驗器皿和XX面、地面衛(wèi)生。

15.離開實驗課堂需要得到指導教師批準。

實驗一質(zhì)壁分離法測定細胞滲透勢

一、原理：

在生活細胞和外界溶液構成的滲透體系中，水分總是從高水勢一方流向低水勢一方。將植物組織放入一系列不同濃度的蔗糖溶液中，經(jīng)過一段時間以后，有的細胞汲取水分，細胞膨脹；有的失去水分，細胞發(fā)生質(zhì)壁分離。如果在某一溶液中細胞脫水達到平衡時剛好細胞處在臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)，此時細胞內(nèi)的壓力勢等于零，外界溶液的滲透勢等于細胞滲透勢，故此外界溶液稱為該組織的等滲溶液，其濃度稱之為該組織的等滲濃度。根據(jù)公式即可計算出該組織細胞液的滲透勢。在實際測定時，由于臨界質(zhì)壁分離狀態(tài)難以在顯微鏡下直接觀察到，所以一般均以細胞初始質(zhì)壁分離狀態(tài)作為推斷組織等滲濃度的標準。如果細胞質(zhì)壁分離較為明顯，可根據(jù)引起質(zhì)壁分離的溶液濃度，與相鄰的不引起質(zhì)壁分離的溶液濃度，取其平均值，求出組織等滲濃度，并計算出溶液的滲透勢，即為該組織細胞的滲透勢。

二、材料與設備：

1.植物材料：洋蔥鱗莖、大蔥、蠶豆葉片或其它植物葉片。

2.設備：顯微鏡1XX、培養(yǎng)皿7套；滴管；載玻片、蓋玻片各5片；鑷子1把；單面刀1片；濾紙適量。

3.試劑：1.00mol/L蔗糖溶液，0.03%中性紅溶液.

三、實驗步驟：

1.以1.00mol/L蔗糖溶液為母液,依照公式C1V1=C2V2配制0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mol/L蔗糖溶液各10ml于干燥清潔的小培養(yǎng)皿內(nèi)備用。注意蓋上培養(yǎng)皿蓋，防止蒸發(fā)濃縮。

2.用刀片在洋蔥鱗莖內(nèi)表皮上劃出邊長為5mm的小方格，用鑷子剝?nèi)?nèi)表皮數(shù)塊浸入盛有0.03%中性紅溶液的小培養(yǎng)皿內(nèi)，染色3min，取出后放入盛有自來水的小培養(yǎng)皿內(nèi)，沖洗中性紅留存在細胞間隙、細胞壁等上面的浮色，用濾紙吸干內(nèi)表皮上的多余水分。

3.在盛有不同濃度蔗糖溶液的培養(yǎng)皿內(nèi)分別放入染過色并漂洗后的內(nèi)表皮數(shù)塊。20min后，按從高濃度到低濃度蔗糖溶液的順序各取出內(nèi)表皮小塊，依次開始鏡檢，繪圖記錄質(zhì)壁分離情況，求出組織細胞的等滲溶液濃度。

四、結果計算：

由所得到的組織細胞的等滲濃度和測定時的室溫，用下式計算植物細胞的滲透勢。

Ψs=-iCRT（MP）

ΨS：為細胞滲透勢，以MP表示。

i：為溶液的等滲系數(shù)（蔗糖溶液的i=1）。

C：等滲溶液的濃度（mol/L）。

T：為絕對溫度，T=（273+t℃）K，t為實驗時的室溫。

R：為氣體常數(shù)，R=0.008314（L·MP/mol·k）

實驗二小液流法測定植物組織水勢

一、原理

水勢表示水分的化學勢，水分從水勢高處流向低處。植物體細胞之間、組織之間以及植物體和環(huán)境之間的水分移動方向都由水勢決定。

當植物細胞或組織分別放在一系列濃度遞增的溶液中時，如果植物組織的水勢小于溶液的滲透勢，則組織吸水而使外界溶液濃度變大；反之，則組織水格外流而使外界溶液濃度變小。若植物組織的水勢與溶液的滲透勢相等，則二者水分保持動態(tài)平衡，所以外界溶液濃度不變，而外界溶液的滲透勢即等于所測植物組織的水勢。溶液濃度不同，比重不同，當兩個不同濃度的溶液相遇時，稀溶液由于比重小而上浮，濃溶液則由于比重較大而下沉。取浸過植物組織的溶液一小滴（為了便于觀察可先染色），放在原來濃度的溶液中，觀察液滴升降情況即可推斷濃度的變化，如小液滴不動，則表示溶液浸過植物組織后濃度未變，即外界溶液的滲透勢等于組織的水勢。

二、材料與設備：

1.植物材料：胡蘿卜肉質(zhì)根或其它作物的葉片。

2.設備：XX霉素小瓶或小試管（12×10mm）6支（均具塞）；大試管（15×150mm）6支（具塞）；

10ml移液管2支；1ml移液管2支；毛細滴管6支；打孔器1個；溫度計1支；解剖針1支；鑷子1把。

三、實驗步驟：

1、以1.00mol/L蔗糖溶液為母液,依照公式C1V1=C2V2配制一系列不同濃度的蔗糖溶液（0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mol/L）于6支干凈、干燥的大試管中，各管加塞，并編號。按編號順序在試管架上排成一列，作為對比組。

2、另取6支干凈、干燥的XX霉素小瓶，編定序號，按順序放在試管架上，作為實驗組。然后由對比組的各試管中分別取溶液1ml移入相同編號的實驗組試管中，加塞，備用。

3、取胡蘿卜肉質(zhì)根（或剪下具有代表性的新奇葉片）馬上用打孔器打園片。注意實驗材料的取樣部位一定要一致，若為葉片組織要避開大的葉脈部分。迅速將適量植物材料放在XX霉素小瓶（或小試管）中。一般胡蘿卜肉質(zhì)根放入8片（厚約1mm）左右，葉片材料放入20片左右。搖動小瓶，使植物材料浸入到溶液中。注意這個過程操作要快，防止水分蒸發(fā)。放置20min。在此期間搖動小瓶2-3次，使組織和溶液之間進行充分的水分交換。

4、20min后，分別在各小瓶中加入甲烯蘭粉末少許，搖勻，使溶液為藍色。按濃度依次分別用毛細吸管吸取少量藍色溶液，輕輕插入相應濃度的試管中，伸至溶液中部，小心緩慢地放出藍色溶液一小滴，慢慢取出毛細管（注意幸免攪混溶液）。觀察并記錄液滴的升降情況：

如果有色液滴向上移動，說明浸過植物組織的蔗糖溶液濃度變小，植物組織失水，表明植物組織的水勢高于該濃度溶液的滲透勢；如果有色液滴向下移動，說明浸過植物組織的蔗糖溶液濃度變大，植物組織吸水，表明植物組織的水勢低于該濃度溶液的滲透勢；如果液滴靜止不動，則說明植物組織的水勢等于該濃度溶液的滲透勢。在測定中，如果在前一濃度溶液中液滴下降，而在后一濃度溶液中液滴上升，則該組織的水勢為前后二種濃度溶液滲透勢的平均值。

四、結果計算

記錄液滴靜止不動的試管中蔗糖溶液的濃度。

由所得到的等滲濃度和測定的室溫，按下式計算植物組織的水勢。

Ψ

=-iCRT（MP）

W

ΨW：為植物組織水勢，以MP表示。

i：為溶液的等滲系數(shù)（蔗糖溶液的i=1）。

C：為等滲溶液的濃度：（mol/L）。

T：為絕對溫度：T=（273+t℃）K，t為實驗時的室溫。

R：為氣體常數(shù)：R=0.008314（L·MP/mol·k）

實驗三、葉綠體色素的提取、理化性質(zhì)及定量測定

I.葉綠體色素的提取、理化性質(zhì)

一、原理：

葉綠體中含有綠色素（葉綠素和b）和黃色素（胡蘿卜素和葉黃素）。這兩類色素能溶于有機溶劑，且各種色素的脂溶性不同。根據(jù)它們在有機溶劑（如乙醇、甲醇、丙酮等）中的溶解特性，可將它們從葉子中提取出來。

葉綠素是一個雙羧酸的脂，在堿的作用下，可發(fā)生皂化反應。在酸性條件下，葉綠素啉環(huán)ZY的鎂可被氫取代，于是葉綠素成為褐色的去鎂葉綠素。葉綠素中的鎂也可被銅、鋅等金屬離子取代，此時葉綠素仍可保持綠色。葉綠素在光照下會發(fā)出暗紅色的熒光。

二、材料與設備：

1.植物材料：新奇植物葉片。

2.設備：研缽一套；漏斗一個；剪子一把；細玻璃棒一支；燒杯（50ml）1支；20ml刻度試管5支；5ml刻度試管2支；25ml刻度吸管2支；酒精燈；石棉XX；鐵三腳架；濾紙適量。

3.試劑：丙酮；CCO3;80%丙酮；苯；醋酸酮粉末；50%醋酸；KOH-甲醇溶液（20克KOH溶于100ml甲醇中）

三、實驗步驟：

1.色素的提取

取洗凈新奇的植物葉子5克，剪碎放入到研缽中，加入少量碳酸鈣和石英砂，再少量多次加入丙酮共10ml，研磨至丙酮染成深綠色，將丙酮提取液濾入小燒杯內(nèi)，再用10ml丙酮重復研磨，過濾，濾液待用。

2.理化性質(zhì)的測定

1）熒光現(xiàn)象

取葉綠素提取液，放入試管中，在反射光下觀察，溶液的顏色為暗紅色，這是葉綠素輻射熒光的現(xiàn)象；在透射光下為綠色，是由于葉綠素分子不汲取綠色光的原因。

2）皂化作用

用移液管吸取葉綠素提取液5ml，放入到一大試管中，再加入1.5ml20%KOH-甲醇溶液，搖勻。緊接著加入5ml苯，馬上搖勻。沿試管璧加入蒸餾水1ml，輕輕轉動試管，靜置于試管架上，可看到溶液逐漸分成兩層，上層是苯溶液，其中溶有黃色的類胡蘿卜素，下層為稀的丙酮溶液，其中溶有綠色的皂化的葉綠素和b。

3）取代作用[H+和Cu2+對葉綠素分子中Mg2+的取代]

用移液管吸取葉綠素提取液5ml，放入試管中，加入50%醋酸數(shù)滴（或濃HCL1~2滴），搖勻，可觀察到溶液由綠色變成褐色，此時葉綠素分子中的Mg2+被H+取代，為去鎂葉綠素。之后將溶液倒一半于另一試管中，加醋酸酮粉末少許，微微加熱，則溶液顏色又變成綠色，此時去鎂葉綠素分子中的H+被Cu2+取代，為銅代葉綠素。將兩試管中的溶液進行比較。

II.葉綠素的汲取光譜與定量測定

一、原理

實驗目的：掌握紫外分光光度計的使用，學習測定葉綠素的含量及汲取光譜的測定方法。

根據(jù)葉綠素對可見光有特定的汲取光譜，利用分光光度計在某一特定波長下測定其光密度，利用公式計算葉綠素的含量。該法不但精確度高而且能在未分離的情況下，分別測定葉綠素和葉綠素b的含量。

已知葉綠素、b在紅光區(qū)的最大汲取峰分別位于663nm和645nm,又已知在波長663nm下葉綠素、b的80%丙酮溶液的比汲取系數(shù)為82.04和9.72，在波長645nm下分別為16.75和45.60。其關系式：

D663=82.04C+9.72Cb(1)

D645=16.75C+45.6Cb(2)

D663、D645：分別為葉綠素溶液在波長663nm和645nm的光密度。

C、Cb：分別為葉綠素、b的濃度，單位為mg/L

解方程(1)(2)得：

C=12.7D663－2.59D645(3)

Cb=22.9D645－4.67D663(4)

C與Cb相加，既得葉綠素總量CT

CT=C+Cb=20.3D645+8.03D663(5)

根據(jù)葉綠素、b在652nm處有相同的比吸光系數(shù)（34.5），即可在此波長下測定光密度（D652）而求出葉綠素總濃度CT：

D652×1000

CT（mg/L）=————————(6)

34.5

二.材料和設備：

1.實驗材料：菠菜葉片

2.設備：756紫外分光光度計，電子天平，研缽一套，漏斗一個，25ml容量瓶一個

3.試劑：80%丙酮，CCO3粉末

三.實驗步驟：

1.葉綠素提取液的置備：稱取新奇干凈的葉片（去主脈）0.1克，剪碎，放入研缽中，加入少量CCO3粉末和石英砂，加入80%丙酮，仔細研磨成勻漿，再加入適量丙酮，繼續(xù)研磨至組織殘渣變?yōu)榘咨?，靜止片刻，將提取液過濾至25ml容量瓶中，再用80%丙酮沖洗研缽和濾紙，將色素沖洗干凈，最后用80%丙酮定容至25ml，搖勻、待用。

2.光密度測定與汲取光譜掃描：以80%丙酮做對比，按下列步驟輸入程序：

1)開機：依次打開外部電源(如穩(wěn)壓器)、主機電源。

2)儀器自檢：當打開儀器電源時，儀器便進入自檢程序，自檢各項都“OK”后，進入選擇工作方式界面；預熱半小時后進行以下操作。

3）光度測量未知葉綠素、b總濃度的測定：

3.1進入光度測量(652nm,)：

3.2按F1鍵進行參數(shù)設置：選測光方式為“bs”，按F2鍵進入測

量模式；按

3.3

溶液。

3.4測量：將取出的參比溶液倒掉，換上樣品溶液，放入第一樣品池內(nèi)，按即可測量樣品bs值。

4)光譜測量

4.1進入光譜測量：在選擇工作方式界面中按②鍵進入光譜測量。

4.2參數(shù)設置：按F1進入?yún)?shù)設置：（1）測量波長范圍(700-300)；（2）記錄范圍（0-3

樣間隔（1nm）；（4）光度方式(一般為bs)；（5）掃描速度（一般為中速）。參數(shù)設置完后按

鍵退出參數(shù)設置。

4.3基線校正：在第一樣品池中放入?yún)⒈热芤?，?/p>

比溶液。

4.4掃描：將取出的參比溶液倒掉，換上樣品溶液，放入第一樣品池中，按儀器自動進行掃描。

四、葉綠素含量的計算：

按公式（3）、（4）分別計算葉綠素、b的濃度，相加既得總濃度，也可按公式（6）直接算出葉綠素總濃度。

然后按公式（7）或（8）算出葉綠素總含量：

CT(mg/L)×提取液總體積(L)×稀釋倍數(shù)

葉綠素含量（鮮重%）=—————————————————×100%(7)

樣品鮮重（mg）

CT(mg/L)×提取液總體積(L)×稀釋倍數(shù)

葉綠素含量（mg/g）=—————————————————————(8)

樣品鮮重（g）

實驗四、植物根系活力的測定（TTC法）

一、原理

根是植物的重要器官，它不斷生長，具有汲取水分和礦質(zhì)養(yǎng)分的功能，而且還能進行合成代謝，如氨基酸、植物激素等的合成。所謂根系活力是泛指根的汲取、合成代謝等等的能力。根系活力與汲取作用的強弱有直接關系，與脫氫酶系活性的強弱成正比。TTC法測定根系活力就是根據(jù)根系脫氫酶系氧化還原能力強弱而設計的。

氯化三苯基四氮唑（TTC）是標準氧化還原電位為－80mv的氧化還原物質(zhì)。其氧化態(tài)無色，并溶于水，但被還原后即生成不溶于水的三苯基甲腙，呈紅色，它在空氣中不會自動氧化，相當穩(wěn)定，所以可用TTC作為脫氫酶的氫受體.

植物根所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸、延胡素酸、蘋果酸得到加強；而被丙二酸、碘乙酸等所嚴峻抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性，并作為根系活力的指標。

二、材料與設備

1.植物材料：水培或砂培植物幼苗的根，或仔細洗凈泥土的植物幼苗的根。玉米根系發(fā)達，是較好的實驗材料。

2.設備：721型分光光度計；溫箱；電子天平；研缽1套；鑷子1把；漏斗1個；刻度吸管2ml1支、10ml2支、0.5ml1支；容量瓶10ml1個、刻度試管20ml6支；燒杯500ml1個；石英砂適量。

3.試劑

、乙酸乙酯（分析純）500ml；

、分析純連二亞硫酸鈉（N2S204）粉末少許；

、1%TTC溶液，準確稱取TTC1.000g，溶于水中，定容至100ml；溶液pH應在6.5~7.5，以pH試紙試之，如不易溶解，可先加少量酒精，使其溶解后再加水。

、0.4%TTC溶液，準確稱取TTC0.400g，溶于水中，定容至100ml；

、1/15mol/L磷酸緩沖液（pH=7.0），配制方法為：液：稱取分析純N2HP04·2H2011.876g溶于蒸餾水中成1000ml，B液：稱取分析純KH2P04，9.078g溶于蒸餾水中成1000ml。用時取液60ml、B液40ml混合即成。

、1mol/L硫酸：用量筒取出比重1.84的濃硫酸55ml，邊攪邊加入盛有500mldH2O的燒杯中，冷卻后稀釋至1000ml。

三、實驗步驟（定量測定）

（1）TTC標準曲線的制作：吸取0.25ml0.4%TTC溶液放入10ml刻度試管中，加入少許N2S204粉末[應盡量多加一些，以使TTC充分還原]，搖勻后馬上產(chǎn)生紅色的三苯基甲腙。用乙酸乙酯原液定容至刻度，搖勻。然后分別取此液0.10，0.25，0.50，0.75，1.00ml置10ml刻度試管中，分別加乙酸乙酯4.90，4.75，4.50，4.25，4.00ml，即得到含三苯基甲腙0.01，0.025，0.05，0.075，0.10mg的標準比色系列，以乙酸乙酯做空白作參比，在485nm波長下測定光密度。以TTC還原量為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制標準曲線。

（2）剪取植物根尖1cm部分為實驗材料，稱取0.1g，放入刻度試管中，加入0.4%TTC溶液和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，把根充分浸在溶液內(nèi)，在37℃下保溫40-60min，植物根尖部分成為紅色。之后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反應?？瞻自囼灋橄燃恿蛩嵩偌尤敫鶚悠罚渌僮飨嗤?。

（3）用鑷子將根夾出，沖洗后擦干表面水分，加入少許乙酸乙酯和少量石英砂在研缽內(nèi)研磨，以提取出紅色的三苯基甲腙，把紅色浸提液濾入試管，并用乙酸乙酯洗滌研缽中的殘渣2—3次，至到殘渣為白色。然后用乙酸乙酯將浸提液定容至5ml。浸提液在485nm下比色，以空白試驗（先加硫酸到再加入根樣品操作得到的溶液）作參比，讀出光密度，查標準曲線，求出TTC還原量。

四、結果計算：

TTC還原量（mg）

TTC還原強度=——————————————————（mg·g-1·min-1）

根重（g）×酶促反應時間（min）

實驗五、過氧化氫酶（CT）活性的測定

一、原理：

過氧化氫酶（CT）在植物體內(nèi)普遍存在，它能把過氧化氫分解為水和氧氣。其活性大小以一定時間內(nèi)分解的過氧化氫量來表示。讓酶與定量的底物（過氧化氫）進行定時的反應，反應結束后，再用碘量法測定剩余的過氧化氫量。以鉬酸銨作催化劑，過氧化氫與碘化鉀在酸性條件下反應，放出游離碘。然后用硫代硫酸鈉滴定碘，其反應為：

H2O2+2KI+H2SO4→I2+K2SO4+2H2O

I2+2N2S2O3→2NI+N2S4O6

根據(jù)空白（不加酶液）和測定（加酶液）二者滴定值之差，即可求出酶分解的過氧化氫量。酶活性單位為：分解H2O2mg/g·min

二、材料與設備

1.植物材料：小麥或其它植物葉片

2.設備：電子天平；研缽一套；100ml三角瓶4個；100ml容量瓶2個；50ml酸式滴定管1支；恒溫水??；漏斗1個；濾紙適量；移液管10ml1支、5ml2支、1ml1支。

3.試劑：

碳酸鈣粉末。

1.8mol/L硫酸：取1000ml燒杯1只，加入約500mldH2O，邊攪拌邊加入100ml濃硫酸，冷卻后，用容量瓶定容至1000ml。

10%鉬酸銨溶液。

1%淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小燒杯中加約20ml水調(diào)勻，慢慢傾入約80ml沸水中，在攪拌下加熱至重新沸騰，冷卻后貯于滴瓶中。

0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液：稱取N2S2O3·5H2O25g溶于新煮沸并冷卻過的dH2O中，加入約0.1gN2CO3，并稀釋至1L。保存于棕色試劑瓶中，放置暗處，一天后進行標定。

標定方法：精確稱取分析純K2Cr2O7約0.15g置于500ml三角瓶中，加30mldH2O溶解，加入2gKI和5ml6mol/L鹽酸，在暗處放置5min，然后用水稀釋至200ml，用0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液滴定，當溶液從棕紅色變成淺黃色時，加入1ml淀粉溶液，繼續(xù)滴至溶液由蘭色變成亮綠色（Cr+++離子的顏色）為止，計算出N2S2O3的摩爾濃度。

0.02mol/L硫代硫酸鈉：吸取20ml標定過的0.1mol/L硫代硫酸鈉溶液，加入到100ml容量瓶中，加dH2O定容到刻度。注意現(xiàn)用現(xiàn)配。

0.06mol/L過氫化氫，取1ml30%的過氧化氫用dH2O稱釋至150ml。

三、實驗步驟：

1、酶液提?。悍Q取剪碎混勻的新奇小麥葉片1g置于研缽中，加0.2g碳酸鈣和dH2O2ml，仔細研磨成勻漿。過濾至100ml容量瓶中，用dH2O稱釋至刻度，振蕩片刻，靜置。取10ml溶液再移入另一容量瓶中，加dH2O至刻度，搖勻備用。

2、測定：取100ml三角瓶4個，編號。每瓶加酶液5ml，馬上向

3、4號瓶中加入1.8mol/L硫酸3ml，終止酶的活性，作為空白測定。然后將各瓶放在20℃水浴中保溫，10min后依次向各瓶加入3ml0.06mol/L過氫化氫，搖勻并記錄加入時間，讓酶作用5min，再依次向1、2號瓶各加入3ml1.8mol/L硫酸。然后4個瓶各加入1ml20%碘化鉀、3d鉬酸銨及5d淀粉指示劑，用0.02mol/L硫代硫酸鈉滴定到蘭色消逝。

四、過氧化氫酶活性的計算：

從空白測定的硫代硫酸鈉滴定值減去樣品測定的滴定值，即可求出此期間過氧化氫酶所分解的過氧化氫量。

[空白滴定值（ml）－樣品滴定值（ml）]

被分解的H2O2量（mg）=—————————————————×硫代硫酸鈉（mol/L）×34

2

注：34為H2O2的分子量】

被分解H2O2量（mg）

———————————×酶液總體積（ml）

測定時用酶液（ml）

CT活性（H2O2mg/g·min）=—————————————————

樣品重（g）×時間（min）

實驗六、植物硝酸還原酶(NR)活性的測定

一、原理：

硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。其反應式為：NO3-+NDH+H+—→NO2-+ND++H2O。硝酸還原酶活性高低以生成的亞硝態(tài)氮衡量，酶活性一般以單位時間每克鮮重植物材料還原生成的亞硝態(tài)氮含量表示，即以NO2-ug/g.h為單位。NO2-含量的測定可用磺胺比色法，該方法能測定的NNO2濃度為0.5ug/ml。

亞硝酸鹽與對-氨基苯磺酸（或對-氨基苯磺酰胺）及α-萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。

生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大汲取峰，可用分光光度計測定。

硝酸還原酶活性的測定可分為活體法和離體法?；铙w法步驟簡單，硝酸還原酶不用從植物組織中提取出來，其作用產(chǎn)物NO2-可以從組織內(nèi)滲透到外界溶液中，通過測定反應液中NO2-含量的增加，即能表明酶活性的大小。

硝酸還原酶是一種誘導酶，當向培養(yǎng)介質(zhì)中加入硝酸鹽時，植物體內(nèi)很快就會出現(xiàn)硝酸還原酶。

二、材料設備：

1.植物材料：小麥、玉米或其它植物材料的葉片。

2.設備：分光光度計；真空抽氣裝置；溫箱；打孔器；電子天平；小三角瓶；試管；移液管5ml的2支、2ml的4支。

3.試劑：

、0.2mol/L硝酸鉀溶液：溶解10.11g硝酸鉀于dH2O中，定容至500ml。

、0.1mol/L磷酸緩沖液，PH=7.5

液：0.2mol/LNH2PO4，取NH2PO427.8g,dH2O溶解，配制成1000ml溶液。

B液：0.2mol/LN2HPO4，取N2HPO471.7g，dH2O溶解，配制成1000ml溶液。

取液16ml、B液84ml，混合，用dH2O稀釋至200ml。

、磺胺試劑：1g磺胺（或對氨基苯磺酸）加25ml濃鹽酸，用dH2O稀釋至100ml。

、α-萘胺試劑：0.2gα-萘胺溶于含1ml濃鹽酸的dH2O中，定溶至100ml?；驅ⅵ?萘胺溶于25ml的冰醋酸中，用dH2O稀釋至100ml。

、亞硝酸鈉標準液：稱取R級NNO20.1000g，用dH2O溶解、定溶至100ml，取5ml，再用dH2O稀釋至1000ml，即為NO2-含量是5ug/ml的標準液。

三、實驗步驟

1、將新奇的葉片用水洗凈，吸水紙吸干表面水分，然后用打孔器打成直徑為1cm的園片，稱取等量葉園片2份（每份0.2—0.3g），用dH2O洗滌2—3次，吸干水分，分別置于含有下列溶液的2個50ml三角瓶中：（1）0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.5)5ml+dH2O5ml,(2)0.1mol/L磷酸緩沖液(PH7.5)5ml+0.2mol/LKNO35ml。注意將溶液浸沒植物材料，然后將三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽氣7-10min，放氣后，園片即沉于溶液中。將三角瓶置于30℃溫箱中，不見光，保溫30min。

注意取樣前葉子要進行一段時間的光合作用，以積存碳水化合物，如果組織中的碳水化合物含量低，會使酶的活性降低。

2、NO2-含量測定：

保溫30min結束后，分別取出1ml反應液于試管中，加入磺胺試劑或對氨基苯磺酸2ml，搖勻。再加入α-萘胺試劑2ml，搖勻。注意各試劑的加入順序。在30℃溫箱中保溫30min，用分光光度計在520nm波長比色，測定光密度。從標準曲線上查得NO2-含量，然后計算酶活性。單位為NO2-ug/g.h。

3、標準曲線的制作：取7支試管，編號，按下表順序添加試劑，每加入一種試劑后注意搖勻。待試劑

加完后，將各試管置30℃溫箱中保溫30min，馬上于520nm波長下進行比色，讀出光密度，以光密度為縱坐

標，NO2-濃度為橫坐標繪制標準曲線。

◆注意：測定NO2-的磺胺比色法很靈敏，可以檢出低于1ug/ml的NNO2含量，由于顯色反應的速度與重氮化作用及偶聯(lián)作用的速度有關，溫度、酸濃度等都影響顯色速度，同時也影響靈敏度，但如果標準曲線與樣品的測定都在相同條件下進行則顯色速度相等，彼此可以比較。

四、結果計算:

硝酸還原酶活性g·g-1·h-1

）

實驗七、植物細胞膜透性的測定

一、原理：

植物組織受不良環(huán)境條件（如干旱、低溫、高溫、鹽漬和大氣污染）危害時，細胞膜的結構和功能首先

受到損害，使細胞膜透性增大，導致細胞的內(nèi)含物會有不同程度的外滲。若將受損害的組織浸入無離子水中，其外滲液中電解質(zhì)的含量增加。組織受損害越嚴峻，電解質(zhì)含量增加得越高。用電導儀測定外滲液電導度的變化，可反映出質(zhì)膜受損害的程度。透性變化愈大，電導度愈大，表示受損害愈重，也就表示抗性愈弱。

二、材料與設備：

1.植物材料：選取小麥或其它作物一定葉位和葉齡的功能葉片。

2.設備：電導儀1套，真空抽氣裝置1套；50ml三角瓶3只；剪子1把；濾紙適量，打孔器1個，玻棒2根。

3.試劑：ddH2O或去離子水。

三、實驗步驟：

1、清洗用具：電導法對水和容器的潔凈度要求嚴格，器皿稍有雜質(zhì)即產(chǎn)生電導度的很大誤差。故所用玻璃用具洗凈后，再用自來水、無離子水沖洗四、五次。倒置于洗凈而墊有潔凈濾紙的盤中。

2、取樣及處理：分別在正常生長和逆境脅迫的植株上取同一部位的功能葉若干片，分成2份。用紗布擦凈表面灰塵。將其中一份低溫處理：放在-20℃左右的溫度下冷凍20min（或高溫處理：置40℃左右的恒溫箱中處理30min）；另一份裹入潮濕的紗布中放置在室溫下作對比。處理后分別用去離子水沖洗兩次，用

潔凈的濾紙吸干，然后用打孔器（1cm2

）將葉片打取12個葉園片，分別放入三角瓶中，準確加入20ml的

無離子水，浸沒葉片，然后放入真空抽氣裝置中抽氣約10min，以抽出細胞間隙空氣，緩緩放氣，水即滲入細胞間隙，葉子變成透明狀，沉在三角瓶底部，取出三角瓶，放在室溫下保持30min，間或搖動幾次。

3、測定：將電導儀的電極插入三角瓶中，測定外滲液的電導值，記錄其初始電導值（S1）。之后，將三角瓶放入沸水浴中5min，以殺死組織。待冷至室溫后，再次測定外滲液的電導值（S2）。

四、結果計算：

按下式計算相對電導度：

相對電導度（L）=S1/S2

相對電導度的大小表示細胞受損害程度。

由于對比（在室溫下）也有少量電解質(zhì)外滲，故可按下面公式計算由于高溫或低溫脅迫而產(chǎn)生的外滲，稱為損害度。

損害度（%）=（Lt–Lck）/（1-Lck）×100%

式中：Lt——處理葉片的相對電導度；Lck——對比葉片的相對電導度。

實驗八、植物光合速率的測定

I.TPS-1便攜式光合作用測定系統(tǒng)

一、原理：

1.測定CO2和H2O的值是通過測定參比氣體（進入葉室氣體中的CO2和H2O濃度）和流出葉室氣體中的CO2和H2O濃度（分析氣）的濃度差值來實現(xiàn)的。

CO2對紅外線的最大汲取波長是4.26μm.。TPS利用這一汲取特點測定CO2的濃度。水蒸氣壓是由一個電容傳感器測定的。

2.儀器測定參數(shù)：光合速率、蒸騰速率、氣孔導度、葉片溫度、細胞間隙CO2濃度、大氣濕度、大氣溫度、大氣CO2濃度、光合有效輻射、光—光合響應曲線、CO2—光合響應曲線。并且可以通過這些響應曲線計算出RuBP羧化效率、表觀量子產(chǎn)量、光補償點、CO2補償點、光飽和點、CO2飽和點、RuBP最大再生速率以及光合作用氣孔限制值等一些非常有用的生理生態(tài)參數(shù)。

二、材料與設備：

1.材料：綠色植物葉片

2.設備：英國PP公司TPS-1便攜式光合作用測定系統(tǒng)。TPS-1是以開放式氣路系統(tǒng)原理設計的光合作用測定系統(tǒng)，主要由主機和葉室兩部分組成。

三、操作步驟：

◆打開TPS前，請進行以下檢查：

1.如果TPS與葉室連用，在打開電源之前要確定葉室與TPS-1系統(tǒng)是否正確連接，如果正確連接，開機后TPS-1系統(tǒng)會自動檢測。

2.檢查汲取管中的化學試劑，必要時應更換（參考汲取管和化學試