醫(yī)療器械檢化員微生物培訓(xùn)97

醫(yī)療器械檢化員微生物培訓(xùn)一、人員資質(zhì)及培訓(xùn)要求

從事醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn)工作的人員應(yīng)具備微生物學(xué)或相近專業(yè)知識的教育背景。檢驗(yàn)人員應(yīng)依據(jù)所在崗位和職責(zé)接受相應(yīng)的培訓(xùn)，在確認(rèn)它們可以承擔(dān)某一檢驗(yàn)前，他們不能獨(dú)立從事該項(xiàng)微生物檢驗(yàn)。應(yīng)保證所有人員在上崗前接受勝任工作所必須的設(shè)備操作、微生物檢驗(yàn)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室生物安全等方面的培訓(xùn)，經(jīng)考核合格后方可上崗，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定所有級別試驗(yàn)人員的繼續(xù)教育計(jì)劃。檢驗(yàn)人員必須熟悉相關(guān)監(jiān)測方法、程序、檢驗(yàn)?zāi)康暮徒Y(jié)果評價(jià)。微生物實(shí)驗(yàn)室的管理者其專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)水平應(yīng)與他們的職責(zé)范圍相符，如：管理技能、實(shí)驗(yàn)室安全、檢驗(yàn)安排、預(yù)算、實(shí)驗(yàn)研究、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評估和數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查、技術(shù)報(bào)告書寫等。

二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【原則】實(shí)驗(yàn)室布局設(shè)計(jì)的基本原則是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止檢驗(yàn)過程對環(huán)境和人員造成危害。通常，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)劃分成潔凈或無菌區(qū)域和活菌操作區(qū)域，同時(shí)應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康模跁r(shí)間或空間上有效分隔不相容的試驗(yàn)活動(dòng)，將交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)降低到最低。一般情況下，醫(yī)療器械微生物檢驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)具有開展無菌檢查、微生物限度檢查等檢測活動(dòng)的、獨(dú)立設(shè)置的潔凈室（區(qū)）或隔離系統(tǒng)，并為上述檢驗(yàn)配備相應(yīng)的細(xì)菌（真菌）等實(shí)驗(yàn)室、培養(yǎng)室、文檔處理區(qū)等輔助區(qū)域，同時(shí)，應(yīng)對上述區(qū)域明確標(biāo)識。二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【要求】1、無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。用于無菌檢查和微生物限度檢查的潔凈操作室應(yīng)配有屬于“人流凈化”的更衣室及屬于“物流凈化”的緩沖間或傳遞窗（柜），使進(jìn)入潔凈操作室的實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)物品分別經(jīng)適當(dāng)凈化后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)操作間。無菌室分無菌操作室和緩沖間。無菌操作室應(yīng)具有空氣除菌過濾的單向流空氣裝置。操作室或工作臺(tái)應(yīng)保持正壓。應(yīng)在壓差十分重要的相鄰級別區(qū)之間安裝壓差表。二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【要求】2、微生物限度檢查的全過程，均應(yīng)遵守?zé)o菌操作，嚴(yán)防再污染。因此，微生物限度檢查宜在環(huán)境潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行；限度檢查實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配有相應(yīng)的人流和物流緩沖間，并定期作環(huán)境監(jiān)測。二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制

【要求】

3、菌種處理、微生物鑒別和陽性對照室菌種的處理包括的內(nèi)容比較多，如菌種的傳代、保藏、制備以及培養(yǎng)基促生長實(shí)驗(yàn)、陽性對照、微生物方法驗(yàn)證、消毒劑和防腐劑的效力測定和對環(huán)境中分離菌的鑒別等，這些實(shí)驗(yàn)過程中都在處理活的微生物，處理不當(dāng)會(huì)造成實(shí)驗(yàn)室環(huán)境污染，影響其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此，該室必須與其他實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格分開；必要時(shí)，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)室性質(zhì)的需要保持對相鄰實(shí)驗(yàn)室的相對壓差；需采取必要的消毒方式確保實(shí)驗(yàn)室潔凈條件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以凈化層流臺(tái)作為局部100級的控制措施，最好是使用生物安全柜，所有的與活毒菌種相關(guān)的活動(dòng)都應(yīng)在層流臺(tái)或生物安全柜中進(jìn)行。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后要對層流臺(tái)或生物安全柜及整個(gè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行消毒。所有與菌種相關(guān)的實(shí)驗(yàn)廢物均應(yīng)經(jīng)過滅菌處理后方可丟棄。二、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制【要求】4、培養(yǎng)室及其他功能間培養(yǎng)室用于放置培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)箱。準(zhǔn)備區(qū)即試液及培養(yǎng)基配制/滅菌區(qū)域、實(shí)驗(yàn)器皿洗滌、烘干、滅菌、實(shí)驗(yàn)用品及易耗品儲(chǔ)藏等沒有特殊要求的功能間，可為一般清潔環(huán)境。如果14以內(nèi)觀察到陽性結(jié)果，不必繼續(xù)培養(yǎng)。2、無菌生理鹽水、麥?zhǔn)媳葷峁?；無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查初始污染菌方法驗(yàn)證（ISO11737）將已制備好的培養(yǎng)皿按要求放置，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.25%BaCl2（ml）將每個(gè)采樣管震打80次，混勻，10倍遞減稀釋，每個(gè)稀釋度（取3個(gè)稀釋度）分別取1ml放于滅菌培養(yǎng)皿（每個(gè)稀釋度傾注2塊平板），用普通瓊脂培養(yǎng)基作傾注培養(yǎng)，置37℃溫箱培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果，取菌落數(shù)為30～300的培養(yǎng)皿計(jì)算，求出平均菌落數(shù)。2、找張白紙打上平行直線，利用光在不同濃度液體折射不同幫助觀察比較。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達(dá)到分離的目的，常稱分離培養(yǎng)法。環(huán)境檢測參照標(biāo)準(zhǔn)25%BaCl2（ml）均生長良好，該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.1定義：樣品份額(SIP)sampleitemportion，即從某一保健產(chǎn)品單元上取出的用于試驗(yàn)的部分。微生物環(huán)境控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB/T16292:2021，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子測試方法GB/T16293:2021，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))浮游菌測試方法GB/T16294:2021，醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))沉降菌測試方法GB50073-2001潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范ISO14644-1:1999潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境第1部分：空氣潔凈度等級劃分ISO14644-4:1999潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境第4部分：設(shè)計(jì)、施工、運(yùn)行ISO14644-7:1999潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境第7部分：分離的設(shè)備無菌室環(huán)境控制設(shè)備微粒計(jì)數(shù)儀無菌室環(huán)境控制設(shè)備浮游菌采樣儀無菌室環(huán)境控制設(shè)備潔凈室沉降菌測試方法1.測試時(shí)間1.1對單向流，如100級凈化房間及層流工作臺(tái)，測試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于10min后開始。1.2對非單向流，如10000級、100000級以上的凈化房間，測試應(yīng)在凈化空調(diào)系統(tǒng)正常運(yùn)行不少于30min后開始。2.采樣方法將已制備好的培養(yǎng)皿按要求放置，打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露0.5h，再將培養(yǎng)皿蓋蓋上后倒置。2.2.培養(yǎng)全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在30℃～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時(shí)間不少于48h。每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗(yàn)，檢驗(yàn)培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。潔凈室沉降菌測試方法3.菌落計(jì)數(shù)用肉眼直接計(jì)數(shù)，標(biāo)記或在菌落計(jì)數(shù)器上點(diǎn)計(jì)，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。若培養(yǎng)皿上有2個(gè)或2個(gè)以上的菌落重疊，可分辨時(shí)仍以2個(gè)或2個(gè)以上菌落計(jì)數(shù)。4.注意事項(xiàng)4.1測試用具要作滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。4.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。4.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。4.4由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計(jì)培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時(shí)用顯微鏡鑒別。4.5采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個(gè)培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。潔凈室沉降菌測試方法5.測試規(guī)則5.1.測試狀態(tài)5.1.1沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）的溫濕度須達(dá)到規(guī)定的要求，靜壓差、換氣次數(shù)、空氣流速必須控制在規(guī)定值內(nèi)。5.1.2沉降菌測試前，被測試潔凈室（區(qū)）已經(jīng)過消毒。5.1.3測試狀態(tài)有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種，測試狀態(tài)的選擇必須符合生產(chǎn)的要求，并在報(bào)告中注明測試狀態(tài)。5.2.測試人員5.2.1測試人員必須穿戴符合環(huán)境潔凈度級別的工作服。5.2.2靜態(tài)測試時(shí)，室內(nèi)測試人員不得多于二人。最少采樣點(diǎn)數(shù)目面積潔凈度級別10010000100000<102～322≥10～＜20422≥20～＜40822≥40～＜1001642≥100～＜20040103≥200～＜40080206≥400～＜10001604013≥1000～＜200040010032200080020063注：表中的面積，對于單向流潔凈室.指的是送風(fēng)面積；對非單向流潔凈室，指的是房間面積同時(shí)滿足最少平皿數(shù)潔凈度級別所需Φ90mm培養(yǎng)皿數(shù)（以沉降0.5h計(jì)）100級1410000級2100OOO級2采樣點(diǎn)的布置采樣點(diǎn)的位置可以同懸浮粒子測試點(diǎn)。a）工作區(qū)采樣點(diǎn)的位置離地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。b）可在關(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動(dòng)范圍處增加采樣點(diǎn)。采樣點(diǎn)位置的詳細(xì)規(guī)則見附錄B（標(biāo)準(zhǔn)的附錄）。采樣點(diǎn)布置潔凈度級別沉降菌浮游菌塵粒的最大允許數(shù)/m3個(gè)/（Φ90mm）0.5h）活微生物數(shù)/m3≥0.5μm≥5μm100≤1≤5≤3500－10000≤3≤100≤350000≤2000環(huán)境檢測參照標(biāo)準(zhǔn)微生物實(shí)驗(yàn)室管理嚴(yán)格區(qū)分污染區(qū)及清潔區(qū)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB15980-1995一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB15981-1995消毒與滅菌效果的評價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)三、滅菌控制

微生物實(shí)驗(yàn)使用的試劑、器材等常需用濕熱滅菌法。濕熱滅菌的溫度和時(shí)間需驗(yàn)證，必須保證物品滅菌后無菌保證值SAL≤10-6。滅菌程序經(jīng)驗(yàn)證合格后方可使用。定期進(jìn)行BD實(shí)驗(yàn)、真空泄漏測試、溫度參數(shù)測試（空載熱分布、定載熱穿透、滿載熱穿透）、壓力改變速率測試（GB8599-2021大型蒸汽滅菌器技術(shù)要求），同時(shí)以生物指示劑驗(yàn)證滅菌效果,必須保證物品滅菌后無菌保證值SAL小于百萬分之一。三、滅菌控制

所有器具應(yīng)采用可靠方法滅菌置壓力蒸汽滅菌器內(nèi)121℃30min

或置電熱干燥箱內(nèi)180℃2h。濕熱滅菌控制相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GB18281.3-2000醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌生物指示物第3部分:濕熱滅菌用生物指示物ISO11138-3-2006醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌.生物指示物.第3部分:濕熱滅菌用生物指示劑四、培養(yǎng)基管理1、培養(yǎng)基的制備2、培養(yǎng)基的貯藏3、培養(yǎng)基的質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)五、無菌操作定義：是指在執(zhí)行實(shí)驗(yàn)過程中，防止一切微生物侵入機(jī)體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術(shù)和管理方法。無菌操作技術(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)的基本技術(shù)，是保證微生物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確和順利完成的重要環(huán)節(jié)。無菌操作技術(shù)主要包括兩方面：創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境及在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入。創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境包括提供密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺(tái)的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。微生物實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備微生物實(shí)驗(yàn)控制1：人員管理微生物實(shí)驗(yàn)控制2：環(huán)境控制微生物實(shí)驗(yàn)控制3：滅菌控制微生物實(shí)驗(yàn)控制4：培養(yǎng)基管理微生物實(shí)驗(yàn)控制5：無菌操作微生物基本操作

瓊脂平板接種法瓊脂斜面接種法半固體接種法肉湯培養(yǎng)基接種法瓊脂平板接種法細(xì)菌在自然界及人體中分布廣，種類多，為了了解菌譜，須先將各種細(xì)菌分離，獲得純菌培養(yǎng)物后才能進(jìn)一步作細(xì)菌的鑒定。瓊脂平板培養(yǎng)基因面積大，接種后可達(dá)到分離的目的，常稱分離培養(yǎng)法。平板接種方法有多種。以下介紹平行劃線法及分區(qū)劃線法。瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）分區(qū)劃線法瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）平行劃線法瓊脂平板接種法（分離培養(yǎng)法）單個(gè)菌落單個(gè)菌落瓊脂斜面接種法目的：多用于純種細(xì)菌的增菌和保存菌種方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許。拔去瓊脂斜面培養(yǎng)基塞，管口經(jīng)火焰上滅菌，將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入管內(nèi)，自下而上在瓊脂上蜿蜒劃線；接種后，管口在火焰上滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌：在試管口處做好標(biāo)記，置37℃培養(yǎng)18－24小時(shí)大腸桿菌斜面金黃色葡萄球菌斜面肉湯接種法目的：用于增菌。方法：用滅菌接種環(huán)取細(xì)菌培養(yǎng)物少許；以無菌操作將沾有細(xì)菌的接種環(huán)伸入肉湯中，將環(huán)上細(xì)菌輕輕研磨于接近液面的管壁上，然后將試管稍傾斜，使肉湯碰及細(xì)菌即可；接種后管口滅菌，塞回塞，接種環(huán)滅菌，并做好標(biāo)記，置37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)半固體接種法（穿刺接種法）目的：增菌和保存菌種；觀察細(xì)菌有無動(dòng)力。方法：用接種針，將取有細(xì)菌的接種針自培養(yǎng)基中央刺入（不要接觸管底），沿原穿刺線撥出，注意在刺入與拔出時(shí)不可晃動(dòng)接種針；接種后做好標(biāo)記。置37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)．半固體瓊脂培養(yǎng)基（0.5%）

菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽準(zhǔn)媳葷峁埽菏荕cFarland發(fā)明的一種用于微生物比濁的不同濁度的標(biāo)準(zhǔn)濁度管。具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來定的，有表可查，這樣不同比例生成的硫酸鋇沉淀的濃度不同，且都有定值。麥?zhǔn)媳葷峁艿呐浔裙芴?McFarland)0.5123450.25%BaCl2（ml）0.20.40.81.21.62.01%H2SO4(ml)9.89.69.28.88.48.0細(xì)菌的近似濃度(×108/ml)13691215菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽静牧稀?、實(shí)驗(yàn)所需的微生物新鮮培養(yǎng)物如：金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物；2、無菌生理鹽水、麥?zhǔn)媳葷峁埽?、酒精燈、接種環(huán)、無菌吸管、平皿。菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽痉椒ā?、輕搖標(biāo)準(zhǔn)試管；2、無菌操作挑取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至無菌生理鹽水試管（與標(biāo)準(zhǔn)管相同直徑）中混勻，直到濁度與所要求的標(biāo)準(zhǔn)管的濃度相同；3、序列稀釋已挑取菌落的生理鹽水試管至所需的菌液濃度如：100cfu/ml;4、用平皿計(jì)數(shù)法驗(yàn)證所配置菌液的實(shí)際濃度。菌懸液制備（使用麥?zhǔn)媳葷峁埽臼褂眉记伞?、直接用眼睛看（需要經(jīng)驗(yàn)，誤差較大）。2、找張白紙打上平行直線，利用光在不同濃度液體折射不同幫助觀察比較。123456786×1086×1076×1066×1056×1046×1036×1026×101麥?zhǔn)?號管稀釋梯度表（cfu/ml）菌懸液制備（使用分光光度儀）分光光度儀

菌懸液制備的保存菌懸液制備：菌懸液制備后應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃的菌懸液可以在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉也可制成穩(wěn)定的孢子懸液保存在2～8℃，在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)替代對應(yīng)量的新鮮孢子懸液使用。培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查

靈敏度檢查所需的六種菌：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]ATCC6538銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]ATCC9027枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]ATCC6633生孢梭菌[CMCC(B)64941]ATCC11437白色念珠菌[CMCC(F)98001]ATCC10231黑曲霉[CMCC(F)98003]ATCC16404根據(jù)培養(yǎng)基的功能選擇靈敏度實(shí)驗(yàn)所需菌種5對測試中使用的設(shè)備、材料和產(chǎn)品進(jìn)行滅菌具體的配制方法是根據(jù)硫酸和氯化鋇的比例來定的，有表可查，這樣不同比例生成的硫酸鋇沉淀的濃度不同，且都有定值。銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]ATCC9027≥1000～＜2000如果14以內(nèi)觀察到陽性結(jié)果，不必繼續(xù)培養(yǎng)。9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告。1在一個(gè)專門準(zhǔn)備、環(huán)境控制的房間內(nèi)的層流罩的環(huán)境中進(jìn)行測試微生物實(shí)驗(yàn)控制2：環(huán)境控制ISO11138-3-2006醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌.2、無菌操作挑取金黃色葡萄球菌新鮮培養(yǎng)物至無菌生理鹽水試管（與標(biāo)準(zhǔn)管相同直徑）中混勻，直到濁度與所要求的標(biāo)準(zhǔn)管的濃度相同；可以考慮使用無菌中和劑，如吐溫80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-內(nèi)酰胺酶。洗脫液對照組(4)的菌回收率應(yīng)均不低于70%。菌株傳代基本概念標(biāo)準(zhǔn)菌株：由國內(nèi)或國際菌種保藏機(jī)構(gòu)保藏的，遺傳學(xué)特性得到確認(rèn)和保證并可追溯的菌株。（0代）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：由標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)一次傳代得到的培養(yǎng)物。（1代）商業(yè)派生菌株：由供應(yīng)商提供的所有特性與標(biāo)準(zhǔn)菌株等效的菌株。（2代）工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株經(jīng)傳代得到的培養(yǎng)物。（2代）代：將活的微生物接種到新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，并希望獲取新的微生物培養(yǎng)物。這種操作方式，新培養(yǎng)物對接種培養(yǎng)物而言就稱為一代。制備工作菌種進(jìn)行菌種保藏的模式圖采購的第2代超低溫冷凍標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌種工作菌種第3代工作菌種第3代工作菌種第4代工作菌種第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代各類菌種保藏條件及時(shí)間

菌種培養(yǎng)基保存溫度傳種時(shí)間細(xì)菌一般多用于營養(yǎng)瓊脂或根據(jù)菌種規(guī)定選用培養(yǎng)基4~6℃芽孢桿菌3~6個(gè)月，其它細(xì)菌每個(gè)月酵母菌一般用麥芽汁瓊脂或麥芽汁酵母膏瓊脂4~6℃一般4~6個(gè)月絲狀真菌一般用PDA瓊脂、蔡氏瓊脂或麥芽汁瓊脂等4~6℃每4個(gè)月移植一次（每2個(gè)月移植一次）

菌種保管

?菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé)，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí)，必須做好交接工作。

?菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。

?各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無污染和變異，如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí)，應(yīng)及時(shí)更換。

?購置菌種，應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告。

FTM的靈敏度檢查培養(yǎng)基標(biāo)準(zhǔn)菌種(10-100cfu/ml)30～35℃培養(yǎng)培養(yǎng)天數(shù)12345FTM(12ml)金黃色葡萄球菌管1管2緑膿桿菌管3管4枯草芽孢桿菌管5管6生胞梭菌管7管8空白對照管9培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查接種金黃色葡萄球菌、緑膿桿菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種生胞梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48h；用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml菌液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7d,加3～5ml0.9%無菌氯化鈉溶液將孢子洗脫。然后，吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成10-100cfu/ml孢子懸液備用。菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；制備成活菌數(shù)＜100cfu的菌懸液備用菌株傳代次數(shù)不得超過5代培養(yǎng)基接種每種菌接種至2管相應(yīng)的培養(yǎng)基，另取一支不接種作空白對照，按規(guī)定溫度時(shí)間培養(yǎng)。結(jié)果判斷空白對照管應(yīng)無菌生長，每種菌接種后的2管培養(yǎng)基管均生長良好，該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。培養(yǎng)條件金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌接種至營養(yǎng)肉湯（或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；生孢梭菌接種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中30～35℃培養(yǎng)3天；白色念珠菌、黑曲霉接種至改良馬丁培養(yǎng)基中23～28℃培養(yǎng)5天培養(yǎng)基質(zhì)量控制：靈敏度檢查培養(yǎng)基質(zhì)量控制：無菌檢查

每批滅菌的培養(yǎng)基隨機(jī)取不少于5支(瓶)，培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。無菌實(shí)驗(yàn)無菌實(shí)驗(yàn)預(yù)防假陽性措施1在一個(gè)專門準(zhǔn)備、環(huán)境控制的房間內(nèi)的層流罩的環(huán)境中進(jìn)行測試2在整個(gè)測試過程中使用無菌技術(shù)3用避免污染的方法把測試器皿、培養(yǎng)基和測試物品引入測試區(qū)4測試產(chǎn)品表面的細(xì)菌污染，在引導(dǎo)測試物品進(jìn)入測試區(qū)之前，先對產(chǎn)品的外包裝進(jìn)行消毒。5對測試中使用的設(shè)備、材料和產(chǎn)品進(jìn)行滅菌6簡化進(jìn)行測試必須的操作7盡量避免懸浮微粒的產(chǎn)生8環(huán)境時(shí)時(shí)監(jiān)測（沉降菌檢測）無菌實(shí)驗(yàn)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GBT19973.2-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第二部分：確認(rèn)滅菌過程的無菌試驗(yàn)ISO11737-22021-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第二部分：確認(rèn)滅菌過程的無菌試驗(yàn)無菌實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)條件不論哪種無菌試驗(yàn)方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天；改良馬丁23-28℃，不少于14天。如果14以內(nèi)觀察到陽性結(jié)果，不必繼續(xù)培養(yǎng)。無菌實(shí)驗(yàn)陽性對照應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽性對照菌：無抑菌作用及抗革蘭陽性菌為主的供試品．以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對照菌；抗霉菌的供試品，以白色念珠菌為對照菌。加菌量小于l00cfu，供試品用量同供試品無菌實(shí)驗(yàn)時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽性對照管培養(yǎng)48～72小時(shí)應(yīng)生長良好．陰性對照陰性對照：陰性對照供試品無菌實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋同法操作作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。無菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷肉湯培養(yǎng)基有菌生長的常見三種形式：混濁生長：液體變混濁。菌膜：液體澄清，表面有一薄層菌膜。沉淀生長：液體澄清，管底有沉淀物混濁生長：液體變混濁肉湯培養(yǎng)基有菌生長的常見形式無菌實(shí)驗(yàn)：結(jié)果判斷1.陽性對照管應(yīng)生長良好，陰性對照管應(yīng)無菌生長2.培養(yǎng)期間逐日觀察并記錄是否有菌生長，如培養(yǎng)14天后，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，但不能確定是否有微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)種至同種新鮮培養(yǎng)基或劃線接種于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)兩天，霉菌培養(yǎng)三天，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面是否有菌生長；或取培養(yǎng)液涂片，染色，鏡檢，判斷是否有菌。釋出物檢查

無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查目的：對未知或可疑的供試品，在進(jìn)行無菌試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行方法驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品在該試驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不計(jì)。無菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：釋出物檢查取滅菌產(chǎn)品以無菌操作轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中,30-35℃培養(yǎng)24hrs；

注意：使用與實(shí)際無菌實(shí)驗(yàn)同種等量的培養(yǎng)基接種每毫升濃度小于100cfu的菌種稀釋液在無菌培養(yǎng)基內(nèi)，一式兩份，其中一份加入無菌試樣，另一份作為陽性對照，并在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。按表1所列菌種重復(fù)以上步驟。無菌樣品100cfu菌種＋無菌樣品實(shí)驗(yàn)組對照組釋出物檢查在合適的溫度培養(yǎng)不超過5天。選擇合適的微生物，重復(fù)以上步驟。釋出物檢查解釋：通過與陽性對照對比，如果在培養(yǎng)容器內(nèi)看不到微生物生長，則說明使用的樣品能抑止細(xì)菌或霉菌的生長?？梢钥紤]使用無菌中和劑，如吐溫80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-內(nèi)酰胺酶。如果中和劑無效，增加培養(yǎng)基的量。盡量使用能使試驗(yàn)微生物生長的最小的培養(yǎng)基的量。大豆酪蛋白消化物培養(yǎng)基(SCDM)菌種培養(yǎng)溫度培養(yǎng)條件培養(yǎng)時(shí)間枯草芽孢桿菌ATCC663322.5±2.5o需氧3天白色念珠菌ATCC1023122.5±2.5o需氧3-5天釋出物檢查常用菌種初始污染菌定義

生物負(fù)載：一件產(chǎn)品和/或包裝上存活的微生物總數(shù)。生物負(fù)載估計(jì)值：通過對活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)加上一個(gè)回收效率補(bǔ)償系數(shù)，得出的組成生物負(fù)載的微生物數(shù)值。初始污染菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)ISO-11737-1:2006GBT19973.1-2005-醫(yī)用器材的滅菌微生物學(xué)方法第一部分產(chǎn)品上微生物總數(shù)的估計(jì)樣品份額取樣原則

1定義：樣品份額(SIP)sampleitemportion，即從某一保健產(chǎn)品單元上取出的用于試驗(yàn)的部分。2取樣注意事項(xiàng)2.1若可操作，試驗(yàn)應(yīng)使用整個(gè)產(chǎn)品單元。但這往往被認(rèn)為是不可行的，產(chǎn)品單元上的樣品份額宜在實(shí)驗(yàn)室易于操作的前提下盡可能大。2.2如果所用的樣品份額((SIP)小于一個(gè)完整的產(chǎn)品單元，則應(yīng)選擇代表產(chǎn)品單元的具有微生物的部分。如果已驗(yàn)證微生物在產(chǎn)品單元上是均勻分布的，應(yīng)從產(chǎn)品單元上任一部位選擇樣品份額。在缺少這些驗(yàn)證的情況下，應(yīng)從產(chǎn)品單元上隨機(jī)選擇幾個(gè)部分作為樣品份額。2.3樣品份額本身應(yīng)對產(chǎn)品單元內(nèi)的產(chǎn)品有代表性。當(dāng)產(chǎn)品分成不同的部分，可以分裝于兩個(gè)或多個(gè)容器內(nèi)。樣品份額可以根據(jù)供試產(chǎn)品單元的長度、質(zhì)量、體積或表面積。如果產(chǎn)品單元有標(biāo)簽說明只是液路無菌，宜把液路視為整個(gè)試驗(yàn)單位。(即SIP=1)2.4SIP選擇舉例，見表1表1SIP選擇舉例選擇SIP的依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品表面積放植物(非吸收)質(zhì)量粉狀、手術(shù)衣/單、植入物(可吸收)長度管路(直徑不變)管路(直徑不變)體積水、液體液路靜脈輸注器，液袋表1SIP選擇舉例選擇SIP的依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品表面積放植物(非吸收)質(zhì)量粉狀、手術(shù)衣/單、植入物(可吸收)長度管路(直徑不變)管路(直徑不變)體積水、液體液路靜脈輸注器，液袋校正因子校正因子定義：用于對活菌計(jì)數(shù)或滅菌前活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行修正的數(shù)值，以補(bǔ)償產(chǎn)品上無法完全洗脫的微生物，以便計(jì)算出生物負(fù)載估計(jì)值。校正因子反復(fù)洗脫方法實(shí)驗(yàn)步驟1取樣品1件或sip，投入一定量的無菌洗脫液中(A)。2樣品的處理采用旋渦混臺(tái)器(2800次／min)，振蕩2min。3注皿：取處理洗脫液A2ml，分別注入兩個(gè)無菌平皿中，每平皿1ml。4再洗脫:將樣品從洗脫液A中取出瀝干，移入另一定量的無菌洗脫液中(B)。5再處理:將B洗脫液置旋渦混臺(tái)器(2800次／min)振蕩2min。6再注皿:取B洗脫液2ml，分別注入兩個(gè)無菌平皿內(nèi)，每平皿lml。注：當(dāng)微生物數(shù)少時(shí),從B洗脫液開始，即可用無菌濾膜過濾后直接放培養(yǎng)基中培養(yǎng)。7如此反復(fù)洗脫4次．即A、B、C和D，直至洗脫累積量(初始污染菌)不再增加，最后瀝干樣品，將其平鋪于無菌平皿中(E)。然后將熔化并冷至45～48℃的NA培養(yǎng)基，分別注入A～E各平皿每皿15ml。8待凝固后，放置在規(guī)定的培養(yǎng)條件下(30～35℃，48h～82h)培養(yǎng)，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。校正因子=1/0.3825=2.61

編號平皿均數(shù)×稀釋倍數(shù)瓊脂覆蓋總數(shù)回收率％洗脫1洗脫2洗脫3洗脫4平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均180010003001008220836.23260080020005160537.3837006002002002170241.13平均38.25校正因