p21p27基因多態(tài)性對(duì)食管癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響

1/1p21，p27基因多態(tài)性對(duì)食管癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響p21，p27基因多態(tài)性對(duì)食管癌的發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響作者：

馬玉泉楊曉光劉暉李保慶劉俊峰【摘要】目的：

探討p21基因外顯子3非翻譯區(qū)（UTR)第20堿基對(duì)的核苷酸多態(tài)性(SNPs)以及p27基因第109密碼子的SNP對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響.方法：

采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）片段長(zhǎng)度分析和PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）方法檢測(cè)p21基因外顯子的3UTR第20堿基對(duì)SNP以及p27基因第109密碼子SNP位點(diǎn)的基因型.結(jié)果：

p21和p27的基因型分布在ESCC組及對(duì)照組中均符合HardyWeinberg平衡（Pgt;0.05），在ESCC組和對(duì)照組中，ESCC患者p21基因3UTR和p27基因第109密碼子的多態(tài)性基因型和等位基因型分布與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.吸煙狀況分層分析發(fā)現(xiàn)，吸煙患者p21的TT基因型頻率（26.0%）顯著高于健康吸煙組（12.0%）（2=8.60，P=0.014）.與CC基因型相比，攜帶TT基因型可顯著增加吸煙者的ESCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn).經(jīng)性別和年齡校正的比值比（OR）及其95%的可信區(qū)間（CI）分別為3.36（95%，CI=1.45～7.75），而在非吸煙的患者和健康個(gè)體中，p21基因型及等位基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p27基因型及等位基因型頻率在吸煙及非吸煙患者和健康個(gè)體中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分層分析結(jié)果表明，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的p21的TT基因型頻率（26.4%）顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（15.3%）（2=6.128，P=0.013）.與常見(jiàn)單體型C/C相比，攜帶TT基因型與TT+T/C基因型可明顯增加ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，其性別、年齡校正的OR值及其95%的CI分別為3.11（95%，CI=1.28～7.52）和1.98（95%，CI=1.03～3.80），而p27基因多態(tài)性在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p27基因多態(tài)性與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)性無(wú)關(guān).結(jié)論:p21基因3UTR和p27基因第109密碼子的多態(tài)性基因型和等位基因型不單獨(dú)影響ESCC的發(fā)生和發(fā)展；p213UTR的TT等位基因可能增加吸煙人群ESCC易感性，并可能增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)性.【關(guān)鍵詞】食管鱗狀細(xì)胞癌；p21基因；p27基因；多態(tài)性；易感性；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0引言p21和p27基因是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑（cyclindependentkinaseinhibitors,CDKI）家族中的重要成員［1］，其多態(tài)性與一些惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌的易感性有關(guān)［2-4］，但其與食管癌易感性的相關(guān)研究在還鮮見(jiàn)報(bào)道.我們采用基于醫(yī)院病例對(duì)照研究方法，觀(guān)察p21，p27基因型與食管癌發(fā)病及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以探討p21基因外顯子3非翻譯區(qū)（untranslatedregion,UTR）第20堿基對(duì)的核苷酸多態(tài)性(singlenucleolidepolymorphisms,SNPs)以及p27基因第109密碼子的SNP對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC)發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響.1對(duì)象和方法1.1對(duì)象選擇2003/2005河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行胃鏡檢查或住院手術(shù)治療的ESCC患者202例作為病例組，其中185例有相關(guān)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.選擇同期在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行健康查體人員及河北省血站的無(wú)腫瘤及遺傳病史健康獻(xiàn)血者265例，作為對(duì)照組.以上人員來(lái)自石家莊市或相鄰市、縣，均為漢族，無(wú)血緣關(guān)系.信息由2名專(zhuān)業(yè)人員詢(xún)問(wèn)并記錄.病例組患者的年齡、性別、吸煙狀態(tài)、家族史、病理類(lèi)型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況來(lái)自住院病歷.以往或目前日吸煙5支以上并持續(xù)2a以上者被定義為吸煙個(gè)體；家族中有1名以上一級(jí)親屬和/或2名以上二級(jí)親屬患者屬患食管癌、賁門(mén)癌或胃癌者被定義為上消化道腫瘤（uppergastrointestinalcancers,UGIC）家族史陽(yáng)性.1.2方法抽取外周靜脈血5mL，經(jīng)枸櫞酸鈉抗凝，于4℃冰箱保存，并于采血后1wk內(nèi)提取外周血白細(xì)胞DNA.p21，p27基因型檢測(cè)采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）片斷長(zhǎng)度分析和PCR限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis,RFLP）PCRRFLP方法進(jìn)行.p21SNP擴(kuò)增引物5GAATTTGCCGTTGGGTCAAG3（上游引物）和5AGGAGAACACGGGATGAGGAG3（下游引物）.3UTR發(fā)生一個(gè)CT的替代，從而產(chǎn)生一個(gè)PstⅠ限制性酶切位點(diǎn)，T等位基因存在該識(shí)別位點(diǎn).p27SNP擴(kuò)增引物為5TGCAGACCCGGGAGAAAG3（上游引物）和5CCGCTAACCCCGTCTGG3（下游引物），第109密碼子發(fā)生一個(gè)TG的替代，從而產(chǎn)生一個(gè)BlgⅠ限制性酶切位點(diǎn)，G等位基因存在該識(shí)別位點(diǎn).PCR反應(yīng)體系均為25L，其中模板DNA100ng，10PCR緩沖液2.5L，TaqDNA聚合酶（北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司）2.5U，MgCl21.5mmol/L，dNTPs0.2mmol/L，上、下游引物各0.2mol/L.p21PCR反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5min，94℃30s，64.8℃30s，72℃60s，共35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min.p27PCR反應(yīng)條件為：

94℃預(yù)變性5min，94℃30s，58℃30s，72℃60s，共35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min.取8LPCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性?xún)?nèi)切酶消化，經(jīng)30g/L瓊脂糖凝膠電泳分析基因型.對(duì)p21，p27基因的PCR產(chǎn)物，分別經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶PstI和BlgI37℃過(guò)夜消化.每一批PCR反應(yīng)均以蒸餾水替代DNA作為陰性對(duì)照.100g/LDNA標(biāo)本進(jìn)行二次分型以證實(shí)分型方法的可靠性.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：

采用SPSS12.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，基因型頻率觀(guān)察值和預(yù)期值采用HardyWeinberg平衡檢驗(yàn)，病例組與對(duì)照組的基因型和等位基因型分布比較均采用2檢驗(yàn).以非條件Logistic回歸法計(jì)算經(jīng)性別和年齡校正的比值比（oddsratio，OR）及其95%的可信區(qū)間（confidenceinterval，CI）.Plt;0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1患者一般特征ESCC組與對(duì)照組間的性別、年齡構(gòu)成比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.吸煙者比例ESCC組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2=0.01，P=0.98）.ESCC患者中UGIG家族史陽(yáng)性者比例（26.2%）顯著高于對(duì)照組（4.1%）（2=20.49，P=0.000）.經(jīng)性別和年齡校正的OR值及其95%的CI為8.475（95%，CI=2.85～25）.有臨床資料185例ESCC患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移87例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移98例，沒(méi)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例.PCRRFLP檢測(cè)結(jié)果顯示，ESCC組與對(duì)照組p21，p27基因的多態(tài)性基因型與原始結(jié)果100%吻合.2.2p21，p27基因SNPs分布p21基因T/T基因型產(chǎn)物為133和735bp2個(gè)片段；C/C基因型產(chǎn)物為133，256和479bp3個(gè)片段；C/T基因型產(chǎn)物為133，256，479和735bp4個(gè)片段（圖1）.p27基因T/T基因型產(chǎn)物為76和378bp2個(gè)片段；G/G基因型產(chǎn)物為76，113和265bp3個(gè)片段；T/C基因型產(chǎn)物為76，113，265和378bp4個(gè)片段（圖2）.p21的T，C等位基因頻率和T/T，C/T，C/C基因型頻率在ESCC組和對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05，表1）.吸煙狀況分層分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p21的T/T基因型頻率ESCC吸煙組（26.0%）顯著高于健康吸煙組（12.0%）（2=8.60，P=0.014).經(jīng)性別和年齡校正的OR值及其95%的CI為3.36（95%，CI=1.45～7.75），而在非吸煙的患者和健康個(gè)體中，p21基因型及等位基因型頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.p27等位基因型及基因型SNPs分布在ESCC組和對(duì)照組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.吸煙狀況分層分析p27等位基因型及基因型SNPs分布在ESCC組和對(duì)照組之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）.2.3p21，p27基因SNPs分布與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組p21的T/T基因型頻率（26.4%）顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（15.3%）（2=6.128，P=0.013）.經(jīng)性別、年齡校正的OR值及其95%的CI為3.11（95%,CI=1.28～7.52）.淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況分層分析結(jié)果顯示,p27等位基因型及基因型SNPs分布在ESCC組與對(duì)照組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）.表1p21，p27基因SNPs分布表2p21，p27基因SNPs分布與吸煙的分層分析表3p21，p27基因SNPs與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系3討論p21和p27基因能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，被認(rèn)為是腫瘤抑制基因，其多態(tài)性及蛋白表達(dá)與多種腫瘤的易感性及預(yù)后有關(guān)［5-6］.本研究結(jié)果顯示，病例總體分析并未發(fā)現(xiàn)p21基因3UTR第20堿基對(duì)的多態(tài)性與ESCC的易感性相關(guān).然而，對(duì)吸煙狀況的分層分析發(fā)現(xiàn)，與CC基因型相比，攜帶TT基因型可使吸煙人群ESCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加3倍.而在非吸煙的患者和健康個(gè)體中，p21的基因型及等位基因型頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說(shuō)明TT基因型可增加吸煙者患ESCC的風(fēng)險(xiǎn)，表明TT基因型的過(guò)量表達(dá)可能與吸煙所誘導(dǎo)的代謝改變相互作用，從而影響ESCC的易感性.周?chē)?rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響UGIC患者預(yù)后和生存率的重要因素.因此，找到分子生物學(xué)指標(biāo)來(lái)預(yù)測(cè)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，從而制定個(gè)體化的治療方案具有重要價(jià)值.通過(guò)對(duì)ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分層后發(fā)現(xiàn)與CC基因型相比，攜帶TT基因型可使ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性增高3倍，攜帶TT+T/C基因型可使ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性增高近2倍，這表明攜帶TT或TT+T/C基因型的ESCC患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，提示攜帶該基因型的ESCC患者在臨床治療時(shí)應(yīng)盡可能進(jìn)行淋巴結(jié)清掃，并進(jìn)行相應(yīng)的術(shù)后綜合治療，以減少淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶的殘留.綜上所述，p27基因V109G多態(tài)性與食管癌的易感性無(wú)相關(guān)關(guān)系，經(jīng)吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分層分析也未顯示出差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.p27基因在腫瘤細(xì)胞中很少有突變和甲基化［7］，且其功能的改變是轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，因此對(duì)于其基因多態(tài)性與腫瘤易感性的相關(guān)性研究的價(jià)值可能會(huì)減少.【參考文獻(xiàn)】［1］GomesCC,DrummondSN,GuimaraesAL,etal.p21/WAF1andcyclinD1variantsandoralsquamouscellcarcinoma［J］.JOralPatholMed，2008,37(3):151-156.［2］IzawaH,YamamotoH,DamdinsurenB,etal.Effectsofp21cip1/waf1overexpressionongrowth,apoptosisanddifferentiationinhumancoloncarcinomacells［J］.IntJOncol，2005,27(1):69-76.［3］LiG,SturgisEM,WangLE,etal.AssociationbetweentheV109Gpolymorphismofthep27geneandtheriskandprogressionoforalsquamouscellcarcinoma［J］.ClinCancerRes，2004,10(12):3996