生物分析技術(shù)期末考試

色譜聯(lián)用

第一，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

質(zhì)譜法的特點(diǎn)：

1.被分析的樣品首先要離子化。

2.通過測定樣品離子質(zhì)荷比（m/z）來進(jìn)行定性定量分析。

3.質(zhì)譜是分子離子及碎片離子的質(zhì)量與其相對(duì)強(qiáng)度的譜，譜圖與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)；

4.質(zhì)譜法可提供分子量，確定分子式。

5.質(zhì)譜法進(jìn)樣量少，靈敏度高，分析速度快；

—.質(zhì)譜儀的結(jié)構(gòu)：

質(zhì)譜儀是通過對(duì)樣品電離后產(chǎn)生的具有不同的m/z的離子來進(jìn)行分離分析的。

質(zhì)譜儀包括：

1.進(jìn)樣系統(tǒng)：進(jìn)樣系統(tǒng)的作用是高效重復(fù)地將樣品引入到離子源中并且不能引起真空度的

降低。進(jìn)樣方式：1）直接進(jìn)樣;2）儀器聯(lián)用的進(jìn)樣（GC、LC、CE）

2.電離系統(tǒng)：離子源的作用是使樣品分子變成離子，將離子聚焦，并加速進(jìn)入質(zhì)量分析器。

質(zhì)譜檢測的是離子；離子源即為接口。

離子化方式:

1）電子轟擊電離ElectronImpactIonizationEI（應(yīng)用最廣泛）

a）原理：由GC或直接進(jìn)樣桿進(jìn)入的樣品，以氣體形式進(jìn)入離子源，由燈絲發(fā)出的電子與樣

品分子發(fā)生碰撞使樣品分子電離。

b）特點(diǎn)：

?所有的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖都是在70eV下做出的。而一般有機(jī)化合物的電離電位是10eV。

?有機(jī)物分子可能被打掉一個(gè)電子形成分子離子，確定化合物分子量；也可能會(huì)發(fā)生化學(xué)鍵

的斷裂形成碎片離子，得到化合物的結(jié)構(gòu)信息。

2）化學(xué)離子化ChemicalIonizationCI

a）有些化合物穩(wěn)定性差，用EI方式不易得到分子離子，這時(shí)采用CI電離方式。CI源工作

過程中要引進(jìn)一種反應(yīng)氣體。氣體經(jīng)過電子轟擊，產(chǎn)生離子，再與試樣相互碰撞，產(chǎn)生準(zhǔn)分

子離子。

b）特點(diǎn):

?最強(qiáng)峰為準(zhǔn)分子離子；

?譜圖簡單；

?不適用難揮發(fā)試樣。

3）電噴霧電離ElectrosprayIonizationESI

ESI是一種軟電離方式，即便是分子量大，穩(wěn)定性差的化合物，也不會(huì)在電離過程中發(fā)生

分解，它適合于分析極性強(qiáng)的有機(jī)化合物。ESI最大特點(diǎn)是容易形成多電荷離子?？梢詼y量

大分子量的蛋白質(zhì)。

4）場電離,場解吸FieldIonization,FieldDesorptionFI、FD

a）特點(diǎn)：

?強(qiáng)電場將分子中拉出一個(gè)電子；

,分子離子峰強(qiáng)；

?碎片離子峰少；

?不適合化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

b）局限性：要求樣品分子處于氣態(tài)，靈敏度不高，應(yīng)用逐漸減少。

5）快原子轟擊FastAtomBombardmentFAB（主要用于磁式雙聚焦質(zhì)譜儀）

a）氧氣在電離室依靠放電產(chǎn)生量離子，高能氮離子經(jīng)電荷交換得到高能量原子流，氨原

子打在樣品上產(chǎn)生樣品離子。電離過程中不必加熱氣化，因此適合于分析大分子量、難氣化、

熱穩(wěn)定性差的樣品。

b）缺點(diǎn)：混合物樣品中共存物質(zhì)的干擾，它們常常會(huì)抑制分析物的離子化，造成靈敏度

下降甚至根本沒有信號(hào)產(chǎn)生。

6）基質(zhì)輔助激光解析電離Matrix-AssistedLaserDesorptionIonizationMALDI（適用

于生物大分子）

MALDI可使熱敏感或不揮發(fā)的化合物由固相直接得到離子。待測物質(zhì)的溶液與基質(zhì)的溶液

混合后蒸發(fā)，使分析物與基質(zhì)成為晶體或半晶體，用一定波長的脈沖式激光進(jìn)行照射時(shí)，基

質(zhì)分子能有效的吸收激光的能量，使基質(zhì)分子和樣品分子進(jìn)入氣相并得到電離。

7）大氣壓化學(xué)電離AtmosphericPressureChemicalIonizationAPCI

①APCI噴嘴的下游放置一個(gè)針狀放電電極，通過放電電極的高壓放電，使空氣中某些中性

分子電離，產(chǎn)生H30+,N2+,02+和0+等離子，溶劑分子也會(huì)被電離，這些離子與分

析物分子進(jìn)行離子-分子反應(yīng)，使分析物分子離子化。

②APCI主要用來分析中等極性的化合物。

③APCI主要產(chǎn)生的是單電荷離子，很少有碎片離子，主要是準(zhǔn)分子離子?？梢哉J(rèn)為APCI

是ESI的補(bǔ)充。

3.質(zhì)量分析系統(tǒng)：

質(zhì)量分析器是質(zhì)譜儀的核心，質(zhì)量分析器的作用是將離子源產(chǎn)生的離子按m/z順序分開并

排列。

不同類型的質(zhì)量分析器構(gòu)成不同類型的質(zhì)譜儀：

1）單聚焦磁場分析器

離子進(jìn)入分析器后，由于磁場的作用，其運(yùn)動(dòng)軌道發(fā)生偏轉(zhuǎn)改作圓周運(yùn)動(dòng)。在一定的B、V

下，不同m/z的離子其R不同，由離子源產(chǎn)生的離子，經(jīng)過分析器后可實(shí)現(xiàn)質(zhì)量分離。

2）四級(jí)桿質(zhì)量分析器

只有質(zhì)荷比滿足要求的離子才能通過四級(jí)桿到達(dá)檢測器。其它離子則撞到四級(jí)電極卜.而被

“過濾”掉。四極桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡單，價(jià)廉，體積小，易操作，掃描速度快，適合于GC-MS,LC-MS,

但分辨率不高。

3）離子阱質(zhì)量分析器

特定m/z離子在阱內(nèi)一定軌道上穩(wěn)定旋轉(zhuǎn)，改變端電極電壓，不同m/z離子飛出阱到達(dá)檢

測器；

4）飛行時(shí)間質(zhì)譜儀

?m/z小的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度快，最先通過漂移管；

?m/z大的離子，漂移運(yùn)動(dòng)的速度慢，最后通過漂移管。

?適合于生物大分子，靈敏度高，掃描速度快，結(jié)構(gòu)簡單，分辨率隨m/z的增大而降低。

5）傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜儀

FT-MS的核心為分析室，分析室由三對(duì)平行的極板構(gòu)成。磁力線沿z軸方向，離子的回旋

運(yùn)動(dòng)垂直于z軸，在與x軸方向垂直的兩極板匕施加激發(fā)射頻，在與y軸方向垂直的兩極板h

檢測信號(hào)。

4.檢測系統(tǒng)：質(zhì)量分析器分離并加以聚焦的離子束，按m/z的大小依次通過狹縫，到達(dá)收集

器，經(jīng)接收放大后被記錄。質(zhì)譜儀的檢測主要使用電子倍增器，也有的使用光電倍增管。倍

增器出來的電信號(hào)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后可得到色譜圖，質(zhì)譜圖等信息。

三.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

1.GC-MS接口技術(shù)

接口的作用:1）.除去載氣；2）.將待測物毫無損失地從GC轉(zhuǎn)移至MS。

評(píng)價(jià)參數(shù):1）.傳輸產(chǎn)率Y；2）.濃縮系數(shù)N;3）.延時(shí)t:4.峰展寬系數(shù)H

目前常用的GC-MS接口：

1）直接導(dǎo)入型（最常用）：將毛管直接插入質(zhì)譜儀的金屬毛細(xì)管內(nèi)。

毛細(xì)管色譜柱流出的載氣和待測物進(jìn)入離子源作用場。由于惰性氣體He不發(fā)生電離，只有

待測物分子形成帶電粒子，在加速電場作用下進(jìn)入質(zhì)量分析器。特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡單，易維護(hù)，

應(yīng)用廣泛。

2）開口分流型；

特點(diǎn)：

?色譜柱出口常壓、接口簡單

?在色譜流量較大時(shí)，傳輸能力較低，不適用于填充柱條件

3）噴射式分離器

特點(diǎn)：

?分離除去絕大部分載氣，使試樣組分濃集，同時(shí)達(dá)到低真空度。

?適用于填充柱或毛細(xì)管柱與較小功率的抽真空質(zhì)譜儀聯(lián)接。

2.GC-MS總離子色譜圖

?總離子色譜圖的橫坐標(biāo)是出峰時(shí)間，縱坐標(biāo)是峰高。

?圖中每個(gè)峰表示樣品的一個(gè)組份，由每個(gè)峰可以得到相應(yīng)化合物的質(zhì)譜圖。

?峰面積和該組份含量成正比,可用于定量。

3.GC-MS選擇離子質(zhì)譜圖

?SIM主要用于定量分析。

?只有特定質(zhì)量數(shù)的離子被檢測。

?根據(jù)目標(biāo)化合物選擇合適的檢測離子相當(dāng)重要。

?靈敏度取決于所選擇的檢測離子。

四.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀

LLC-MS中存在的問題:

LC流動(dòng)相對(duì)MS工作條件的影響

?1ml溶劑氣化生成500?1300ml的蒸氣。而質(zhì)譜儀只能接受10ml/min。

?氣體流量有時(shí)流動(dòng)相中含難以揮發(fā)的緩沖鹽。2.質(zhì)譜離子源溫度、電離方式不適宜液相色

譜所分析的樣品。

2.LC-MS的接口

接口作用：除去流定相，只讓組分分子進(jìn)入離子源。

直接液體導(dǎo)入接U（DLI）

移動(dòng)帶技術(shù)（MB）

熱噴霧接口（TS）

粒子束接口（PB）

快原子轟擊（FAB）

基質(zhì)輔助激光解吸（MALDI）

電噴霧電離（ESI）

大氣壓電離（API）

大氣壓化學(xué)電離（APCI）

3.識(shí)別分子離子峰

?必須是譜圖中最高質(zhì)量的離子。

?必須是奇電子離子。

?必須能夠通過合理的離子碎裂機(jī)理產(chǎn)生譜圖中的一些重要離子。

?氮規(guī)則：-個(gè)化合物含有偶數(shù)個(gè)氮原子，其分子離子的質(zhì)量數(shù)一定是偶數(shù)；一個(gè)化合物含

有奇數(shù)個(gè)氮原子，其分子離子的質(zhì)量一定是奇數(shù)。

五.毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用

1.CE-MS的接口

接口技術(shù)是實(shí)現(xiàn)CE-MS聯(lián)用的關(guān)鍵所在。近幾年來，關(guān)于CE-MS方法學(xué)的研究主要是關(guān)于新接

口技術(shù)。目前主要分為：

?CE-ESI-MS接口技術(shù):1）鞘液接口；2）無鞘液接口

?鞘液體接口技術(shù):金屬接口（噴霧桿）具有三層套管結(jié)構(gòu)：內(nèi)層中插入多孔毛細(xì)管，中間

層采用了液體鞘流技術(shù)，鞘液從中間層流出，與毛細(xì)管中流出的液體混合，解決了毛細(xì)管

末端電接觸的問題，同時(shí)可以控制鞘液體流速以增大進(jìn)入ESI的液體量，補(bǔ)給足夠的液體基

質(zhì)，形成穩(wěn)定的電噴霧。

鞘液接口技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于通過提高樣品流速使得噴霧更加穩(wěn)定,有利于形成穩(wěn)定的電流

回路，同時(shí)可改變CE運(yùn)行緩沖液的組成，使其滿足ESI源的檢測要求。然而鞘液的引入會(huì)稀釋

樣品，使檢測靈敏度下降。為此，有人設(shè)計(jì)了低流速鞘液接口，以降低鞘液的稀釋作用，同

時(shí)伯絲構(gòu)成電流回路可以避免因流速低所造成的斷流。

2.CE-ICP-MS接口技術(shù)

ICP-MS是一種先進(jìn)的痕量多元素分析技術(shù)。CETCP-MS具有分離分析速度快、靈敏度高、分

辨率高、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，在金屬及金屬化合物的分離分析中扮演著重要的角色。

目前主要有3種CE-ICP-MS接口技術(shù)：

?無鞘液接口技術(shù)

?鞘液接口技術(shù)

?氫化物發(fā)生接口技術(shù)

優(yōu)點(diǎn)：

CE-MS在線聯(lián)用具有樣品損失少、自動(dòng)化程度高、分析速度快等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用要比離線

聯(lián)用廣泛。

缺點(diǎn)：

a.離子源受限，僅電噴霧等幾種方法可選。

b.常不允許CE采用其最佳緩沖條件，限制其優(yōu)勢(shì)的發(fā)揮。

c.CE出峰很快，沒有時(shí)間進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜測定。

CE-MS的局限性

CE/MS的應(yīng)用報(bào)道雖然很多，但作為常規(guī)方法尚存在以下缺點(diǎn)：

?靈敏度低，不如LC71S；?毛細(xì)管壁涂層材料中的表面活性劑等會(huì)降低被分析物的離子化效

率甚至嚴(yán)重污染MS離子源；不是所有的CE分離模式都可方便地用于與MS相聯(lián)用；MS對(duì)CE分離

緩沖液的限制較多。

第二.色譜-福利葉變換紅外光譜聯(lián)用(FTIR)

GC-FTIR

1.紅外光譜原理：

紅外光譜根據(jù)不同的波數(shù)范圍分為三個(gè)區(qū)：

近紅外區(qū)13,330^4000cm-1(0.75~2.5um)

中紅外區(qū)4000~650cm-1(2.5~15.4um)

遠(yuǎn)紅外區(qū)650~10cm-1(15~1000um)

分子沿重心軸轉(zhuǎn)動(dòng)的能量為轉(zhuǎn)動(dòng)能：二個(gè)以上原子連接在一起，它們之間的鍵如同彈簧

一樣振動(dòng)，所需能量為振動(dòng)能。當(dāng)分子受到紅外光的輻射，如果分子中某個(gè)基團(tuán)的振動(dòng)頻

率和它一樣，二者就會(huì)產(chǎn)生共振，此時(shí)光的能量通過分子偶極距的變化而傳遞給分子，這個(gè)

基團(tuán)就吸收一定頻率的紅外光，產(chǎn)生振動(dòng)躍遷，形成紅外吸收光譜。

2.GC-FTIR概述

質(zhì)譜一般難于區(qū)分同分異構(gòu)體，單憑MS確定有機(jī)物結(jié)構(gòu)有時(shí)很困難，甚至不可能。實(shí)現(xiàn)

GCTR的困難除了工作氣壓匹配之外，其余工作條件的差異很大。尤其是散射型紅外光譜儀,

掃描速度和靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于色譜。FTIR的出現(xiàn)大大促進(jìn)了GC-IR的發(fā)展。FTIR具有光通量大、

信噪比好、掃描速度快等優(yōu)點(diǎn)，與GC的匹配性大大提高。

3.GC-FTIR系統(tǒng)接口裝置：

光管：GC/FTIS的關(guān)鍵部件。

?用硼硅玻璃制成；

?兩端裝有KBr鹽窗，紅外干涉光可以通過；

?內(nèi)壁鍍金，有高的反射率，紅外干涉光在其中多次反射，增加光程以提高靈敏度；

?可加熱，保證GC流出物不在此冷凝、聚集；

?適當(dāng)?shù)娜莘e，以獲得最佳分辨率和靈敏度。

細(xì)內(nèi)徑短光管有助提高分辨率

長光管有助提高靈敏度

4.GC-FTIR提供的信息：

(1)三維實(shí)時(shí)顯示紅外光譜圖

(2)化學(xué)圖(官能團(tuán)色譜圖)

?指定官能團(tuán)頻率范圍對(duì)時(shí)間所作的圖；

?是一個(gè)“色譜圖”，每個(gè)峰代表一個(gè)組分：

?包含的信息比一般的色譜圖多，體現(xiàn)了化合物類型或所含的官能團(tuán)；

?與GC-MS中的質(zhì)量色譜圖作用相似。

(3)紅外重建色譜圖

GC-FTIR采集的數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后得到的紅外吸收信號(hào)對(duì)時(shí)間所作的圖。

①積分吸收重建圖(紅外總吸光度重建圖TIA),相當(dāng)于GC-MS中的總離子流圖(TIC)。不能實(shí)

時(shí)檢查。

②Gram-Schmidt重建色譜圖扣除了載氣背景的積分重建圖。

二.LC-FTIR

1.LC/FTIR接口——流通池接口

工作原理：

首先經(jīng)液相色譜分離的微分隨流動(dòng)相順序進(jìn)入流通池，同時(shí)FTIR同步跟蹤，依次對(duì)流通池進(jìn)

行紅外檢測，然后對(duì)獲得的流動(dòng)相與分析物的疊加譜圖作差譜處理，以扣除流動(dòng)相的干擾，

獲得分析物的紅外光譜圖，進(jìn)而通過紅外數(shù)據(jù)庫進(jìn)行計(jì)算機(jī)檢索，對(duì)分析物進(jìn)行快速鑒定。

特點(diǎn)：

裝置簡單、操作方便。

局限性：

a)流動(dòng)相的干擾難以徹底消除：b)不適合梯度淋洗技術(shù)；c)被測物在池內(nèi)受檢時(shí)間受色譜峰

出峰時(shí)間限制而無法采用信號(hào)平均技術(shù)提高紅外譜圖的信噪比等。因此，流動(dòng)池法的應(yīng)用受

到了限制，最理想的辦法是在測定光譜前去除流動(dòng)相。

2.LC/FTIR接口——流動(dòng)相去除接口

流動(dòng)相去除接口是在測定紅外光譜之前將通過物理或化學(xué)方法將流動(dòng)相除去以排除溶

劑的干擾。目前一報(bào)道的該類接口有許多種，最具有實(shí)際意義的有霧化接口、漫反射轉(zhuǎn)盤接

口等。

正相色譜：

(1)漫反射轉(zhuǎn)盤接口

工作原理：

由色譜柱出來的流出物首先經(jīng)過一個(gè)加熱管，使90%的流動(dòng)相揮發(fā)除去，濃縮的樣品滴

入裝有細(xì)KBr或KC1粉末的樣杯，若干個(gè)樣杯裝在一個(gè)轉(zhuǎn)盤上，由微機(jī)控制其轉(zhuǎn)動(dòng)。特點(diǎn):靈

敏度高，但只適用于分析沸點(diǎn)高且有UV吸收的物質(zhì)。因水難去除，僅適用于正相色譜。

(2)連續(xù)霧化接口

工作原理：

色譜流出物流入霧化器被直接噴霧在裝有金屬軸的NaCl晶體窗片上，然后溶劑立即被蒸發(fā)除

去，而溶質(zhì)則以微粒結(jié)晶析出。然后以FTIR檢測窗片上的流出物。特點(diǎn)：常溫下分離溶劑，

適用于不易揮發(fā)而易熱分解的有機(jī)化合物。

反相色譜：

(1)連續(xù)萃取式漫反射轉(zhuǎn)盤接口

工作原理：

首先將含水流動(dòng)相與萃取劑二氯甲烷混合，經(jīng)萃取管后，流出物分為水相和有機(jī)相，密度小

的水相被吸氣瓶吸去，有機(jī)相部分被導(dǎo)入樣品濃縮器，進(jìn)而滴入漫反射轉(zhuǎn)盤上的樣品杯。特

點(diǎn)：常溫下分離溶劑，適用于不易揮發(fā)而易熱分解的有機(jī)化合物。

(2)熱霧化接口

工作原理：

由HPLC出來的流出物被加熱霧化在光管內(nèi)壁上，用多次反射光譜法測定光管壁上附著的溶質(zhì)。

此裝置有四個(gè)一樣的光管，依此收集、測量、清洗和干燥。如此反復(fù)。特點(diǎn)：能有效除去溶

劑，但靈敏度不高。

3.LC/FTIR兩種接口比較

流動(dòng)相去除法的缺點(diǎn)：

與流動(dòng)池法相比，流動(dòng)相去除法的接口裝置復(fù)雜，且操作需一定經(jīng)驗(yàn)。

流動(dòng)相去除法的優(yōu)點(diǎn)：

1.無流動(dòng)相干擾，可使用多種流動(dòng)相；

2,適用于梯度淋洗，提高了樣品的分離檢測能力；

3.當(dāng)進(jìn)行離線紅外檢測時(shí)，可使用信號(hào)平均技術(shù)，增加譜圖的信噪比，檢出限一般較流動(dòng)

池接口低。

第三.色譜-原子光譜聯(lián)用

一.GC與原子光譜聯(lián)用技術(shù)

1為什么將GC和原子光譜聯(lián)用？

①金屬元素存在不同的形態(tài)和價(jià)態(tài)，其毒性相差較大。

②利用色譜將不同價(jià)態(tài)和形態(tài)的微量元素進(jìn)行分離，然后再用原子光譜進(jìn)行測定。

2聯(lián)用“接口”的作用

色譜與原子光譜的“接口”就是要在不降低色譜分離性能的前提卜將色譜分離后的組分盡

可能多的送入到原子光譜的原子化器中使之原子化，同時(shí)不降低原子化器的原子化效率。

基態(tài)：在無外來作用時(shí)，原子中各電子都盡可能處于最低能級(jí)，從而使整個(gè)原子的能量最

低，原子的這種狀態(tài)稱為基態(tài)。

激發(fā)態(tài)：當(dāng)原子受到外來作用時(shí)，它的一個(gè)或幾個(gè)電子吸收能量后躍遷到較高能級(jí)，從而

使原子處于能量較高的新狀態(tài)，此狀態(tài)稱作激發(fā)態(tài)。

激發(fā)：原子由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)的過程叫做激發(fā)。

退激：激發(fā)態(tài)是種壽命極短的不穩(wěn)定狀態(tài)，原子隨即躍遷回基態(tài)，這一過程叫做退激。

原子發(fā)射光譜：原子從某?激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)，發(fā)射出具有一定波長的一條光線，而從其

它可能的激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)以及某些激發(fā)態(tài)之間的躍遷都可發(fā)射出波長不同的光線，這些光

線形成一個(gè)系列（譜），稱為原子發(fā)射光譜，簡稱原子光譜。

原子吸收光譜：將一束白光通過某一,物質(zhì)，若該物質(zhì)中的原子吸收其中某些波長的光而發(fā)

生躍遷，則白光通過物質(zhì)后將出現(xiàn)一系列暗線，如此產(chǎn)生的光譜稱為原子吸收光譜。

等離子體（Plasma）在近代物理學(xué)中，是指一種在一定程度上被電離的氣體，其中電子和陽

離子的濃度處于平衡狀態(tài)，宏觀上呈電中性的物質(zhì)。

電感耦合等離子體ICP：是由高頻電流經(jīng)感應(yīng)線圈產(chǎn)生高頻電磁場，使工作氣體形成等離子

體，并呈現(xiàn)等離子體焰炬，達(dá)到10000K的高溫，是一個(gè)具有良好的蒸發(fā)-原子化-激發(fā)-電離

性能的光譜光源.

LC與原子光譜聯(lián)用技術(shù)

LC-FAAS液相-火焰原子吸收光譜最簡單的聯(lián)接方法是用一根低擴(kuò)散蛇形管作為接口

三.色譜-核磁共振波譜聯(lián)用

1.色譜-核磁共振波譜聯(lián)用普及的原因

①核磁共振的方法與技術(shù)作為分析物質(zhì)的手段，由于其可深入物質(zhì)內(nèi)部而不破壞樣品，并

具有迅速、準(zhǔn)確、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)而得以迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，已經(jīng)從物理學(xué)滲透到化學(xué)、

生物、地質(zhì)、醫(yī)療以及材料等學(xué)科，在科研和生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大作用o

②高效液相色譜是分析復(fù)雜有機(jī)物、藥物和生物大分子等混合物的一種重要手段，但紫外、

熒光、電化學(xué)等檢測器只能得到非常有限的分子結(jié)構(gòu)信息。③NMR能夠提供大量的分子結(jié)構(gòu)

信息，但NMR分析方法要求樣品為純品，對(duì)于復(fù)雜的混合物，因?yàn)镹MR信號(hào)的互相覆蓋，單純

靠NMR譜則顯得無能為力。

④在核磁儀器前加上一級(jí)色譜分離設(shè)備把直接樣品分離后再送人NMR中掃描，就可以大大簡

化分析程序，提高樣品分析速度，這就是色譜分離技術(shù)與NMR波譜儀結(jié)合并且日趨普及的原

因。

2.HPLC-NMR聯(lián)用裝置

典型的HPLC-NMR聯(lián)用裝置是由泵、注入閥、色譜柱和紫外檢測器組成LC系統(tǒng)，通過一條2?

2.5m長的特制毛細(xì)管連接到NMR液相探頭上。可以將NMR視為HPLC的特殊檢測器，其化學(xué)

位移、積分強(qiáng)度和譜線分裂情況能提供豐富的定量定性信息。

3.NMR探頭是聯(lián)用裝置中最關(guān)鍵的部分。傳統(tǒng)的NMR探頭樣品管在一個(gè)與測量線圈相連的玻璃

插件內(nèi)旋轉(zhuǎn)。HPLC-NMR探頭由?個(gè)不旋轉(zhuǎn)的直接固定在射頻線圈上的玻璃管構(gòu)成，它處于傳

統(tǒng)探頭玻璃杜瓦瓶的中心，玻璃管內(nèi)徑為2,3或4mm。玻璃壁長度至少超過質(zhì)子檢測線圈（18

mm），并與之平行，同時(shí)向兩端逐漸變細(xì)。

4.運(yùn)行模式

（1）在流運(yùn)行模式

在流運(yùn)行模式是將HPLC的輸出直接連接到1HNMR的檢測池，連續(xù)檢測HPLC的洗脫液。1HNMR

成為HPLC的檢測器。

（2）直接停留模式：（停留運(yùn)行模式）

通過UV檢測器確定了色譜峰位置之后，準(zhǔn)確得知欲測組分到達(dá)1HNMR檢測池的時(shí)間。一旦欲

測組分到達(dá)檢測池，立即將HPLC泵停止，使色譜峰準(zhǔn)確地停留在NMR檢測池中進(jìn)行檢測。主

要缺點(diǎn)是：由于色譜流動(dòng)相階段性停止，大大增加了分離時(shí)間，從而可能會(huì)使色譜峰展寬，

分辨率下降。

（3）環(huán)存儲(chǔ)運(yùn)行模式：（停留運(yùn)行模式）

在色譜分離的過程中，將各個(gè)色譜峰的一部分轉(zhuǎn)移到不同毛細(xì)管中.然后再分別進(jìn)入NMR檢

測池進(jìn)行掃描分析。在整個(gè)過程中，色譜峰并沒有任何停頓，所以就解決了直接停留模式所

帶來的色譜峰展寬問題。

生物色譜技術(shù)

1生物色譜法（Biochromatograph鼻是20世紀(jì)80年代中后期問世，由生命科學(xué)與色譜分

離技術(shù)交叉形成的一種極具發(fā)展?jié)摿Φ男屡d色譜技術(shù)。

適用條件：親和色譜一固定相和研究對(duì)象都是生物大分子

細(xì)胞膜色譜一固定相含有生物大分子

常規(guī)色譜一研究對(duì)象是生物大分子

2細(xì)胞膜色譜CellMembraneChromatography,CMC將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜

固定相，利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法

特點(diǎn)：分離+活性篩選合二為一

化學(xué)成分——效應(yīng)——作用機(jī)理

適合于天然藥物活性成分的篩選及藥物作用機(jī)理的研究。

3親和色譜AffinityChromatography,AC利用生物大分子具有對(duì)某一類生物大分子特異性

識(shí)別和司逆結(jié)介的特性而建立起來的一種分離方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。

親和體系:

特異性親和體系

高特異性抗原一抗體

荷爾蒙一受體蛋白

核酸一互補(bǔ)堿基鏈段、核酸結(jié)合蛋白

酶一底物、產(chǎn)物、抑制劑

群特異性免疫球蛋白一A蛋白、G蛋白

酶一輔酶

凝集素一糖、糖蛋白、細(xì)胞、細(xì)胞表面受體

酶、蛋白質(zhì)一肝素

酶、蛋白質(zhì)一活性色素（染料）

酶、蛋白質(zhì)一過渡金屬離子（銅、鋅等）

酶、蛋白質(zhì)一氨基酸（組氨酸等）

常見的親和色譜

名稱作用原理應(yīng)用

免疫AF抗體和抗原專一性識(shí)別抗體或抗原

固定化金屬AFCu2+、Zn2+、Ni2+等與蛋白含組氨酸的蛋白質(zhì)

質(zhì)表

面組氨酸的特異性識(shí)別

染料AF染料和蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別激酶、脫氫醐

核甘酸AF核甘酸和蛋白質(zhì)的特異性識(shí)激酶、脫氧酶

別

凝聚素AF凝聚素和糖之間專一性的可糖蛋白

逆的結(jié)合

蛋白質(zhì)AAF對(duì)IgG類似抗體的專一性免疫蛋白等

親和色譜分離原理

1.找與底物專一可逆結(jié)合的配體，將配體通過共價(jià)鍵偶聯(lián)到載體。

2.配體與目標(biāo)物吸附；

3.洗脫目標(biāo)物

4.港和柱再平衡。

親和色譜分離示意圖

樣品吸附和沖洗洗脫

未結(jié)合—未結(jié)合一結(jié)合—"重新再平衡

物質(zhì)的洗脫物質(zhì)物質(zhì)

1載體（support,又稱基體matrix

無機(jī)氧化物:Si02、A1203,Zr03

生物聚合物：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、葡聚糖等

特性：①親水但不溶于水，可溶脹②大孔且有一定的機(jī)械強(qiáng)度③化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且易于改性④

表面積很大但呈現(xiàn)惰性

2.配位體（ligand,又稱底物substrate）

專一性和特異性決定著分離純化的產(chǎn)品純度

相互作用的強(qiáng)弱決定著吸附和解吸的難易程度

生物素一親和素、抗原一抗體、酶一抑制劑、激素一受體

?M■凝集素一各種糖蛋白，核酸一RNA、RNA-蛋白質(zhì)

3.間隔臂（spacer或spacerarms）

①脂肪族有機(jī)物或多肽、蛋白組成；

②具有雙官能團(tuán)，?端連接載體，-端偶聯(lián)配體；

③長度直接影響固定相的立體效應(yīng)；

④可在對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)改性的時(shí)候形成：

⑤可具有疏水性或親水性。

影響親和色譜的因素

①離/強(qiáng)度|：提高離子強(qiáng)度，親和作用減弱或完全破壞。

②5H值：在適當(dāng)?shù)膒H下，親和結(jié)合作用較高，在其它pH下，親和作用減弱或完全破壞。

③離液劑：胭和鹽酸服的存在可減弱親和作用。

④溫國：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱：但是疏水性相互作用增強(qiáng)

⑤解離乳SCN-、1-、CI04-的存在，疏水性相互作用減弱

⑥螯合劑：影響配位鍵,使親和作用消失

3.體積排阻色譜

■:是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法，體積大的分子不能滲透到凝膠孔穴中去

而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出

色譜柱。

4.離子交換色譜

■：利用被分離組分與固定相之間發(fā)生離子交換能力的差異來實(shí)現(xiàn)分離。

分子生物學(xué)技術(shù)

名詞解釋：

1分子生物學(xué)(Molecular-Biology)：從分子水平研究生命現(xiàn)象的科學(xué)，是現(xiàn)代生命科學(xué)的

“共同語言”。通過生物的物質(zhì)基礎(chǔ)——核酸、蛋白質(zhì)、酶等生物大分子的結(jié)構(gòu)、功能及

其相互作用等運(yùn)動(dòng)規(guī)律的研究來闡明生命分子基礎(chǔ)，從而探討生命的奧秘。

2重組DNA技術(shù)(RecombinantDNATechnique)是人類根據(jù)需要選擇目的基因(DNA片段)

在體外與基因運(yùn)載體重組，轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi)，以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治

療人類疾病的目的。

3限制性內(nèi)切核酸酶(restrictiveendonucleases),又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈

中磷酸二酯鍵的核酸酶(“分子手術(shù)刀”

4載體(Vector):將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，并能自我復(fù)制和增殖的工具。

DNA克隆，亦稱分子克隆:獲得所需的基因或特異序列，需從細(xì)胞中分離得到目的基因與載

體DNA重組，并用適當(dāng)方法在宿主細(xì)胞中表達(dá)，擴(kuò)增得到大量相同的DNA片段，

5表達(dá)克隆(expressioncloning就是將目的基因與表達(dá)載體重組，導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)而表

達(dá)出相應(yīng)的基因產(chǎn)物(蛋白)。

6核酸分子雜交技術(shù)所依據(jù)的原理是，帶有互補(bǔ)的特定核昔酸序列的單鏈DNA或RNA,當(dāng)它

們混合在一起時(shí)，其相應(yīng)的同源區(qū)段將會(huì)退火形成雙鏈的結(jié)構(gòu)

7DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)(DNAmobilityshiftassay),是在80年代初期出現(xiàn)的用于在體

外研究DNA與蛋白質(zhì)作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。

8DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的部位及特性的專門的實(shí)

驗(yàn)技術(shù)。

9SouthernDNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)或稱DNA印跡雜交技術(shù)：根據(jù)毛細(xì)管作用，使在電泳凝膠中

分離的DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過同標(biāo)記的單鏈DNA或RNA探針的雜

交作用檢測這些被轉(zhuǎn)移的DNA片段。

10諾賽恩RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)：

將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學(xué)修飾的活性濾紙上，進(jìn)行核酸雜

交的一種笑驗(yàn)無笠_______________________

11韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)(Westernblotting)：將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素

濾膜上，然后同放射性高蒞素1251標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)的技術(shù)。

簡答

1限制酶，在基因工程和基因診斷中的重要用途：

?1)不論DNA的來源如何，同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因

此可將不同種屬的DNA重組。如人和質(zhì)粒DNA等。

*2）用于人類基因組的DNA分析，具特定的酶切位點(diǎn)。

*3）Gene突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長度。應(yīng)用于限制性片

段多態(tài)性分析。

2載體具以下特征：

*1）分子量小，便于攜帶較大的DNA片段，能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖；

*2）有多種限制酶切點(diǎn)，每種限制酶最好只有單一切點(diǎn)；

*3）被切割后的載體，插入外源DNA后，不影響其復(fù)制能力，并有可選擇的標(biāo)記基因

（如，抗藥基因）。

*常用的載體有：質(zhì)粒，入噬菌體，粘粒，BAC,YAC等。

3DNA重組與分子克隆化基本過程

1、分離純化目的基因

2、目的基因+vector=重組DNA分子

3、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在其內(nèi)增殖。

4、篩選含有重組DNA的細(xì)胞——細(xì)胞克?。╟ellclone）,將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于瓊脂表面，

以刺激細(xì)胞克隆生長，這些細(xì)胞是由單個(gè)細(xì)胞形成的遺傳相同的細(xì)胞群體，故稱細(xì)胞克隆。

再將每個(gè)克隆移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。

5、名離重組DNA克?。杭词斋@擴(kuò)增的培養(yǎng)細(xì)胞，并選擇分離重組DNA。

4重組DNA和分子克隆的幾種方必：

（依目的基因的來源）

1、從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆

2、由特定mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行克隆

3、化學(xué)合成目的基因進(jìn)行克隆

4、PCR體外擴(kuò)增目的片段進(jìn)行克隆

5Southern印跡可用于分析基因

拷貝數(shù)的變化基本過程：

待測DNA樣品的制備和基因探針的標(biāo)記；

待測DNA樣品的電泳分離；

電泳分離的DNA經(jīng)變性、轉(zhuǎn)移、固定到合適的固相支持物；

特異性核酸探針與膜上DNA片段雜交，放射自顯影或顯色檢測目的DNA的存在。

應(yīng)用；研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重

要價(jià)值。

6Northern印跡可用于分析基因轉(zhuǎn)錄水平的變化：Northernblot是將RNA從凝膠中轉(zhuǎn)

而到硝酸辟維素膜上，定性分析mRNA的常用方法

原位雜交（】力hybridization,ISH）即利用分子雜交技術(shù)來進(jìn)行基因及其表達(dá)產(chǎn)物

定位分析的一種技術(shù)；

應(yīng)用：可用于基因及其表達(dá)產(chǎn)物的整緲f

7DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)、DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)（footprintingassay）甲基化干擾實(shí)驗(yàn)

（methyltioninterferenceassay優(yōu)缺點(diǎn)

又叫DNA遷移率變動(dòng)實(shí)驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay）,是在80年代初期出現(xiàn)的用于在

體外研究DNA與蛋白質(zhì)作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。它具有簡單、快捷等優(yōu)點(diǎn)，也是

當(dāng)前被選作分離純化特定DNA結(jié)合蛋白質(zhì)的一種典型的實(shí)驗(yàn)方法。

DNaseI足跡實(shí)驗(yàn)(footprintingassay)是一類用于檢測與特定蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA序列的

部位及特性的專門的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。足跡實(shí)驗(yàn)的一個(gè)明顯優(yōu)點(diǎn)是，可以形象地展示出一種特殊

的蛋白質(zhì)因子同特定DNA片段之間的結(jié)合區(qū)域。如果使用較大的DNA片段，通過足跡實(shí)驗(yàn)

便可確定其中不同的核甘酸序列與不同蛋白質(zhì)因子之間的結(jié)合單位的分布狀況。如同凝膠

阻滯實(shí)驗(yàn)一樣，我們也可以加入非標(biāo)記的競爭DNA序列，來消除特定的“足跡”，并據(jù)此測

定其核甘酸序列的特異性。

甲基化干擾實(shí)驗(yàn)(methyltioninterferenceassay根據(jù)DMS(硫酸二甲酯)能夠使G殘基

甲基化，而六氫口比碇又能夠特異切割甲基化的G殘基這一原理，設(shè)計(jì)出了另一種研究DNA

與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法，即甲基化干擾實(shí)驗(yàn)。這種技術(shù)可以檢測靶DNA中特異G殘

基的優(yōu)先甲基化對(duì)之后的蛋白質(zhì)結(jié)合作用究竟會(huì)有什么效應(yīng)，從而更加詳細(xì)地揭示DNA與

蛋白質(zhì)之間相互作用的模式。

DMS化學(xué)干擾的主要局限性是，它只能使G殘基甲基化。盡管如此，它仍不愧為足跡實(shí)驗(yàn)的

一種有效的補(bǔ)充手段，—股鑒定足跡區(qū)段中DNA與蛋白質(zhì)相互作用的精確位置。

8聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

*是一種在體外帶異地?cái)U(kuò)增已知基因的方法；

*由工Mullis于1983年建立；

*可用于分析基因及其產(chǎn)物的水平變化；

*可進(jìn)行實(shí)時(shí)、定量分析：

*可結(jié)合免疫沉淀的方法確定蛋白質(zhì)與DNA序列的相互作用。

9DNA序列分析

1、通過DNA序列分析可以鑒定基因和基因組的變異

2、通過DNA序列測定分析人工重組的基因

3、通過DNA序列測定對(duì)定點(diǎn)突變進(jìn)行確認(rèn)

10什么是DNA芯片(DNAchip)

1在固相支持物上有序固化寡核昔酸或DNA探針，與待測熒光標(biāo)記樣品進(jìn)行雜交;

2通過對(duì)雜交信號(hào)的檢測、比較和分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達(dá));

3亦被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)。

11利用DNA芯片技術(shù)

1芯片每個(gè)探針是cDNA片段或基因的一段PCR產(chǎn)物，可以同任何具有同源序列的樣品形成

雜交體，同時(shí)定量監(jiān)測大量基因的表達(dá)。

2寡核甘酸芯片利用基因特異的寡核昔酸片段為探針，每個(gè)基因有10~20個(gè)相對(duì)應(yīng)的探針,

對(duì)低豐度基因表達(dá)水平變化的檢測具有高度靈敏性。

11染色質(zhì)免疫共沉淀與芯片技術(shù)結(jié)合檢測蛋白質(zhì)-DNA相互作用

*ChIP-on-chip(chromatinimmunoprecipitation-chip,ChIP-on-chip))的基本

原理：

*染色質(zhì)免疫共沉淀與芯片技術(shù)相結(jié)合

?它的基本原理是在活細(xì)胞狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA交聯(lián)，超聲波將其隨機(jī)切

斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后用所研究的目的蛋白質(zhì)特異性抗體免疫

沉淀蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合體，從而特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段。

12ChlP-on-chip應(yīng)用

目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。ChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與

DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。ChIP與基

因朝相結(jié)合建立的ChlP-on-chip方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選。

13ChlP-on-chip適于DNA-核蛋白相互作用及表觀遺傳學(xué)研究：

*主要集中在兩個(gè)領(lǐng)域：

*第一，確定轉(zhuǎn)錄因子及其作用位點(diǎn)：能夠?qū)⒅苯优c蛋白結(jié)合的基因作為靶點(diǎn)，數(shù)據(jù)

可以直接用于生物信息學(xué)分析，更直接地識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。

*第二，確定基因表觀遺傳修飾，應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)研究。

*表觀遺傳學(xué)的主要研究內(nèi)容包括甲基化，組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等。

*ChlP-on-chip技術(shù)可提供基因編碼區(qū)中組蛋白甲基化分布模式的信息：CpG

島表達(dá)序列標(biāo)簽芯片，可以顯示基因組內(nèi)CpG甲基化和組蛋白修飾之間的聯(lián)

系。

14酵母雙雜交技術(shù)

（-）酵母雙雜交系統(tǒng)利用報(bào)告基因的表達(dá)探測蛋白-蛋白的相互作用

（二）酵母雙雜交可通過蛋白質(zhì)相互作用鑒定/分離新的相互作用蛋白及其編碼基因

（三）哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)是在酵母雙雜交系統(tǒng)基礎(chǔ)上發(fā)展的

電泳技術(shù)

一.名詞解釋

1.電泳：帶電粒子在電場中向與自身帶相反電荷的電極移動(dòng)的現(xiàn)象。

2.遷移率：是指帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下泳動(dòng)的速度

3.電場強(qiáng)度：也稱電位梯度，是指單位長度（每1cm）支持物體上的電位降，它對(duì)泳動(dòng)度起

著十分重要的作用。

4.凝膠原理

5.SDS作用與變性、非變性

6.連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液的離子成分、PU、凝膠濃度、電位梯度都相同，帶電顆粒電泳時(shí)僅具

有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。

7.不連續(xù)系統(tǒng)：緩沖液離子成分、p【l、凝膠濃度、電位梯度不連續(xù)，帶電顆粒電泳時(shí)具有

濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。

8.等電點(diǎn)：在某一PH下，蛋白質(zhì)分子在電場中不再移動(dòng)，即靜電荷為零，則此PH值即為

該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

9.SDS:是一種陰離子去污劑，它在水溶液中以單體和分子團(tuán)的混合形式存在。這種陰離

子去污劑能破壞蛋白質(zhì)分子之間以及與其他物質(zhì)分子之間的非共價(jià)鍵，使蛋白質(zhì)分子內(nèi)

的二硫鍵被還原劑打開并不易再氧化，這就保證了蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合從而形成

帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。

10.CellMembraneChromatography,CMC：以含受體的細(xì)胞膜為固定相，利用溶質(zhì)分子與

相應(yīng)受體大分子間特異性分子間作用力的不同進(jìn)行分離測定的液相色譜方法。

簡答

1.電荷的來源

膠體顆粒表面的電荷來源是：

①吸附液體中的某離子，因而帶電，液體失去該離子而帶相反的電荷。

②作為膠體組成成分的相反符號(hào)的離子不等量的進(jìn)入溶液而帶電。

③固體表面吸附液體分子，然后這些分子解離，因而帶電。

2.影響電泳遷移率的因素可以分為以下三大類：

(a)與泳動(dòng)離子(或粒子)本身的特性有關(guān)的因子，如電荷符號(hào)和大小、本身的大小和形狀、

水化程度、解離趨勢(shì)、兩性性質(zhì)等。

(b)環(huán)境因素，如緩沖液濃度、離子強(qiáng)度、介電性質(zhì)、化學(xué)性質(zhì)、pH、溫度、粘度、有無極

性分子存在(因?yàn)樗梢杂绊懻扯然蚪殡娦?等。在有支持物的情況下，影響因素更多，

如支持物的吸附作用，不均一性、離子交換能力、電滲現(xiàn)象、虹吸作用、熱和蒸發(fā)作用

等。

(c)所加電場的特性，如強(qiáng)度和純度(是否雜有交流電)。這些因素在實(shí)驗(yàn)過程中要充分注意，

盡量保持條件恒定不變，以便獲得可重復(fù)的結(jié)果。

3.電泳的分類

(-)按分離的原理區(qū)分

電泳按分離的原理可分為4種，即：

a.區(qū)帶電泳(zoneEP,ZEP)：不同的離子成分在均的緩沖液系統(tǒng)中分離成獨(dú)立的區(qū)帶，可

以用染色等方法顯示出來，如果用光密度計(jì)掃描可得出一個(gè)個(gè)互相分離的峰。

b.移界電泳(movingboundaryEP,MBEP)：它只能起到部分分離的作用，如將濃度對(duì)距離作

圖，則得出一個(gè)個(gè)臺(tái)階狀的圖形

c.等速電泳(isotachophoresis,ITP)：在電泳達(dá)成平衡后，各區(qū)帶相隨，分成清晰的界面，

以等速移動(dòng)。按濃度對(duì)距離作圖也是臺(tái)階狀，但不同于上述移界電泳,它的區(qū)帶沒有重疊，

而是分別保持。

d.等電聚焦(isoelectriccusing,IEF):由多種具有不同等電點(diǎn)的載體兩性電解質(zhì)在電場

中自動(dòng)形成pH梯度。被分離物則各自移動(dòng)到其等電點(diǎn)而聚成很窄的區(qū)帶，分辨率很高。

(二)按有無固體支持物區(qū)分

根據(jù)電泳是在溶液中進(jìn)行還是在固體支持物上進(jìn)行，又可以分為自由電泳和支持物電泳兩大

類。

自由電泳又可分為：

①顯微鏡電泳(也稱細(xì)胞電泳)；

②移界電泳；

③柱電泳；

④自由流動(dòng)幕電泳；

⑤等速電泳；

4.電泳技術(shù)的特點(diǎn)

①凡是帶電物質(zhì)均可應(yīng)用某一電泳技術(shù)進(jìn)行分圈，并可進(jìn)行定性或定量分析；

②樣品用量極少；

③設(shè)備簡單；

④可在常溫進(jìn)行；

⑤操作簡便省時(shí)；

⑥分辨率高。

5.常用的電泳技術(shù)

一、Tiselius移界電泳法

Tiselius的移界電泳法具有重要的歷史意義，它的成功在于巧妙地解決了幾個(gè)問題：

①能夠形成清晰的起始界面；

②靠密度梯度能夠穩(wěn)定界面；

③能良好的散熱；

④在泳動(dòng)過程中可用光學(xué)方法顯示其組分。

二、區(qū)帶電泳

1）、濾紙及醋酸纖維素薄膜電泳

它具有簡單快速等優(yōu)點(diǎn)：

①電泳區(qū)帶界限清晰；

②通電時(shí)間較短（20min至1h）；

③對(duì)各種蛋白質(zhì)基本無吸附，因此無拖尾現(xiàn)象；

④不吸附染料，顯示電泳區(qū)帶背景干凈。

操作簡單、快速、廉價(jià)。已經(jīng)廣泛用于血清蛋白，血紅蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋白，

甲胎蛋白，類固醇及同工酶等的分離分析中

2）、高壓電泳

高壓電泳適用于分離低分子物質(zhì)，如氨基酸、肽、抗生素及其他有機(jī)和無機(jī)物。因?yàn)榈?/p>

分子物質(zhì)易擴(kuò)散，高電壓可使其移動(dòng)快，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到分離，減少擴(kuò)散的影響。

3）、連續(xù)電泳

用一張垂直懸掛的濾紙作支持物，由上方連續(xù)加樣，緩沖液連續(xù)由上方流下來，電極

加在左右兩方，電場方向與液流方向垂直。分離的成分由下方分別以試管收集

4）、凝膠電泳

（1）瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，是由D一半乳糖和3、6一脫水一L一半

乳糖結(jié)合的鏈狀多糖

影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素：遷移速率由DNA的分子大小、瓊脂糖濃度、DNA

的構(gòu)象、所加電壓、電場方向、堿基組成與溫度、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等許

多參數(shù)確定。

實(shí)驗(yàn)步驟：制膠，加緩沖液，拔梳子，點(diǎn)樣，電泳，紫外

（2）聚丙烯酰胺凝膠電泳：

聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE）早在1959年由Raymends

和Weintraub.L建立。1964年，此法進(jìn)一步從理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上得到改進(jìn)并推廣應(yīng)用。由

于具有較高的分辨率和靈活性，目前已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)等生物大分子的分離和分析。

實(shí)驗(yàn)步驟：安裝玻璃板，灌注分離膠，灌注濃縮膠，根據(jù)需要插入不同的梳子，30min左右

加電泳緩沖液，再拔梳子，點(diǎn)樣，電泳

染色:蛋白質(zhì)電泳中SDS凝膠檢測常采用的染色方法有考馬斯亮藍(lán)、硝酸銀染色、熒光染

色法

硝酸銀染色

銀染的機(jī)制:來源于攝影銀染技術(shù),是將蛋白分子結(jié)合的銀離子還原作成金屬銀。

優(yōu)點(diǎn):檢測靈敏度高，較普通考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度要高50-100倍，可在蛋白質(zhì)中找到含量

較低的蛋白，而且所需的上樣量較少（每點(diǎn)僅需0.1ng）。

缺點(diǎn):可重復(fù)性差

耗費(fèi)人力

質(zhì)譜測定有一定的干擾

硝酸銀染色染色方法：

化學(xué)顯色（雙胺染色）：是利用氨水同硝酸銀進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生銀-雙胺絡(luò)合物，將固定后的凝膠

浸泡其中，再通過酸化使其顯色。（非雙胺染色）：是將固定好的凝膠浸泡于酸性的硝酸銀中，

在硝酸銀和蛋白質(zhì)發(fā)生作用后在堿性條件下,用甲醛還原使其顯色。

光顯色：是使用光能還原銀離子成金屬銀。因?yàn)楣饽軌蛟谒嵝訮H還原銀，所以一旦凝膠被固

定,光顯色能使用單一染色溶液,而不像化學(xué)染色程序那樣通常需要兩種溶液。

6.聚丙烯酰胺凝膠的主要優(yōu)點(diǎn)：

①分辨率高。具有三種效應(yīng)：濃縮效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，電荷效應(yīng)；長度僅僅相差0.2%（即

500bp中的lbp）的DNA分子即可分開；（例）

②所能裝載的DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于瓊脂糖凝膠；

③從聚丙烯酰胺凝膠中回收的DNA純度很高。

④可根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小控制凝膠濃度制成不同孔徑的凝膠。

⑤丙烯酰胺較穩(wěn)定，無色透明，機(jī)械強(qiáng)度好，易觀察，可用檢測儀直接測定。

7.等電聚焦：

優(yōu)點(diǎn)：

①分辨率很高；

②樣品可混入膠中或加在任何位置，在電場中隨著電泳的進(jìn)行區(qū)帶越來越窄，克服了?般電

泳的擴(kuò)散作用。

③電泳結(jié)束后，可直接測定蛋白質(zhì)pl。

③分離速度快，蛋白質(zhì)可保持原有生物活性

缺點(diǎn)：

①電泳中應(yīng)使用無鹽樣品溶液，否則高壓中電流太大而發(fā)熱。但無鹽時(shí)有些蛋白質(zhì)溶解性能

差易發(fā)生沉淀，可在樣品中多加些兩性電解質(zhì)。

②許多蛋白質(zhì)在pl附近易沉淀而影響分離效果，可加些腺或非離子去垢劑解決。

8.雙向電泳

第一向根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同在PH梯度膠中等點(diǎn)聚焦。第二向根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大

小不同在垂直方向或水平方向進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）

9.蛋白質(zhì)印跡

蛋白質(zhì)印跡方法將高分辨率的電泳技術(shù)與靈敏的、專一的免疫探測技術(shù)結(jié)合起來,用針對(duì)蛋

白特定氨基酸序列的特異性試劑作為探針進(jìn)行檢測.對(duì)于蛋白質(zhì),通常使用的探針是抗體,它

與附著于固定基質(zhì)上的靶蛋白發(fā)生特異性反應(yīng).

10、免疫電泳：

a、抗原抗體特異性反應(yīng)。

b、抗原在pH8.6時(shí)通常帶強(qiáng)負(fù)電，而抗體不帶電。

c、抗原在含有抗體的凝膠中電泳時(shí)發(fā)生免疫反應(yīng)，抗原過量，僅產(chǎn)生可溶性的免疫復(fù)合物

與抗原一起向陽極移動(dòng)。

d、抗原與抗體濃度達(dá)到當(dāng)量點(diǎn)時(shí)，形成免疫沉淀帶

免疫電泳（immunoelectrophoresis,IEP）是將區(qū)帶電泳與雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化

學(xué)分析技術(shù)。先將蛋白質(zhì)抗原在瓊脂平板上進(jìn)行電泳，使不同的抗原成分因所帶電荷、分子

量及構(gòu)型不同，電泳遷移率各異而彼此分離。然后在與電泳方向平行的瓊脂槽內(nèi)加入相應(yīng)抗

體進(jìn)行雙向免疫分散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應(yīng)抗體在瓊脂中擴(kuò)散后相遇，在二者

比例合適處形成肉眼可見的弧形沉淀線。根據(jù)沉淀線的數(shù)量、位置和形狀，與已知的標(biāo)準(zhǔn)（或

正常）抗原抗體形成的沉淀線比較，即可對(duì)樣品中所含成分及其性質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定。

對(duì)流免疫電泳（counterimmunoelectrophoresis,CIEP）雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的技術(shù)。

在PH8.6的緩沖液中，抗原向正極泳動(dòng)；而抗體大部分屬于Ig,由于分子量大，暴露的極

性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng)（電滲使液體向負(fù)

極泳動(dòng)）在抗原抗體相遇的最適比例處形成乳白色沉淀線。由于電場的作用，限制了抗原、

抗體的自由擴(kuò)散，而使其定向泳動(dòng)，因而增加了試驗(yàn)的靈敏度，并縮短反應(yīng)時(shí)間。此法操作

簡便，僅需30?60分鐘，靈敏度比雙向擴(kuò)散高10?15倍；但缺點(diǎn)是特異性不如雙向瓊脂擴(kuò)

散高。

火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis,RIEP)是將單向免疫擴(kuò)散和電泳相結(jié)合的

一種定量檢測技術(shù)。電泳時(shí)，含于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)，而在電場的作用下促使樣

品中的抗原向正極泳動(dòng)。當(dāng)抗原與抗體分子達(dá)到適當(dāng)比例時(shí)，形成一個(gè)形狀如火箭的不溶性

免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與撿樣中的抗原濃度呈正相關(guān)。因此，當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定

時(shí)，以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo)，抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲

線。根據(jù)樣品的沉淀峰長度即可計(jì)算出待測抗原的含量；反之，當(dāng)瓊脂中抗原濃度固定時(shí)，

便可測定待測抗體的含量(即反向火箭免疫電泳)。

多維色譜技術(shù)

1.全二維色譜的特征：

a.樣品的每一部分都受到不同模式的分離

b.所有樣品組分以相等的比例轉(zhuǎn)移到二維

c.第二維的分離速度要足夠快

2.影響因素：

①接口

②流動(dòng)相種類、濃度、梯度比例

③閥切換時(shí)間

④連接管內(nèi)徑和長度等

3.傳統(tǒng)氣相色譜的不足：

1),即使采用毛細(xì)管色譜柱，傳統(tǒng)一維GC的峰容量仍然有限。

2).采用中心切割法的普通二維GC難以從復(fù)雜體系中對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行篩選。

3).重建譜圖困難。

4.全二維氣相色譜技術(shù)

1).正交性(Orthogonality)

理論上兩維色譜柱固定相的保留機(jī)理差別越大則峰容量越大，正交性越好，色譜峰分布越稀

疏，圖譜有效面積越大。否則色譜峰將分布與對(duì)角線附近。

2.)有序結(jié)構(gòu)(OrderedStructure)

被分離組分按化合物結(jié)構(gòu)類型分片分布，異構(gòu)體或結(jié)構(gòu)相似的同系物按順序排列，

可以實(shí)現(xiàn)族分離。色譜峰分布清晰，簡化了色譜峰的解析和譜圖的重建。

3).快速全成分分析

在分離度和靈敏度相同的前提下可一次完成復(fù)雜樣品的全成分分析，省去了多次分析

和重建譜圖的麻煩。

5,全二維氣相色譜的特點(diǎn)

①為保證第一維微分的色譜峰形在調(diào)制過程中不寬展，調(diào)制周期(ModulationCriterion)

不得大于第一維色譜峰寬的1/4,一般為5-30s。

②為防止色譜峰重疊，第二維分析時(shí)間一般控制在2-8s?以防止發(fā)生峰重疊(Wrap-around)。

③由于第二維分析速度快，故要求檢測器的掃描速率不得小于100Hz(ECD,FID、TOF),

④為了配合調(diào)制周期，第?維分析的升溫速率一般最高為2-3℃/min。

⑤第二柱很短，涂漬液很薄?；衔锓鍖捲?00-200mso

?一般不為第二維色譜柱單獨(dú)設(shè)柱溫箱。

6.調(diào)制的作用：

1.切割一維微分

2.進(jìn)行一維微分重聚焦

3.以脈沖形式將一維譙分送入二維

7.調(diào)制器(Modulator)的類型

熱調(diào)制器

通過移動(dòng)加熱來聚焦分析物(即熱掃帚方式)另種是通過冷阱方式對(duì)分析物進(jìn)行柱內(nèi)捕

集和聚焦

閥調(diào)制器

通過一個(gè)六通閥收集第一柱流出的微分并周期性地將其注射進(jìn)第二柱。80%的第一柱流出物

被注射進(jìn)第二柱并到達(dá)檢測器，因而具有較高的靈敏度

8.多維毛細(xì)管電泳(CE)

與LC-MS聯(lián)用相比，CE-MS聯(lián)用技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用尚處于起步階段，其關(guān)鍵問題

在于CE與MS的接口尚不能滿足需要。主要原因是：

(1)毛細(xì)管電泳的緩沖液通常是高離子強(qiáng)度、低揮發(fā)性,與質(zhì)譜的兼容性較差；

(2)二者的工作速度不匹配。

9.細(xì)胞膜色譜法(CMC)的提出

基本假設(shè)

(1)藥物分子與受體間存在特異性親合力。

(2)膜受體大分子表面活性點(diǎn)數(shù)與藥物分子有關(guān)。

(3)活性點(diǎn)與藥物可逆結(jié)合，并具有立體特異性和飽和性。

(4)強(qiáng)溶劑及性質(zhì)相近的競爭性藥物有置換藥物分子的能力。

(5)同類藥物分子在同一受體上作用位點(diǎn)和強(qiáng)度存在差異性。

(6)藥物在受體上的作用位點(diǎn)和強(qiáng)度決定著受體的存在狀態(tài)。

10.細(xì)胞膜色譜法基本原理及特性

CMC：將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相(cellmembranestationaryphase,CMSP),

利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法。

特性：

①雙重功能：色譜分離+受體親利

②特異性、飽和性

③穩(wěn)定、簡捷、高效

1L細(xì)胞膜色譜聯(lián)用方法的提出

原CMC法存在的問題

第一，靶細(xì)胞是通過生物組織和一般培養(yǎng)方法獲得的，靶細(xì)胞質(zhì)膜上的“目標(biāo)”受體表達(dá)數(shù)

量有限且不可控，使得對(duì)配體識(shí)別的靈敏性和選擇性受到了不同程度的限制；

第二，靶細(xì)胞質(zhì)膜上“目標(biāo)”受體的低表達(dá)，使得色譜固定相表面的非均勻性質(zhì)增強(qiáng)，配體

與膜受體間結(jié)合反應(yīng)性減弱，對(duì)復(fù)雜體系中微量或痕量成分的識(shí)別有一定困難；

第三，采用的單通道/單檢測分析系統(tǒng)，使得對(duì)活性成分的鑒定不能同步在線進(jìn)行，系統(tǒng)的在

線定性和定量功能相對(duì)較弱等。

12.細(xì)胞膜色譜優(yōu)點(diǎn)

1)細(xì)胞膜色譜模型可在體外動(dòng)態(tài)地模擬藥物與靶細(xì)胞的相互作用，其研究結(jié)果與經(jīng)典的放

射性配體結(jié)合分析結(jié)果顯著相關(guān)。

2)細(xì)胞膜色譜模型可高通量地從復(fù)雜體系中篩選發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物，并可用于中藥物質(zhì)基礎(chǔ)

研究。

3)細(xì)胞膜色譜模型的建立，拓展了色譜技術(shù)的活性識(shí)別功能。

13.色譜聚焦原理

1)當(dāng)柱子流出液的pH值為6.0時(shí)，所有的蛋白質(zhì)2將從柱上解離并洗脫下來。首先利用

pH=8.5的起始緩沖液進(jìn)行平衡。蛋白質(zhì)l（pl=9.5）的分子被柱子排斥，并且在pH=8.5時(shí)

洗脫。蛋白質(zhì)2（pl=6.0）的分子在該pH值下吸附到柱上。

2）將pH=4.0的洗脫緩沖液加到柱上，并且在柱中形成pH梯度。當(dāng)pH值與pl值相等時(shí),

蛋白質(zhì)2的分子即發(fā)生解離。分子在柱中不斷前進(jìn)，并且在pH值高于pl值時(shí)進(jìn)行結(jié)合。

3）洗脫緩沖液和pH梯度展開液繼續(xù)流動(dòng)。蛋白質(zhì)2的分子繼續(xù)沿著柱子解離和結(jié)合。

4）當(dāng)柱子流出液的pH值為6.0時(shí)，所有的蛋白質(zhì)2將從柱上解離并洗脫下來。

GC-MS接口技術(shù)（老師口述）

開口分流型：色譜柱洗脫物的一部分被送入質(zhì)譜儀，這樣的接口稱為分流型接口。

原理:內(nèi)套管置于一個(gè)外套管中，外套管中充滿氮?dú)?，?dāng)色譜柱的流量大于質(zhì)譜儀的工作流

量時(shí),過多的色譜柱流出物和載氣隨氨氣流出接u,當(dāng)色譜柱流量小于質(zhì)譜儀的工作流量時(shí),

外套管中的氮?dú)馓峁┭a(bǔ)充。

特點(diǎn)：1.色譜柱出口常壓、接口簡單

2.在色譜流量較大時(shí)，傳輸能力較低，不適用于填充柱條件

噴射式分離器：

工作原理：氣體在噴射過程中，不同質(zhì)量的分子都以超音速的速度運(yùn)動(dòng)，不同質(zhì)量的分子具

有不同的動(dòng)量，動(dòng)量大的分子易保持沿噴射方向運(yùn)動(dòng)，而動(dòng)量小的易于偏離噴射方向被真空

泵抽走。分子量較小的載氣在噴射過程中偏離接收口，分子量較大的待測物得到濃縮后進(jìn)入

接口。

特點(diǎn)：1.分離除去絕大部分載氣，使試樣組分濃集，同時(shí)達(dá)到低真空度。

2.適用于填充柱或毛細(xì)管柱與較小功率的抽真空質(zhì)譜儀聯(lián)接。

三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器：只有質(zhì)荷比滿足要求的離子才能通過四級(jí)桿到達(dá)檢測器。其它離子

則撞到四級(jí)電極上而被“過濾”掉。

第一個(gè)Q：根據(jù)設(shè)定的質(zhì)荷比范圍掃描和選擇所需的離子

第二個(gè)Q：也稱碰撞池，用于聚集和傳遞離子，同時(shí)引入碰撞氣體，如氮?dú)?/p>

第三個(gè)Q:用于分析在碰撞池中產(chǎn)生的碎片離子

四極桿質(zhì)譜結(jié)構(gòu)簡單，價(jià)廉，體積小，易操作，掃描速度快，

適合于GC-MS,LC-MS,但分辨率不高。

細(xì)胞膜色譜（可能考）

1.簡述細(xì)胞膜色譜基本原理及其在藥物發(fā)現(xiàn)過程中的特點(diǎn)。

細(xì)胞膜色譜：將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相，利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中

藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法。

基本原理：細(xì)胞膜是生物效應(yīng)靶點(diǎn)最集中的部位，細(xì)胞膜生物色譜利用細(xì)胞信息傳遞的關(guān)鍵

部位-效應(yīng)靶點(diǎn)，應(yīng)用藥物效應(yīng)的產(chǎn)生使藥物分子與生物大分子結(jié)合，激活了生物信息體系

而產(chǎn)生的觀點(diǎn)，采用具有活性細(xì)胞膜特異性結(jié)合中藥中的效應(yīng)成分，并以色譜技術(shù)加以分析

的一種新的研究中藥的效應(yīng)成分并對(duì)此進(jìn)行篩選與分離。

特性：①雙重特性：色譜分離+受體親和②特異性、飽和性：與RLBA,FA進(jìn)行對(duì)比和相關(guān)

研究③穩(wěn)定、簡捷、高效：膜受體是藥物進(jìn)入體內(nèi)的關(guān)鍵作用靶體，也是藥物發(fā)現(xiàn)的重要篩

選靶標(biāo)。細(xì)胞膜色譜法將藥物/受體作用的體內(nèi)過程，在體外轉(zhuǎn)化為一個(gè)色譜過程，直接研

究藥物/受體互作用，直接從復(fù)雜體系中篩選發(fā)現(xiàn)有效組分。

藥物發(fā)現(xiàn)中的特點(diǎn)：1.中藥與西藥的本質(zhì)都是物質(zhì)，但其化學(xué)組成正好是兩個(gè)極端體系2.

更復(fù)雜體系-中藥復(fù)方是中醫(yī)藥精髓和奧妙所在。3.利用細(xì)胞膜色譜技術(shù)特點(diǎn)，同步進(jìn)行復(fù)

雜體系的色偶分析與活性篩選，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜體系的高通量篩選4.借鑒中醫(yī)理論宏觀思想，利用

西醫(yī)理論對(duì)證原則，研究開發(fā)“成分明確，機(jī)理清楚、量效相關(guān)、質(zhì)量可控和療效確切”的

以成分或部位為單位的中藥制劑。

2.細(xì)胞膜色譜技術(shù)及其在中藥篩選中的應(yīng)用

CMC：將細(xì)胞膜結(jié)合到硅膠表面，制成細(xì)胞膜固定相(cellmembranestationaryphase,CMSP),

利用色譜學(xué)技術(shù)研究流動(dòng)相中藥物與受體相互作用規(guī)律的受體動(dòng)力學(xué)新方法

特性：①雙重特性：色譜分離+受體親和②特異性、飽和性：與RLBA,FA進(jìn)行對(duì)比和相關(guān)

研究③穩(wěn)定、簡捷、高效：

膜受體是藥物進(jìn)入體內(nèi)的關(guān)鍵作用靶體，也是藥物發(fā)現(xiàn)的重要篩選靶標(biāo)。細(xì)胞膜色譜法將藥

物/受體作用的體內(nèi)過程，在體外轉(zhuǎn)化為一個(gè)色譜過程，直接研究藥物/受體互作用，直接從

復(fù)雜體系中篩選發(fā)現(xiàn)有效組分。

3.細(xì)胞膜色譜制備

1).細(xì)胞膜制備

主要設(shè)備

冷凍高速離心機(jī)：＞12000g

4℃超聲波清洗機(jī)

其他設(shè)備與器材

制冰機(jī)渦旋振蕩器電子天平pH計(jì)勻漿器

2).細(xì)胞固定相制備

主要設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱

真空泵渦旋振蕩器磁力攪拌器低溫冰箱(陳列柜)離心機(jī)

其他設(shè)備與器材

電子天平PH計(jì)勻漿器具支試管

3).色譜柱制備

主要設(shè)備裝柱機(jī)渦旋振蕩器

其他設(shè)備與器材

低溫冰箱(陳列柜)pH計(jì)空色譜柱套裝

4).細(xì)胞膜色譜分析

主要設(shè)備

高效液相色譜儀：溶劑輸送泵進(jìn)