植物生理學(xué)-實驗3-NR活性測定

實驗二問題分析氣孔密度（單位）：固定法比印跡法多氣孔大?。ㄩ_度）：Na+可以代替K+，但效果較差取樣時間、位置及照光時間實驗三硝酸鹽和光誘導(dǎo)對硝酸還原酶活性的影響

硝酸鹽還原硝酸鹽的還原由硝酸還原酶(nitratereductase)催化。硝酸還原酶存在于細胞液中，為一種誘導(dǎo)酶。誘導(dǎo)酶(inducedenzyme)

植物體本來不含有，但在特定的外來物質(zhì)(如底物)的影響下誘導(dǎo)形成的酶NR基因表達的調(diào)控實驗證明NO3-能誘導(dǎo)NR的表達NO3－的還原在根或葉中均可進行NO3－供應(yīng)少時，主要在根中還原NO3－供應(yīng)量大而根中還原力不足時，NO3－運到葉片進行還原亞硝酸鹽還原為氨亞硝酸還原或在根中的前質(zhì)體，或在葉中的葉綠體中進行。還原所需的電子來自還原態(tài)的鐵氧還蛋白。NO3-還原為NO2-后，NO2-被迅速運進質(zhì)體即根中的前質(zhì)體或葉中的葉綠體，并進一步被亞硝酸還原酶（NiR）還原為NH3或NH4+。葉綠體葉綠體中，還原反應(yīng)所需的一對電子由還原態(tài)鐵氧還蛋白提供一實驗?zāi)康睦斫庀跛徇€原酶的特性；

掌握硝酸還原酶活性測定方法。

實驗原理NR是誘導(dǎo)酶，在取樣前一天用50mMKNO3-

或NaNO3-加到培養(yǎng)苗的水中以誘導(dǎo)硝酸還原酶的產(chǎn)生。NO2-產(chǎn)生

NO3-

+NADH++

H+→NO2-

+NAD++H2O

外界溶液中的NO3-滲入植物組織后，經(jīng)硝酸還原酶作用，所產(chǎn)生的NO2-可以從組織內(nèi)滲透到外界溶液中；測定反應(yīng)溶液中NO2-含量的增加，即表現(xiàn)該酶活性的大小。在一定條件下，NO2-的生成量與硝酸還原酶活性呈正相關(guān)。NO2-含量的測定用磺胺比色法。在酸性溶液中磺胺與NO2-形成重氮鹽，再與α-萘胺偶聯(lián)形成紅色的偶氮化合物，可用分光光度計在540nm下比色測定。NH2NO2-含量測定NO2-含量測定當(dāng)磺胺與α-萘胺均過量時，所生成的紅色深淺與NO2-含量成直線關(guān)系。NO2-含量標(biāo)準(zhǔn)曲線：[NO2-]

（μMol/ml）=0.0026＋0.359OD540

硝酸還原酶活性測定NR酶活性（NO2-μMol/h?gfw）=[NO2-]×10ml/1ml÷（鮮重g×0.5h）三材料與方法兩種處理的小麥材料[水（W），KNO3（N）]A液磷酸緩沖液：水：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1B液磷酸緩沖液：KNO3：DNP溶液：蔗糖溶液＝5：5：1：1磺胺試劑α-萘胺試劑四實驗步驟兩種材料[水（W），KNO3（N）]各取2份新鮮葉片中段，用蒸餾水洗凈、擦干，剪成0.5cm小段，各稱取0.3克兩份；將兩份（W、N）葉段分別置于含有10mlA、B溶液的兩只試管中，即WA、WB，NA、NB四管(每個試管塞藍色紗網(wǎng))；將試管放在真空干燥器中抽氣0.5h，放氣后搖晃直至葉段沉于溶液中；將試管置于25-30℃溫箱中黑暗保溫0.5h；取四支試管，標(biāo)號為WA′、WB′，NA′、NB′，分別吸取1ml對應(yīng)反應(yīng)液，各加入2ml磺胺試劑和2mlα-萘胺試劑（注意順序），混合搖勻，25℃水浴5min，取出室溫靜置25min。再取兩支試管分別取A液或B液1ml代替反應(yīng)液，各加入2ml磺胺試劑和2mlα-萘胺試劑。設(shè)空白對照管在540nm測定吸光值。表硝酸還原酶的活性處理A液B液吸光度吸光度ODB-ODANR活性

H2OKNO3結(jié)果記錄、計算[NO2-]（μmol/ml）=0.0026＋0.359OD540酶活性（NO2-

μmol/h?gfw）=[NO2-]×10ml/1ml÷（鮮重g×?xí)r間h）六思考題為何提前一天施KNO3，并且取樣應(yīng)在晴天進