蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(一)膠體性質(zhì)

蛋白質(zhì)的分子量1萬-100萬之間，其分子直徑1-100nm之間，在膠體顆粒的范圍。蛋白質(zhì)的水溶液是一種比較穩(wěn)定的親水膠體，這是因為在蛋白質(zhì)顆粒表面帶有很多極性基團，如

NH3、

COO-、

OH-、

SH、

CONH2等和水有高度親和性，當?shù)鞍踪|(zhì)與水相遇時，就很容易在蛋白質(zhì)顆粒外面形成—層水膜。

第2頁,共34頁，星期六，2024年，5月

所以蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，如布朗運動、光散射、電泳、不能透過半透膜及具有吸附能力等。利用蛋白質(zhì)不能透過半透膜的性質(zhì)，可用羊皮紙、火棉膠、玻璃紙等來分離純化蛋白質(zhì)，這個方法稱透析（dialysis）。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(一)膠體性質(zhì)第3頁,共34頁，星期六，2024年，5月(二)兩性解離及等電點

蛋白質(zhì)同氨基酸一樣也是兩性電解質(zhì)，即能和酸作用，也能和堿作用。蛋白質(zhì)分子中可解離的基團除肽鏈末端的

-氨基和

-羧基外，主要還是多肽鏈中氨基酸殘基上的側鏈基團如

-氨基、

-羧基、

-羧基、咪唑基，胍基、酚基、疏基等。在一定的pH條件下，這些基團能解離為帶電基團從而使蛋白質(zhì)帶電。

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第4頁,共34頁，星期六，2024年，5月

蛋白質(zhì)的等電點（pI）：當某蛋白質(zhì)在一定的pH的溶液中，所帶的正負電荷相等，它在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值叫做該蛋白質(zhì)的等電點。酸性蛋白、堿性蛋白

蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)與溶液的pH有關。利用蛋白質(zhì)的兩性解離可以通過電泳分離純化蛋白質(zhì)。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(二)兩性解離及等電點

第5頁,共34頁，星期六，2024年，5月蛋白質(zhì)受到某些理化因素的影響，其空間結構發(fā)生改變，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學功能隨之改變或喪失，但未導致蛋白質(zhì)一級結構的改變，這種現(xiàn)象叫變性作用（denaturation）。

1.蛋白質(zhì)變性的概念2.蛋白質(zhì)變性的因素物理因素：加熱、紫外線、超聲波、高壓等；化學因素：強酸、強堿、脲、鹽酸胍、去垢劑、重金屬鹽等；(三)蛋白質(zhì)的變性四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第6頁,共34頁，星期六，2024年，5月生物活性喪失（酶）；溶解度降低，粘度增大，擴散系數(shù)變小（蛋清）；基團位置改變；對蛋白酶敏感性增大。3.蛋白質(zhì)變性后的表現(xiàn)四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(三)蛋白質(zhì)的變性第7頁,共34頁，星期六，2024年，5月4.蛋白的復性

蛋白質(zhì)的變性作用若不過于劇烈，則是一種可逆過程。高級結構松散了的變性蛋白質(zhì)通常在除去變性因素后，可緩慢地重新自發(fā)折疊形成原來的構象，恢復原有的理化性質(zhì)和生物活性，這種現(xiàn)象稱為復性(renaturation)。

大多蛋白質(zhì)變性后，很難復性。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(三)蛋白質(zhì)的變性第8頁,共34頁，星期六，2024年，5月(四)蛋白質(zhì)的沉淀加入適當試劑使蛋白質(zhì)分子處于等電點狀態(tài)或失去水化層，蛋白質(zhì)的膠體溶液就不穩(wěn)定,并將產(chǎn)生沉淀。能使蛋白質(zhì)沉淀的試劑有：1.高濃度中性鹽

（NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl（中和蛋白質(zhì)的電荷）這種加入鹽使蛋白質(zhì)沉淀析出的現(xiàn)象稱為鹽析，用于蛋白質(zhì)分離制備。2.有機溶劑

丙酮、乙醇

(破壞蛋白質(zhì)水膜)四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第9頁,共34頁，星期六，2024年，5月3.重金屬鹽

Hg2+、Ag+、Pb+

（與蛋白質(zhì)中帶負電基團形成不易溶解的鹽,或改變蛋白質(zhì)的空間結構）

4.生物堿試劑苦味酸、目酸、鎢酸等

（與蛋白質(zhì)中帶正電荷的基團生成不溶性鹽）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(四)蛋白質(zhì)的沉淀第10頁,共34頁，星期六，2024年，5月(五)蛋白質(zhì)的顏色反應1.雙縮脲反應雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產(chǎn)生紅紫色絡合物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質(zhì)分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應。通常可用此反應來定性鑒定蛋白質(zhì)，也可根據(jù)反應產(chǎn)物的顏色深淺在540nm處進行蛋白質(zhì)的定量測定。

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第11頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.酚試劑（Folin-酚試劑）反應蛋白質(zhì)分子中一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能將Folin-酚試劑中的磷鉬酸及磷鎢酸還原成藍色化合物（即鉬藍和鎢藍的混合物）。這一反應常用來定量測定蛋白質(zhì)含量?？筛鶕?jù)反應產(chǎn)物的顏色深淺在540nm處進行蛋白質(zhì)的定量測定.

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(五)蛋白質(zhì)的顏色反應第12頁,共34頁，星期六，2024年，5月3.茚三酮反應由于蛋白質(zhì)多肽鏈兩端有游離的

-NH2和

-COOH，所以蛋白質(zhì)也可以和茚三酮發(fā)生反應。4.考馬斯亮蘭與蛋白質(zhì)反應形成藍色透明物質(zhì)，在595nm下進行比色。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(五)蛋白質(zhì)的顏色反應第13頁,共34頁，星期六，2024年，5月(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定1.蛋白質(zhì)分離、純化的過程和一般原則（1）前處理（Pretreatment）細胞破碎，蛋白質(zhì)從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來。（2）粗分級（Roughfractionation）當?shù)鞍踪|(zhì)混合物的提取液獲得后，選用一套適當分離純化方法，使目的蛋白與大量的雜蛋白分離開。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第14頁,共34頁，星期六，2024年，5月1.蛋白質(zhì)分離、純化的過程和一般原則（3）細分級（Finefractionation）是將樣品進一步提純的過程。樣品經(jīng)粗分級以后，一般體積較小，雜蛋白已經(jīng)大部分被除去。（4）結晶（Crystal）由于結晶中從未發(fā)現(xiàn)過變性蛋白質(zhì)，因此蛋白質(zhì)的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定制品處于天然狀態(tài)的有力指標。蛋白質(zhì)純度愈高，溶液愈濃就愈容易結晶。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第15頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法透析和超濾透析（dialysis）和超濾（ultrafiltration）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第16頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（1）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同的分離方法b.密度梯度（區(qū)帶）離心c.凝膠過濾（gelfiltration）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第17頁,共34頁，星期六，2024年，5月四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)葡聚糖凝膠過濾第18頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（2）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進行分離的方法

等電點沉淀（isoelectricprecipitation）蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析有機溶劑分級分離四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第19頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法電泳--在電場中，帶電顆粒向著與其帶相反電荷的電極移動，這種現(xiàn)象稱電泳（electrophoresis）。四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第20頁,共34頁，星期六，2024年，5月影響遷移率的因素：電位梯度電流密度導電性環(huán)境pH（分子電荷）離子強度分子的大小、形狀根據(jù)電泳的原理和影響因素可以設計不同的電泳方法以達到預期的目的四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第21頁,共34頁，星期六，2024年，5月按分離的原理分：區(qū)帶電泳移界電泳等速電泳等電聚焦按有無支持物分：自由電泳支持物電泳四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第22頁,共34頁，星期六，2024年，5月第一代固體介質(zhì)：紙，醋酸纖維素薄膜，硅膠等第二代固體介質(zhì)：淀粉，聚丙烯酰胺（多用于蛋白質(zhì)），瓊脂糖（多用于核酸分離）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第23頁,共34頁，星期六，2024年，5月聚丙烯酰胺的結構和特點單體：丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺增速劑：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）、3-二甲胺丙腈引發(fā)劑：過硫酸銨、過硫酸鉀、核黃素特性：機械性能、彈性、透明度、粘著度、孔徑大小第24頁,共34頁，星期六，2024年，5月電泳原理：1.最主要的特性是蛋白質(zhì)的帶電行為，產(chǎn)生電荷效應2.分子篩效應3.分子形狀四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)第25頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第26頁,共34頁，星期六，2024年，5月（3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法b.離子交換層析（ion-exchangechromatography）

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第27頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分離純化的一般方法

（3）根據(jù)蛋白質(zhì)電荷不同的分離方法親和層析法（affinitychromatography）四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第28頁,共34頁，星期六，2024年，5月3.蛋白質(zhì)分子量的測定方法凝膠過濾測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量凝膠過濾層析法（gelfiltrationchromatography）或稱為分子排阻層析（sizeexclusion）或分子篩層析（molecularsievechromatography）能夠測定完整的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第29頁,共34頁，星期六，2024年，5月3.蛋白質(zhì)分子量的測定方法(2)SDS（十二烷基硫酸鈉）測定蛋白質(zhì)分子量四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第30頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分子量的測定方法(3)毛細管電泳測定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量毛細管電泳（CE）則可以在很大程度上克服常規(guī)方法時間長、靈敏芽低不利情況。用毛細管電泳測定蛋白質(zhì)分子量僅需要納克量蛋白質(zhì)，而且還可以用積分儀或電腦聯(lián)機精確定量。

四.蛋白質(zhì)的重要性質(zhì)(六)蛋白質(zhì)的的分離、純化與鑒定第31頁,共34頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質(zhì)分子量的測定方法(4)質(zhì)譜測定蛋白質(zhì)分子量