MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用11

第頁(yè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告生命科學(xué)中的細(xì)胞模型姓名：龍珍學(xué)號(hào)：201920285院系：藥學(xué)院專業(yè)：藥理學(xué)提交日期：2012年3月31日實(shí)驗(yàn)一ＭＴＴ法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用實(shí)驗(yàn)原理：ＭＴＴ比色法原理是活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能將淡黃色的ＭＴＴ還原為藍(lán)紫色的結(jié)晶甲臜。后者結(jié)晶產(chǎn)物的量及活細(xì)胞數(shù)目成正相關(guān)，而死細(xì)胞或紅細(xì)胞沒有此功能。結(jié)晶用ＤＭＳＯ、無(wú)水乙醇、酸化異丙醇等溶解，在酶標(biāo)儀上以波長(zhǎng)為490ｎｍ進(jìn)行比色,所檢測(cè)的吸光值的大小可反應(yīng)細(xì)胞代謝活性的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)步驟：貼壁細(xì)胞消化和吹打(加1ml0.5%胰蛋白酶并輕搖使其遍布所有細(xì)胞表面至鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、間隙增大停止,倒掉,加入含小牛血清的培養(yǎng)液,反復(fù)吹打至瓶壁上無(wú)貼壁細(xì)胞為止。)計(jì)數(shù)及分板(取20ul細(xì)胞懸液于計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用1640培養(yǎng)液調(diào)整使其細(xì)胞數(shù)約為1×105個(gè)/ml,在96孔培養(yǎng)板中加入細(xì)胞懸液每孔100ul,共18個(gè),培養(yǎng)箱孵育12h。)加藥及孵育(于培養(yǎng)板中分別加入濃度為0.1,0.2,0.4,0.8,1.6mg/ml環(huán)磷酰胺注射液各100ul,每組重復(fù)3孔,設(shè)空白對(duì)照組3孔各100ul,孵育2~3小時(shí)。)MTT顯色(每孔加MTT20ul，3小時(shí)候棄上清，每孔加DMSO100ul。)酶標(biāo)儀測(cè)定(490nm處測(cè)其吸光度實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論:1.不同濃度藥物的生長(zhǎng)抑制率如下濃度（ug/ml）吸光度（x±s）抑制率（%）存活率（%）00.594333±010.384333±0.0086635.333764.66630.20.505333±0.00577414.974885.02520.40.376±0.08198436.735863.26420.80.261667±0.00461955.973144.02691.60.207667±0.00173265.058934.94112.細(xì)胞存活率-藥物劑量對(duì)數(shù)圖IC50=679.218ug/ml3.討論：eq\o\ac(○,1.)加藥之前細(xì)胞貼壁效果不是很好，分布不太均勻，個(gè)別孔細(xì)胞有點(diǎn)聚集，加MTT之前藥物抑制作用明顯，尤其體現(xiàn)在是濃度為1.6mg/ml組。濃度為0.5mg/ml抑制相對(duì)明顯，其他孔在形態(tài)上看不到太明顯現(xiàn)象。eq\o\ac(○,2.)加DMSO之后顏色對(duì)比明顯，并且梯度效果比較好，平行孔間顏色較均勻，而且濃度為0.4ug/ml的顏色和其它孔之間也有區(qū)別，能夠體現(xiàn)出抑制作用。eq\o\ac(○,3)最后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)得的OD值和上述觀察到的現(xiàn)象較吻合。eq\o\ac(○,4).前面已經(jīng)說(shuō)到細(xì)胞的貼壁效果不是很好，所以不能夠完全判定藥物的抑制作用，因?yàn)槿绻變?nèi)的細(xì)胞狀態(tài)不好也有可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實(shí)驗(yàn)二HE染色法觀察藥物作用細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化實(shí)驗(yàn)原理：HE染色法采用兩種染料即堿性染料蘇木素和酸性染料伊紅分別及細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)生作用，使細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)通過(guò)顏色而改變它的折射率,從而在光鏡下能清晰顯示出細(xì)胞圖像,染色的結(jié)果是酸性的細(xì)胞核被堿性的蘇木素染成藍(lán)色，堿性的細(xì)胞質(zhì)被酸性的伊紅染成紅色。實(shí)驗(yàn)步驟：樣品制備:胰酶消化貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml,每孔2ml加于6孔板,加蓋玻片,加入藥物培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間,取出蓋玻片,用PBS洗滌3次。樣品固定:95%乙醇固定20min后PBS清洗2次。染細(xì)胞核:蘇木精染色5-10min后自來(lái)水水洗。染細(xì)胞質(zhì):伊紅染色1-2min后自來(lái)水水洗。脫水、透明:70%，95%，100%乙醇逐級(jí)脫水,二甲苯透明,吹干。封片:中性樹脂封片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析:這是空白對(duì)照，可以看到細(xì)胞核細(xì)胞漿的染色比較漂亮，細(xì)胞核中的核仁數(shù)目是正常的，細(xì)胞核較完整，并且可以看到有個(gè)別細(xì)胞的細(xì)胞核皺縮，說(shuō)明處于死亡狀態(tài)。這是濃度為0.1mg/ml組，這組的藥物抑制作用不是很明顯，幾乎及空白對(duì)照差不多。這組是濃度0.2mg/ml，藥物抑制作用有體現(xiàn)，并有一處細(xì)胞核破碎，可看到有部分細(xì)胞核皺縮，這組的染色非常的漂亮。濃度為0.4mg/ml組，這組的細(xì)胞質(zhì)染色較淺，并且看不清藥物的抑制作用。濃度為0.8mg/ml，這一組的染色效果很好，但是也看不到藥物的抑制作用，反而可以看到有很多的細(xì)胞正處于分化狀態(tài)。（已經(jīng)做標(biāo)記）藥物濃度1.6mg/ml，這組的細(xì)胞核染色較淺，整體上看不到抑制作用，并有個(gè)別細(xì)胞核進(jìn)行分裂。綜上所述，藥物對(duì)細(xì)胞的抑制作用不明顯，并且體現(xiàn)不出濃度趨勢(shì)，但是整體的染色效果還算可以。實(shí)驗(yàn)三吖啶橙熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化實(shí)驗(yàn)原理：吖啶橙是一種及DNA和RNA都能結(jié)合的熒光染料，在藍(lán)色光或紫外光的激發(fā)下，DNA和RNA都會(huì)激發(fā)出熒光，活細(xì)胞經(jīng)過(guò)固定，染色后細(xì)胞DNA成亮綠色，核仁和散布在細(xì)胞質(zhì)中的RNA成橘紅色，胞質(zhì)的其余部分為淡紅褐色。死亡的細(xì)胞，因?yàn)槲镔|(zhì)就夠發(fā)生變化，其細(xì)胞核成暗綠色，細(xì)胞質(zhì)也是成暗綠色。實(shí)驗(yàn)步驟：胰酶消化貼壁細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/ml,每孔2ml加于6孔板,加蓋玻片,加入藥物培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間,取出蓋玻片,用PBS洗滌3次,除去血清→95%乙醇固定15~30min→1%醋酸作用30s→1×10-4AO染色30s~60s→0.1MCaCl2處理30s~2min,PBS漂洗3次→PBS封片實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：空白對(duì)照組，染色效果較好，可以看到個(gè)別細(xì)胞正在分裂濃度為0.1mg/ml,藥物作用不明顯，染色很漂亮，濃度為0.2mg/ml,及對(duì)照組沒有明顯區(qū)別濃度為0.4，能夠觀察到一點(diǎn)抑制作用，個(gè)別細(xì)胞的核仁變多，并且有個(gè)別細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生邊緣化，還有細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。（已做標(biāo)記）濃度為0.8mg/ml,藥物作用不明顯，但能看到空泡化，而且有細(xì)胞正在進(jìn)行分化，還有分化剛剛結(jié)束，（請(qǐng)看標(biāo)記）實(shí)驗(yàn)四TRIzol試劑快速分離細(xì)胞和組織中的RNA、ＤＮＡ、蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)原理：TRIzol試劑是目前最常用的細(xì)胞和組織中分離ＲＮＡ的試劑，其主要成分是苯酚，苯酚的作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白和核酸物質(zhì)釋放，由于ＲＮＡ極易被ＲＮａｓｅ分解，所以TRIzol中常加入８－羥基喹啉，異硫氰酸胍等來(lái)抑制內(nèi)源性和外源性ＲＮａｓｅ活性，以保證ＲＮＡ完整。TRIzol試劑還利用RNA、ＤＮＡ、蛋白質(zhì)在不同溶液中的溶解性質(zhì),加入氯仿離心后,溶液分為水相、中間層和有機(jī)相,取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA,用乙醇沉淀中間層可回收DNA,用異丙醇沉淀可回收蛋白質(zhì),從而實(shí)現(xiàn)三者快速分離。實(shí)驗(yàn)步驟：樣品處理:TRIzol處理后的樣品在室溫放置5min,每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,劇烈震蕩15s,室溫放置3min,離心15min.樣品分三層:底層為紅色有機(jī)相,上層為無(wú)色水相和一個(gè)中間層.RNA主要在水相,中間層和有機(jī)層用于分離DNA和蛋白質(zhì)。RNADNA蛋白質(zhì)取2ul在核算微量檢測(cè)儀上測(cè)量ＤＮＡ濃度另?。玻酰煸诃傊悄z中跑電泳取2ul在核算微量檢測(cè)儀上測(cè)量ＤＮＡ濃度另?。玻酰煸诃傊悄z中跑電泳試問晾干后NaOH溶解，再用TE，HEPES調(diào)節(jié)PH雙縮脲試劑檢驗(yàn)室溫晾干后１％ＳＤＳ溶解蛋白質(zhì)75%乙醇洗DNA沉淀后再離心?。玻酰鞓悠酚煤怂阄⒘繖z測(cè)儀測(cè)量ＲＮＡ濃度放置干燥RNA沉淀，用無(wú)Rnase水在55-60度下溶解ＲＮＡ中間和有機(jī)相加無(wú)水乙醇沉淀后離心異丙醇沉淀蛋白質(zhì)放置10分鐘后離心２－８度１００００ｇ離心１０分７５％乙醇洗滌沉淀，離心異丙醇沉淀水相中的ＲＮＡ分離蛋白，DNA沉淀用含10%乙醇分離蛋白，DNA沉淀用含10%乙醇檸檬酸鈉洗滌，室溫放置5分后離心，棄上清重復(fù)一次95%乙醇洗滌沉淀，放置5分后離心，棄上清，重復(fù)兩次，再用用無(wú)水乙醇同樣方法洗一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析：1、RNA電泳圖如下：可以看到28s的亮度不夠，甚至要比18s的亮度低，18s，5s比較正常，2.OD（260nm）/OD（280nm）濃度DNA1.14180.3ng/mlRNA2.011763.9ng/ml3．蛋白質(zhì)及雙縮脲試劑的反應(yīng)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，但是不是很明顯。4.本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果雖然都出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，但是導(dǎo)致得到的物質(zhì)的收率不是很高有以下幾個(gè)原因:RNA的得率：樣品勻漿時(shí)實(shí)際量太少，只是樣品裂解不夠徹底，RNA沉淀沒有完全溶解，還有一些污染等原因?qū)е翿NA降解。DNA蛋白質(zhì)得率：樣品的勻漿和裂解的不徹底，得到的沉淀沒有很好溶解,再就是得到的組織沒有馬上處理導(dǎo)致樣品的降解。我們只有嚴(yán)格的按照試驗(yàn)的流程操作，從操作步驟，樣品和儀器的準(zhǔn)備，以及注意一些操作環(huán)境的維護(hù)的事項(xiàng)，這樣才能夠得到欲想要的大分子，進(jìn)而進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)五流式細(xì)胞儀凋亡分析ＡｎｎｅｘｉｎＶ／７-ＡＤＤ雙染色法實(shí)驗(yàn)原理：在凋亡的早期階段，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子快速持續(xù)上升，使谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶被激活，造成胞質(zhì)磷脂不對(duì)稱喪失，導(dǎo)致膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞內(nèi)層暴漏及外層，Ａｎｎｅｘｉｎ-Ｖ為３５－３６ＫＤ的鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，并可被ＦＩＴＣ熒光物指標(biāo)記，故ＡｎｎｅｘｉｎＶ被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)記之一，７－ＡＤＤ是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡晚期和壞死的細(xì)胞，因?yàn)榧?xì)胞膜受到破壞，而使細(xì)胞核染色。實(shí)驗(yàn)步驟：2ml(濃度為1×106/ml)細(xì)胞接種于6孔板/培養(yǎng)皿,培養(yǎng)24h后,加入合適凋亡誘導(dǎo)劑,設(shè)置空白對(duì)照1孔,加入同濃度藥物各3孔(實(shí)驗(yàn)組)→進(jìn)行細(xì)胞干預(yù)刺激24h,收集并用PBS洗滌,計(jì)數(shù),離心→制備單細(xì)胞懸液,將細(xì)胞懸重于200ul的1×bindingbuffer中,每個(gè)樣本濃度約為1×106/ml→100ul制備好細(xì)胞懸液加入到12mm×75mm試管→加入5ulＡｎｎｅｘｉｎ-Ｖ及７－ＡＤＤ于制備好細(xì)胞懸液中,混勻,室溫孵育5min,加入400ul稀釋后的bindingbuffer,1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)→測(cè)定要做3管對(duì)照eq\o\ac(○,1)單純細(xì)胞樣本eq\o\ac(○,2)細(xì)胞樣本只加入5ulＡｎｎｅｘｉｎ-Ｖeq\o\ac(○,3)細(xì)