生物技術(shù)制藥重點(diǎn)及名詞解釋

生物技術(shù)制藥

第一章緒論

★生物技術(shù)與生物技術(shù)藥物的概念

生物技術(shù)藥物的分類

+按用途分類：治療藥物、預(yù)防藥物、作為診斷藥物（免疫診斷試劑、酶診斷試劑、器官功能診斷藥物、放

射性核素診斷藥物、診斷用單克隆抗體（McAb）、診斷用DNA芯片）

+按作用類型分類：細(xì)胞因子類藥物、激素類藥物、酶與輔酶類藥物、疫苗、單克隆抗體藥物、反義核酸

藥物、RNA干擾（RNAi）藥物、基因治療藥物

+按生化特性分類：多肽類藥物、蛋白質(zhì)類藥物、核酸類藥物、聚乙二醇（PEG）化多肽或蛋白質(zhì)藥物

★生物技術(shù)藥物的特性

+理化性質(zhì)特性：相對分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差

+藥理學(xué)作用特性：活性與作用機(jī)制明確、作用針對性強(qiáng)、毒性低、體內(nèi)半衰期短、有種屬特異性、

可產(chǎn)生免疫原性

+生產(chǎn)制備特性：藥物分子在原料中的含量低、原料液中長存在降解目標(biāo)產(chǎn)物的雜質(zhì)、制備工藝條件

溫和、分離純化困難、產(chǎn)品易受有害物質(zhì)污染

+質(zhì)量控制特性：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的特殊性、制造項(xiàng)下的特殊規(guī)定、檢定項(xiàng)下的特殊規(guī)定（原液、半成品

及成品檢定等等）

第二章基因工程制藥

蛋白類藥物的特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)確證不完全性、具有種屬特異性、多功能性、免疫原性

臨床前安全性評價(jià)的特殊性：蛋白類藥物安全性擔(dān)憂的性質(zhì)和來源；受試物的純度；相關(guān)動(dòng)物的選擇；給藥劑量的選

擇；免疫原性；遺傳毒性和致癌性（一般不進(jìn)行常規(guī)的遺傳毒性實(shí)驗(yàn)）；藥代動(dòng)力學(xué)

真核細(xì)胞表達(dá)制品的安全性問題：生產(chǎn)細(xì)胞DNA殘留的影響、生產(chǎn)用血清的影響

基因工程藥物穩(wěn)定性研究的相關(guān)問題：藥物濃度、溫度、濕度和水分、氧、光照、pH

基因工程藥物的缺陷：生物利用度低，半衰期短；異體蛋白具有免疫原性

基因工程菌的修飾改造方法：構(gòu)建突變體、構(gòu)建融合蛋白、PEG修飾（降低免疫原性、增加水溶性、延長力僅）

基因工程制藥基本環(huán)節(jié)

?上游階段：制備目的基因—構(gòu)建重組質(zhì)粒f構(gòu)建工程細(xì)胞

?下游階段：培養(yǎng)工程細(xì)胞f分離純化產(chǎn)物f除菌一半成品、成品檢定一包裝

基本工具：目的基因、各種酶（切割酶、連接酶、修飾酶等）、載體、宿主細(xì)胞

>酶切結(jié)果：5,粘性末端、3'粘性末端、平頭末端

>1U核酸內(nèi)切酶的酶活性:指在最佳反應(yīng)條件下反應(yīng)1小時(shí)，完全水解1mg標(biāo)準(zhǔn)DNA所需的酶量

>影響限制性內(nèi)切酶反應(yīng)的因素：

?DNA樣品的純度：

?DNA的甲基化程度：核酸限制性內(nèi)切酶不能夠切割甲基化的核昔酸序列。在基因克隆中要使用甲基化

酶缺陷型細(xì)菌菌株制備質(zhì)粒DNAo

?酶切反應(yīng)的溫度

?DNA的分子結(jié)構(gòu)

?反應(yīng)緩沖液組成

?反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體積等

>工具酶

+核酸限制性內(nèi)切酶：識(shí)別、水解外源的雙鏈DNA分子上特定的核苜酸序列。主要存在于原核微生物中。

?同裂酶：指來源不同，識(shí)別序列相同的酶；進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生相同的末端

?同尾酶：來源不同，識(shí)別序列不同，但產(chǎn)生相同的粘性末端

DNA甲基化酶:具有宿主專一性，對宿主自身DNA上特定核苗酸進(jìn)行甲基化修飾，避免被自身限制性內(nèi)

切酶水解

+DNA連接酶

?T4噬菌體連接酶：連接雙鏈DNA切口，或帶粘性末端或平頭末端的DNA片段

?大腸桿菌DNA連接酶：連接雙鏈DNA切口，或帶粘性末端的DNA片，不能連接帶平頭末端的DNA

片段

+聚合酶：以DNA或RNA為模板，將核苗酸連續(xù)加至3'-OH末端，合成方向?yàn)?'-3'。DNA聚合

酶、RNA聚合酶

?大腸桿菌DNA聚合酶I:5'f3'DNA聚合酶活性；5'f3DNA外切酶活性；3,->5,DNA外切酶活

性；RNAH酶活性

?Klenow酶：不具備5，-*3'DNA外切酶活性

?T4噬菌體DNA聚合酶：不具備5'f3，DNA外切酶活性。外切酶活性比Klenow酶強(qiáng)200倍，對單

鏈DNA作用強(qiáng)于雙鏈DNA

?T7噬菌體DNA聚合酶：不具備5'f3'DNA外切酶活性

,ToqDNA聚合酶

?反轉(zhuǎn)錄酶：催化以RNA或DNA為模板，合成DNA;具有RNAH酶的活性

?末端脫氧核昔酸轉(zhuǎn)移酶：催化dNTP沿5'f3'聚合，逐個(gè)加于線性DNA分子的3'末端；不需要模板

載體：(vector)來源于質(zhì)粒、噬菌體或病毒的DNA分子，可供插入或克隆目的基因或DNA,并具有運(yùn)載

外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞的能力。

+質(zhì)粒載體：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA);開環(huán)DNA(ocDNA);線狀DNA(IDNA)

?質(zhì)粒的三個(gè)重要性質(zhì)：遺傳傳遞的能力；遺傳交換的能力；不相容性

?用于克隆的質(zhì)粒的三個(gè)要素：復(fù)制子、選擇標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)

?常用質(zhì)粒載體：克隆載體、表達(dá)載體、突變載體、報(bào)告載體

+入噬菌體載體：插入型載體、置換載體

?來源于噬菌體DNA,因可以插入較大DNA片段，常用于構(gòu)建基因組文庫和cDNA文庫。

目的基因的常用制備方法

+化學(xué)合成法：前提：基因的DNA的序列已知。小于lOObp的片段：直接合成，最常用固相亞磷酸三酯

法。大片段目的基因：小片段粘接法、大片段酶促法

+PCR法：前提：已知待擴(kuò)增目的基因或DNA片段兩側(cè)的序列，根據(jù)該序列化學(xué)合成聚合反應(yīng)必需的雙

引物。

+基因文庫法：鳥槍法：適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離

+cDNA文庫法(與mRNA互補(bǔ)的DNA)并非所有的mRNA分子都具有polyA結(jié)構(gòu)；僅限于克隆蛋白質(zhì)編

碼基因；mRNA含量少且打/2短，對酶和堿極為敏感，分離純化困難

第一鏈：mRNA模板，引物(polyT),逆轉(zhuǎn)錄酶，dNTPs

第二鏈：自身引導(dǎo)法：取得的雙鏈CDNA5'端會(huì)有幾對堿基缺失(NaOH,煮沸；Klenow酶，dNTPs;

S1內(nèi)切酶)

引導(dǎo)合成法：獲得的cDNA能保持完整的5'端序列(TdT,Dctp;NaOH;退火；Klenow酶，

dNTPs)

?基因文庫的完備性：指在構(gòu)建的基因文庫中任一基因存在的概率，它與基因文庫最低所含克隆數(shù)N之

間的關(guān)系可用下式表示：N=ln(l-P)/ln(l-f),?=完備性，f=克隆片段的平均大小/生物基因組的大小

?雙酶切產(chǎn)生的粘性末端，最常用，可以確保連接方向的正確性

?影響連接效率的因素：連接方式；目的基因與載體的濃度比例摩爾數(shù)比大于1；連接溫度、時(shí)間、酶的

活性、反應(yīng)緩沖體系

重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞

+導(dǎo)入大腸桿菌：CaCI2法；轉(zhuǎn)染法

+導(dǎo)入酵母：電轉(zhuǎn)化法；化學(xué)轉(zhuǎn)化法；原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法

+導(dǎo)入鏈霉菌：原生質(zhì)轉(zhuǎn)化法；電穿孔法

+重組DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞：顯微注射法；DEAE葡聚糖轉(zhuǎn)染法；DNA-磷酸鈣轉(zhuǎn)染法；陽性脂質(zhì)體介

導(dǎo)法；電穿孔法；細(xì)胞融合法；病毒感染法

>重組子的篩選與鑒定

+遺傳標(biāo)記篩選法：抗生素抗性篩選法；?；パa(bǔ)篩選法（藍(lán)白斑篩選——載體含有LacZa基因，X-gal培養(yǎng)

基，成功導(dǎo)入的菌落顯示為藍(lán)斑）;營養(yǎng)缺陷型篩選法；噬菌斑篩選法

+核酸分子雜交法：菌落原位雜交法；DNA印跡法；RNA印跡法

+限制性內(nèi)切酶圖譜法：瓊脂糖凝膠電泳鑒定各片段分子量，含有目的基因的為陽性克隆

+DNA序列測定法

+目的基因表達(dá)產(chǎn)物測定法

原核細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)及選擇

+大腸桿菌（首選，遺傳背景研究清楚；適合大規(guī)模生產(chǎn)（成本低，周期短，效率高，操作簡單）、芽抱桿菌、

鏈霉菌等

+缺點(diǎn)：缺乏翻譯后修飾系統(tǒng)；容易以包涵體形式存在；外源蛋白容易被宿主酶系統(tǒng)水解

★外源基因表達(dá)的調(diào)控原件:復(fù)制子、抽壬（表達(dá)效率的關(guān)鍵因素）和終止壬、核蟒結(jié)合位息（即SD序

列及SD序列到起始密碼子AUG的距離）、識(shí)別翻譯后修飾信號(hào)

+用于原核表達(dá)的載體必須具備的條件：具有復(fù)制子、靈活的克隆位點(diǎn)和方便的選擇標(biāo)記、很強(qiáng)的啟

動(dòng)子、阻遏子（一般有）、強(qiáng)的終止子，所產(chǎn)生的mRNA應(yīng)具有翻譯起始信號(hào)（起始密碼子AUG以及

SD序列）

★外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)方式

+胞內(nèi)表達(dá)：

非融合蛋白表達(dá)：蛋白質(zhì)接近天然狀態(tài)，易被降解，易形成包涵體。有原核多肽基因

融合蛋白表達(dá)：表達(dá)效率高；產(chǎn)物穩(wěn)定；可以切除原核多肽，獲得天然外源蛋白

十分泌表達(dá)：有信號(hào)肽基因，形成周質(zhì)表達(dá)或細(xì)胞外表達(dá)

★外源蛋白表達(dá)效率的影響因素

+外源基因密碼子：大腸桿菌具有偏好密碼子和稀有密碼子，外源基因應(yīng)盡量設(shè)計(jì)成為大腸桿菌的偏

好密碼子

+mRNA的結(jié)構(gòu)：改變一級結(jié)構(gòu)；降低5'端二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；調(diào)控3,端非翻譯區(qū)二級結(jié)構(gòu)

+表達(dá)載體的選擇：表達(dá)方式；強(qiáng)的復(fù)制子（拷貝數(shù)高）；強(qiáng)的啟動(dòng)子（轉(zhuǎn)錄效率高）；高效率的核糖體結(jié)

合位點(diǎn)；強(qiáng)的終止子（提高mRNA穩(wěn)定性）；適應(yīng)范圍廣；穩(wěn)定性高；產(chǎn)物易純化。

+外源蛋白的穩(wěn)定性：采用融合蛋白形式表達(dá)；采用蛋白酶缺陷的突變菌株

真核細(xì)胞表達(dá)的特點(diǎn)及選擇

>常用的真核表達(dá)系統(tǒng)：酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌和酵母表達(dá)系統(tǒng)的比較

大腸桿菌巴斯德畢赤酵母

載體原核載體穿梭載體

調(diào)控序列原核原核和真核

表達(dá)形式包涵體、融合蛋白、分泌分泌

翻譯后修飾基本無有

生產(chǎn)方式發(fā)酵，操作簡單、經(jīng)濟(jì)發(fā)酵，操作較簡單、較經(jīng)濟(jì)：

★酵母表達(dá)體系的影響因素

+外源基因的結(jié)構(gòu)

人外源基因5'端非翻譯區(qū)的序列和長度影響mRNA的翻譯效率

人起始密碼子兩側(cè)若容易形成RNA二級結(jié)構(gòu)，將阻止翻譯進(jìn)行

人富含A-T序列導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄提前終止

人密碼子的偏好性

人高度復(fù)雜的胱氨酸結(jié)構(gòu)基序影響表達(dá)效率

+表達(dá)形式及信號(hào)肽的選擇：無信號(hào)肽常胞內(nèi)表達(dá)；有信號(hào)肽，胞外分泌型表達(dá)

+啟動(dòng)子：多數(shù)畢赤酵母采用乙醇氧化酶AOX1、AOX2啟動(dòng)子

+轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)越高，表達(dá)水平也越高

+誘導(dǎo)條件：甲醇誘導(dǎo)的濃度、時(shí)間以及溫度的選擇

+外源蛋白的降解：采用酶缺陷型宿主、加入底物蛋白或調(diào)節(jié)pH值抑制蛋白酶活性，提高外源蛋白

的穩(wěn)定性。

>哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

+表達(dá)載體：病毒載體（腺病毒、腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒等）；質(zhì)粒載體

+表達(dá)方式：瞬時(shí)表達(dá)、穩(wěn)定表達(dá)、誘導(dǎo)表達(dá)

>基因重組蛋白的主要分離技術(shù)：離心、沉淀（等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法）、膜分離、雙水相萃取

>基因重組蛋白的主要純化技術(shù)：離子交換層析、親和層析、凝膠過濾層析、反相色譜和疏水色譜

>選擇分離純化方法的依據(jù)

+根據(jù)表達(dá)形式選擇

?分泌型：沉淀和超濾

?周質(zhì)表達(dá)：溶菌酶處理+滲透壓休克

?胞內(nèi)可溶表達(dá)：親和層析或離子交換層析

?胞內(nèi)不溶表達(dá)（包涵體）：易與雜蛋白分開，但需要復(fù)性形成有活性的蛋白質(zhì)。

+根據(jù)分離單元之間的銜接選擇

?先采用低分辨、分離規(guī)模大的方法，后采用高分辨的方法，最后采用分離規(guī)模小、速度慢的方法。合

理選擇色譜分離次序

+根據(jù)分離純化工藝的要求選擇

?具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和較高的安全性；盡量較少組成工藝步驟；所用時(shí)間盡可能短；工藝和技

術(shù)必須高效

★基因工程藥物的質(zhì)量控制與小分子藥物質(zhì)量控制相比，不同的方面

+Mr遠(yuǎn)大于小分子化學(xué)物質(zhì)，致使適用于小分子藥物的鑒別方法無法用于基因工程藥物。如質(zhì)譜

+基因工程藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，常需多種檢測方法

+兩者雜質(zhì)性質(zhì)差別較大。小分子藥物雜質(zhì)主要來源于合成中原料殘留、合成副產(chǎn)物和純化中溶劑殘留；

基因工程藥物多為宿主蛋白殘留和宿主基因殘留，其檢測一般都用專用的試劑盒。

+藥物定量方面，基因工程藥物一般采用生化反應(yīng)的方式

★基因工程藥物的質(zhì)量控制

1、蛋白質(zhì)含量的測定

+紫外吸收光譜：在280nm有最大吸收值。快速，無破壞性。不是嚴(yán)格定量，核酸可引起強(qiáng)干擾作用。

+BCA法：堿性條件與Cu2+絡(luò)合同時(shí)將Cu2+還原成Cu+（雙縮麻反應(yīng)），再與二辛可寧酸形成紫色復(fù)

合物，在562nm有最大吸收值。需短時(shí)間lOmin內(nèi)完成

+Lowry法：堿性條件蛋白質(zhì)與銅形成復(fù)合物可還原磷鋁酸-磷鴇酸試劑，產(chǎn)生深藍(lán)色。特點(diǎn)：靈敏，

準(zhǔn)確度高；操作步驟多，繁瑣；影響因素多（鹽酸胭、尿素、EDTA等）

+考馬斯亮藍(lán)法：靈敏，操作簡單，重復(fù)性好；抗干擾能力弱

+SDS-凝膠染色與掃描分析法

2、蛋白質(zhì)純度的測定:電泳（SDS）、質(zhì)譜法、色譜法、末端氨基酸分析法

3、蛋白質(zhì)分子量的測定：SDS、凝膠色譜、質(zhì)譜法

4、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定

5、蛋白質(zhì)序列分析

+N末端氨基酸序列分析：鑒定蛋白質(zhì)的種類；C末端分析：判斷表達(dá)、純化過程中有無加工

6、蛋白質(zhì)二硫鍵分析

7、蛋白質(zhì)活性的測定

8、免疫測定法

9、內(nèi)毒素分析、宿主蛋白和核酸殘留分析

基因工程藥物的實(shí)例：干擾素（IFN）、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（CMCSF）、人白細(xì)胞介素-20L-2）、

胰島素、人生長激素（hGH）

第三章劭揚(yáng)細(xì)胞工程制藥

動(dòng)物細(xì)胞的體外培養(yǎng)

★體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的形態(tài):貼壁依賴性細(xì)胞，非貼壁依賴性細(xì)胞，兼性貼壁細(xì)胞

?貼壁依賴性細(xì)胞：成纖維樣細(xì)胞型（主要來源于中胚層組織）；上皮樣細(xì)胞型（主要來源于外胚層和內(nèi)胚層

組織）

?非貼壁依賴性細(xì)胞：又叫懸浮細(xì)胞，一般呈圓球形。主要來源于血液、淋巴組織、雜交瘤細(xì)胞

?兼性貼壁細(xì)胞：如CHO細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞

動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)

1）細(xì)胞的分裂周期長，一般為12~48h（Gl-S-G2fM）

2）細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì)，并有接觸抑制現(xiàn)象

3）正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的

4）動(dòng)物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感（如滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等的變化耐受力很弱）

5）動(dòng)物細(xì)胞對培養(yǎng)基的要求高（需要12種必需氨基酸、8種以上的維生素、多種無機(jī)鹽和微量元素、作為

主要碳源的葡萄糖,以及多種細(xì)胞生長因子和貼附因子,而且不同種類要求又有變化。）

6）動(dòng)物細(xì)胞對蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同

培養(yǎng)條件要求高、成本貴，產(chǎn)量低;多半是分泌在胞外的,收集純化方便，得到了較完善的翻譯后修

飾

★動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的條件

（一）環(huán)境條件：直接接觸的器材、防止污染（顯著地污染標(biāo)志:pH值迅速改變，細(xì)胞外形模糊，甚至

出現(xiàn)細(xì)胞集落）、水質(zhì)、曲（大多是72-7.4）、滲透壓、溫度、通氧量、基本營養(yǎng)物質(zhì)

（二）營養(yǎng)要求：水、碳源、氮源、維生素、激素、無機(jī)鹽等

?碳源不能為無機(jī)物，大多只能利用葡萄糖

?氮源不能為無機(jī)物，主要利用各種氨基酸

?在多數(shù)情況下，需要添加5%-20%的小牛血清，或適量動(dòng)物胚胎浸出液。

培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基，合成培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基

?天然培養(yǎng)基：主要見于早期階段，來源：血漿凝塊、淋巴液、血清（最常用有效）、羊水、腹水等。分

維持液（低或不含牛血清）和生長液（5%-20%牛血清）

?合成培養(yǎng)基：主要成分：糖、氨基酸、核昔酸前體、維生素、激素、緩沖體系、無機(jī)鹽等

?無血清培養(yǎng)基

①提高了細(xì)胞培養(yǎng)的可重復(fù)性，避免了由于血清批之間差異的影響；

②減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險(xiǎn)；

③供應(yīng)充足、穩(wěn)定；

④細(xì)胞產(chǎn)品容易純化；

⑤避免了血清中某些因素對有些細(xì)胞的毒性；

⑥減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析

血清的作用：提供各種生長因子和激素，貼附因子和伸展因子，可識(shí)別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋

白，必須的脂肪酸和微量元素

★其他常用溶液:平衡鹽溶液；培養(yǎng)基PH調(diào)整液；細(xì)胞消化液（胰蛋白酶，EDTA）;抗生素溶液

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)和方法★

★動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方法：原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、克隆培養(yǎng)

?細(xì)胞的原代培養(yǎng):組織塊培養(yǎng)法、單層細(xì)胞培養(yǎng)法。取動(dòng)物組織塊一剪碎一分散處理（加胰蛋白酶或膠

原蛋白和EDTA）-洗滌純化f計(jì)數(shù)稀釋一培養(yǎng)

?細(xì)胞的傳代培養(yǎng):離心或酶消化法收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)后，以適當(dāng)濃度接種到新的培養(yǎng)環(huán)境中

.單克隆培養(yǎng)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)：細(xì)胞分離（離心法；蛋白酶消化法）；細(xì)胞計(jì)數(shù)；細(xì)胞傳代；細(xì)胞的凍存（慢凍,液

氮,-196度）和復(fù)蘇（快融,投入37℃水浴融化）

?凍存主要步驟：活性好的細(xì)胞，加保護(hù)劑（DMSO等）混合；做好標(biāo)記（細(xì)胞種類、日期等）；逐漸降低溫

度，最后放至液氮中；降溫梯度要合適，總的原則是慢凍

生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞

人原代細(xì)胞：費(fèi)錢費(fèi)力，少用

人傳代細(xì)胞系：安全，特點(diǎn)：2n核型，貼壁依賴，接觸抑制，有限傳代（50代）

人轉(zhuǎn)化細(xì)胞系：自發(fā)轉(zhuǎn)化或人為轉(zhuǎn)化，失去了正常細(xì)胞的特點(diǎn)，可=無限增殖傳代，適宜大規(guī)模工業(yè)培

養(yǎng)

人工程細(xì)胞系：融合細(xì)胞系（仙臺(tái)病毒融合法、聚乙二醇融合法、電融合法）；基因工程細(xì)胞系

?病毒載體：牛痘病毒。腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，桿狀病毒載體-昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)

?基因工程細(xì)胞主要的篩選系統(tǒng)，

①HAT（次黃瞟吟、氨基喋吟、胸腺喀嚏）選擇系統(tǒng)，篩選tk\"gn爐的轉(zhuǎn)化細(xì)胞

②GPT（HAT、黃喋吟、甘氨酸、霉酚酸）選擇系統(tǒng)，篩選產(chǎn)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞

③G418（GeneMcin）選擇系統(tǒng)，篩選Med的轉(zhuǎn)化細(xì)胞

④MTX選擇系統(tǒng)，篩選力?獷的轉(zhuǎn)化細(xì)胞

細(xì)胞庫的建立：原始細(xì)胞庫生產(chǎn)用細(xì)胞庫（MWCR,又稱工作細(xì)胞庫，主細(xì)胞庫一生產(chǎn)細(xì)胞庫）

常用生產(chǎn)用動(dòng)物細(xì)胞:BHK-21,C127細(xì)胞,CHO-K1,COS細(xì)胞,MDCK細(xì)胞，WI-38,MRC-5,Namalwa,

Sf-9,Vero,SP2/0-Agl4

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)

★動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)方法

?懸浮培養(yǎng):適用于非貼壁依賴細(xì)胞或兼性貼壁細(xì)胞

優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，培養(yǎng)條件均一，傳質(zhì)傳氧較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)，可以借鑒細(xì)菌培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)。

缺點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)密度較低。

?微載體培養(yǎng):用于培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。充分發(fā)揮懸浮培養(yǎng)的一切優(yōu)點(diǎn)。理想的微載體應(yīng)具備：生物相容性、

無毒性、表面惰性、比重適當(dāng)（1。30~L045g/ml）s粒徑均一,在60~250卬1之間（溶脹后）、光

學(xué)透明、柔軟、耐高壓滅菌溫度、反復(fù)多次使用、制備簡單、原料充分

?多孔載體培養(yǎng):可用于懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞。細(xì)胞在網(wǎng)格內(nèi)，能避免受到剪切力的損傷，因此培養(yǎng)體

系可以提高攪拌速度和通氣量。多孔載體的一般條件：具備生物相容性、機(jī)械穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性

?微囊化培養(yǎng):避免剪切力對細(xì)胞造成的損傷；獲得較高細(xì)胞密度108個(gè)/ml；利于純化；可采用多

種生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)

?中空纖維解：把細(xì)胞接種在中空纖維的外腔，利用中空纖維模擬毛細(xì)血管提供營養(yǎng)。

理想的動(dòng)物生物反應(yīng)器必須具備的基本要求：

①體系中的各種材料，對細(xì)胞必須無毒性。

②

③生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)的傳質(zhì)、傳熱和混合性能好。

④密封性能良好，可避免一切外來微生物的污染。

⑤培養(yǎng)環(huán)境多種物化參數(shù)可自動(dòng)檢測和調(diào)節(jié)控制，控制的精確度高，且能保持環(huán)境質(zhì)量的均一。

⑥可長期連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)，尤其對于動(dòng)物細(xì)胞而言。

⑦容器加工制造時(shí)要求內(nèi)面光滑，無死角。

⑧拆裝、連接和清潔方便，耐高壓蒸汽消毒便于操作消毒。

設(shè)備成本盡可能低。

★動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器

+規(guī)模：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：＜20L;中試規(guī)模：20-100L;生產(chǎn)規(guī)模：＞100L

+類型：攪拌罐式；氣升式；中空纖維式；透析袋或膜式；固定或流化床式；一次性搖袋式細(xì)胞培養(yǎng)

+主要操作方式:

?分批式操作：能夠控制的參數(shù)只有PH、溫度和通氣量

?補(bǔ)料-分批（或流加式）操作：不斷地向系統(tǒng)中補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分

?半連續(xù)式操作

?連續(xù)式操作和灌流式操作：后者取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞仍保留在反應(yīng)器內(nèi)，而連

續(xù)式培養(yǎng)則同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

基本原理及步驟：外源目的基因的制備一外源目的基因有效導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞f選擇獲得攜有目的基

因的細(xì)胞f選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動(dòng)物f轉(zhuǎn)基因細(xì)胞胚胎發(fā)育及鑒定f篩選所得的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物

品系

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作方法

+經(jīng)典的技術(shù)路線：基因顯微注射法,最常用、成功的方法，成功率低

+整合胚胎移植的技術(shù)路線：受精卵的成活率高達(dá)90%以上，外源基因整合率高，提高受孕率

+核移植（克?。┑募夹g(shù)路線：體細(xì)胞核移植；核移植前導(dǎo)入目的基因。

+整合卵受精的技術(shù)路線：卵母細(xì)胞導(dǎo)入目的基因后再與精子受精。

+具體方法:基因顯微注射法、反轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細(xì)胞方法，精子載體導(dǎo)入法、基因打靶

法、人工酵母染色體法★

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究出現(xiàn)的問題：制作轉(zhuǎn)基因動(dòng)物效率低；外源基因在宿主基因組中的行為難以控制；轉(zhuǎn)基因表

達(dá)水平低

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器：（bioreactor）目的片段在器官或組織中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。如乳腺、膀胱、血液等

動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)品制造實(shí)例：類淋巴細(xì)胞干擾素、組織型纖溶酶原激活劑、單鏈尿性纖溶酶原激活劑-尿激酶

原、促紅細(xì)胞生成素（EP。）、凝血因子VIII、乙型肝炎疫苗

第皿章抗體工程制藥

概述

抗體工程應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域：研究，以免疫轉(zhuǎn)印法檢測特定抗原；醫(yī)療，以毒素連結(jié)抗體攻擊病變女田胞；

檢驗(yàn)，以ELISA偵測特定病原體；

多克隆抗體（polyclonalantibody,pAb）簡稱多抗。如:免疫血清（含多種特異性抗體）

實(shí)際意義：預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清（抗破傷風(fēng)）；胎盤球蛋白（抗病毒感染）。副作

用:今超敏反應(yīng)。臨床診斷，如：肥達(dá)氏反應(yīng)（傷寒、副傷寒）。缺點(diǎn)：特異性差

單克隆抗體（monoclonalantibody,mAb）簡稱單抗★

優(yōu)勢：特異性高:只識(shí)別某一個(gè)特定的抗原決定簇。均一性好:其H鏈、L鏈及V區(qū)獨(dú)特性其完全一致，

所得到的抗體結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性狀完全一致。

雜交瘤細(xì)胞：既能產(chǎn)生單一抗體，又能無限增殖

抗體分子的結(jié)構(gòu)和功能★

＞基本結(jié)構(gòu)：四肽鏈結(jié)構(gòu)

A重鏈（H鏈）和輕鏈（L闔天然Ig一分一壬史，…重鏈圓類，…輕鏈同型

重鏈可分為五類：U、Y、。、5、￡鏈IgM、IgG、IgA、IgD、IgE;輕鏈可分為K、入型。

A可變區(qū)（V區(qū)）、恒定區(qū)（C區(qū)）和錢鏈區(qū)（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶）

?VL、VH區(qū)各有3個(gè)超變區(qū)（也稱互補(bǔ)決定區(qū)，CDR1-3）,共同組成IQ的抗原識(shí)別部位,形成與抗原決

定簇互補(bǔ)的表位?？勺儏^(qū)中的其它部分變化較小，稱為骨架區(qū)（FR）

?C區(qū)決定1g分子的異種抗原性，主要發(fā)揮抗體分子的效應(yīng)功能。

＞抗體分子的價(jià)位：指抗體分子能結(jié)合的抗原表位數(shù)的多少。VH和VL的CDR區(qū)共同構(gòu)成抗原的結(jié)合位點(diǎn)，

因此一個(gè)單體免疫球蛋白分子有兩個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)，故習(xí)慣將單體抗體分子稱為2價(jià)分子。

單克隆抗體的制備

產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞的三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)：B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的特性、細(xì)胞融合技術(shù)、雜交瘤細(xì)胞的篩選

單克隆抗體制備的基本過程（理解）：抗體與動(dòng)物免疫,提取能夠產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞與小鼠的骨髓瘤

細(xì)胞在滅活的仙臺(tái)病毒/聚乙二醇的誘導(dǎo)下融合，并在特定的選擇培養(yǎng)基下箍選出雜交瘤細(xì)胞。在體外條件下做大規(guī)模

培養(yǎng)/注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。再提取出大量的單克隆抗體，最后進(jìn)行純化。

＞抗原和免疫：抗原的制備（通常和佐劑混合，增強(qiáng)免疫應(yīng)答）、免疫動(dòng)物（體內(nèi)/體外免疫方法；動(dòng)物的

選擇：一般采用與骨髓瘤供體細(xì)胞同一品系的動(dòng)物）

＞細(xì)胞的融合和雜交瘤細(xì)胞的篩選

人細(xì)胞的融合：制備脾細(xì)胞懸液:最后一次免疫后三天，1X108個(gè)；制備骨髓瘤細(xì)胞懸液:對數(shù)生長期

細(xì)胞，（2?3）x1（y個(gè)；融合:40-50%PEG（MW4000）,37℃,5min

人★HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞

HAT培養(yǎng)基篩選原理：H（次黃瞟吟）；A（氨基蝶吟）；T（胸腺喀嚏）。骨髓瘤細(xì)胞不具備HGPRT和TK,

B淋巴細(xì)胞壽命短。影響細(xì)胞DNA的合成：H促進(jìn)了次黃瞟聆鳥喋吟磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）

途徑；T促進(jìn)了胸腺嚓咤激酶（體）途徑；內(nèi)源性途徑（谷氨酰胺、鳥核昔酸單磷酸，二氫葉酸還

原酶途徑）被A（葉酸的拮抗物）阻斷

步驟：融合后細(xì)胞fHAT培養(yǎng)基fHT培養(yǎng)基f正常培養(yǎng)基

人雜交瘤細(xì)胞的檢測和克隆

抗體的檢測：僅少數(shù)雜交瘤細(xì)胞可以分泌預(yù)期抗體。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、間接免疫熒光法、放射

免疫測定法、流式細(xì)胞儀法

雜交瘤細(xì)胞的克?。河邢尴♂尫ā④洯傊囵B(yǎng)法。經(jīng)過3-4輪克隆化，才能達(dá)到100%孔內(nèi)均為陽性

細(xì)胞克隆。耗時(shí)長（3-4月）

人雜交瘤細(xì)胞的凍存：凍存原始細(xì)胞

＞單克隆抗體的大量制備：體內(nèi)接種法（皮下接種、腹腔接種）；體外培養(yǎng)法

＞單克隆抗體的鑒定和檢測

人單克隆抗體的檢測

?McAb特異性檢測：檢測有無抗原抗體結(jié)合；檢測有無交叉反應(yīng)。ELISA、間接免疫熒光法

?McAb類和亞類的鑒定：類的鑒定一般在雜交瘤的克隆化過程中可以確定（兔抗鼠IgG或IgM作

為二抗用于ELISA）亞類的確定需要用標(biāo)準(zhǔn)抗亞類血清系統(tǒng)做雙擴(kuò)散電泳或夾心ELISAo

?其他鑒定：中和活性鑒定；識(shí)別抗原表位鑒定；親和力鑒定；效價(jià)（滴度鑒定）；純度鑒定

人雜交瘤細(xì)胞的鑒定：主要是對雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析

抗體治療疾病的機(jī)制：中和作用、導(dǎo)向作用、拮抗作用、ADCC、CDsAonist

抗體在疾病治療中的應(yīng)用

?作為診斷試劑：病原微生物抗原抗體的檢測、腫瘤抗原的檢測、免疫細(xì)胞及其亞群的檢測、激素測定、

細(xì)胞因子的測定

?作為治療藥物：抗腫瘤、抗感染、抗器官移植排斥反應(yīng)、治療自身免疫性疾病和變態(tài)反應(yīng)性疾病

制約抗體藥物迅速發(fā)展的主要障礙：免疫原性；分子量大

基因工程抗體

＞單克隆抗體的人源化

人嵌合抗體：人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。特點(diǎn)：具

備親本鼠源單抗相同的特異性和親和力；對人的免疫原性大大減少；可以接上不同亞類的人C區(qū)基因，

改變抗體功能；半衰期長；工程細(xì)胞系比人-人雜交瘤細(xì)胞穩(wěn)定；由于鼠VL和VH區(qū)的存在，仍有較

強(qiáng)免疫原性

人改形（型）抗體：把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改形

抗體，也就是人源化抗體。，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，

＞小分子抗體

人包括FobsFvs單鏈抗體及單域抗體等

?Fab片段：由重鏈V區(qū)及CH1功能區(qū)與完整的輕鏈以二硫鍵連接而成。1/3

?Fv片段：由VH與VL非共價(jià)結(jié)合而成。在VH與VL的適當(dāng)區(qū)域個(gè)引入一個(gè)半胱氨酸，形成鏈內(nèi)二

硫鍵，成為二疏蕤1德定的―Mdisu用de-stablizedFv,dsF\^\1/6

?單鏈抗體（ScFv）:在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，即單鏈抗體。常

月的連接肽懸（GGGGS13

?單域抗體：即為VH或VL,約為完整分子的1/12。它只由一個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域

抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

人優(yōu)點(diǎn)：可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低；分子小，穿透力強(qiáng)；不含F(xiàn)c,沒有Fc帶來的效應(yīng)；在體

內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免

疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

＞多功能化抗體

人雙功能抗體（bsAb）:又稱雙特異性抗體，兩個(gè)針對不同抗原決定簇的ScFv以共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵連接在

一起。

人融合抗體：Fc抗體融合蛋白；Fv抗體融合蛋白

人細(xì)胞內(nèi)抗體：指在細(xì)胞內(nèi)合成并作用于細(xì)胞內(nèi)組分的抗體，也稱內(nèi)抗體。在scFv的C端/N端插入其

他靶向信號(hào)

人最小識(shí)別單位：約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個(gè)CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性

噬菌體抗體工程

噬菌體抗體庫技術(shù)的三個(gè)關(guān)鍵：RT-PCR技術(shù)；噬菌體展示技術(shù)；抗體原核表達(dá)技術(shù)。

★噬菌體抗菌庫技術(shù)的篩選:。固相或液相純化抗原的篩選、全細(xì)胞篩選、用切片組織進(jìn)行篩選

第五章疫苗及其制備技術(shù)

1.活疫苗（livevaccine）選用無毒或弱毒但免疫原性高的菌種,經(jīng)培養(yǎng)、繁殖后制成的?；钜呙缰赀M(jìn)入機(jī)體后，

能繼續(xù)生長繁殖，對機(jī)體呈長時(shí)間刺激，持續(xù)產(chǎn)生抗體。這類菌（疫）苗有卡介菌（預(yù)防結(jié)核病的菌苗）、炭

疽菌苗、牛痘疫苗、狂犬病疫苗、鼠疫菌苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗以及麻疹苗等。

2.死疫苗（killedvaccine）包括滅活疫苗（由完整的病毒或細(xì)菌經(jīng)滅活劑滅活后制成，即要使病原體充分死亡，

喪失感染性或毒性和致病性，又要保留其免疫原性）和亞單位疫苗（將病原體經(jīng)物理或化學(xué)方法處理,除去

無效物質(zhì)，提取其有效抗原部分制備的一類疫苗）

★活疫苗特點(diǎn)★★死疫苗特點(diǎn)★

可在體內(nèi)繁殖?丕能在體內(nèi)繁殖，性質(zhì)穩(wěn)定，安全性JS

有利于制備多價(jià)或多聯(lián)疫苗

系統(tǒng)免疫反應(yīng)和局部免疫反應(yīng)?

?比較安全,—丕發(fā)生全身性副反應(yīng).'…無毒力反祖現(xiàn)象

?免疫力持久，產(chǎn)量高，成本低

?受外界影響小，有利于保存運(yùn)輸

?有毒力增強(qiáng)和反祖危險(xiǎn)

?免疫劑量大，需多次免疫一,…成本高

抗原干擾現(xiàn)象

?只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫

?保存條件苛刻

?通常需要用佐劑或攜帶系統(tǒng)來增強(qiáng)其免疫效果

★活疫苗★死疫苗DNA疫苗

?可在宿主細(xì)胞中復(fù)制?不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制?可刺接抗原在細(xì)胞內(nèi)合成

?毒力降低?無毒，不返強(qiáng)?可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫

?免疫反應(yīng)比較全面?免疫反應(yīng)不太全面?制備技術(shù)容易標(biāo)準(zhǔn)化

?免疫劑量小?不會(huì)傳染給其它個(gè)體

?免疫保護(hù)期長?制備技術(shù)相對容易

重組亞單位疫苗

?將病原的主要保護(hù)性抗原蛋月基因在體外進(jìn)行大量表達(dá)，純化其表達(dá)產(chǎn)物輔以佐劑制成疫苗--亞單位疫苗

?良好的安全性和穩(wěn)定性。利用非疫苗用蛋白作為抗原建立的診斷方法將可以區(qū)分.亞單位疫苴免疫的動(dòng)物和

自然感染的動(dòng)物

?適用于發(fā)病快，病程急，中和抗體能有效控制發(fā)病的傳染病。

?不適于病程發(fā)展緩慢，潛伏期長，感染巨噬細(xì)胞且有ADE效應(yīng)的疾病。

活載體疫苗

?利用低致病力的痘病毒「痛疹病毒一腺病毒或細(xì)菌作為載體，將其它病原的主要保護(hù)性抗原基因插入到載

體基因組的非必需區(qū)形成新的重組體，在同源或兼容性好的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下隨載體的復(fù)制表達(dá)插入的外源基

因。

病毒活載體疫苗的缺點(diǎn)：使用同一載體的不同疫苗不能同時(shí)使用

疫苗制造流程

制造優(yōu)良疫苗的關(guān)鍵：優(yōu)良的菌種；適宜的培養(yǎng)方法；良好生產(chǎn)工藝；嚴(yán)格的檢驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)。

生產(chǎn)工藝流程：菌（毒）種f培養(yǎng)物（培養(yǎng)基、動(dòng)物、禽胚或細(xì)胞等）f收獲抗原（培養(yǎng)液、含毒組織、胚液或細(xì)

胞液等）f配苗f分裝f凍干成活疫苗或滅活后制成滅活疫苗。

毒種的選擇與減毒

★毒株須具備的條件：

1）持有特定的抗原性；

2）有典型的形態(tài)和感染特定組織的特性，并能保持其生物學(xué)特性；

3）易在特定組織中大量繁殖；

4）不產(chǎn)生神經(jīng)毒素或能引起機(jī)體損害的其它毒素；

5）如制備活疫苗，繁殖過程中無恢復(fù)原致病性的現(xiàn)象；

6）未被其它病毒污染。

強(qiáng)毒種的選育：毒力強(qiáng)，純粹，抗原好，穩(wěn)定的菌種,最后凍干保藏。這就是強(qiáng)毒菌種的標(biāo)準(zhǔn)

弱毒種的選育：初選的依據(jù)：生物性狀改變

細(xì)菌滅活疫苗制造：種子f培養(yǎng),滅活和無菌檢查-濃縮提高含菌量f配佐劑-分裝―動(dòng)物安全試驗(yàn)

細(xì)菌弱毒疫苗制造：菌種,培養(yǎng)-濃縮一配苗和凍干,動(dòng)物安全試驗(yàn)

病毒性動(dòng)物組織苗（自家組織滅活苗；病毒弱毒疫苗）、病毒禽胚疫苗、病毒細(xì)胞疫苗、寄生蟲疫苗的制備

★疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量檢定:外觀檢查、pH值檢測、純度、宿主細(xì)胞DNA和蛋白殘留量、無菌檢查、熱原、

抗生素檢測、滅活效果的驗(yàn)證、異常毒性檢查、穩(wěn)定性試驗(yàn)、效力試驗(yàn)（生物效

價(jià)）、佐劑的質(zhì)量評價(jià)、疫苗標(biāo)準(zhǔn)品或參考品的研究

甲型肝炎減毒活疫苗：生產(chǎn)用細(xì)胞（人二倍體細(xì)胞）、細(xì)胞庫管理及檢定、細(xì)胞制備、細(xì)胞培養(yǎng)液、毒種名稱及

來源、種子批的建立、對照細(xì)胞外源因子檢查、病毒接種和培養(yǎng)、病毒提取（檢定合格的病毒收獲物經(jīng)凍融

禾口（或）超聲波處理，并采用適宜濃度的三氯甲烷抽提以提純病毒）、原液（同一細(xì)胞批生產(chǎn)的病毒收獲物經(jīng)提

取病毒后合并為二批原液）

流行性乙型腦炎疫苗：收液作毒力滴定與無菌實(shí)驗(yàn)，加△福爾芻林“NZ2恒溫滅活—3。

滅活劑、保護(hù)劑和免疫佐劑

滅活劑種類

1.甲醛溶液：最常用。①蛋白質(zhì)②核酸烷基化（丕加一生斷劑）作用于氨基、竣基、羥基、筑基

2.烷化劑：乙?；蚁﹣啺罚ˋEI）;二乙烯亞胺（B日）；縮水甘油醛。（使微生物核酸烷基化，滅活后加2%硫

代硫酸鈉中斷灰活）。烷化DNA分子中的鳥瞟聆或腺瞟聆等,妨礙RNA的合成。使病毒完全喪

失感染力,而保留其保護(hù)性抗原。

3.苯酚（石炭酸）：用于防腐，很少用于疫苗研制

4.結(jié)晶紫：蛋白質(zhì)變性（溶于有機(jī)溶劑）；用于診斷抗原的制備：雞白痢抗原

5.小丙酰內(nèi)酷：病毒滅活劑，主要用于狂犬病滅活苗制備

!注意；滅活劑對人有害,有時(shí)對皮膚粘膜有強(qiáng)烈刺激性如:甲醛、6丙酰內(nèi)酯

影響滅活作用的因素：滅活劑特異性；微生物種類和特性；滅活劑濃度；滅活溫度；滅活時(shí)間；滅活PH值；

有機(jī)物存在

保護(hù)劑的用途

①菌種或毒種保存：常用甘油作保護(hù)劑

②細(xì)胞株保存：常用二甲基亞颯（DMS。，一種細(xì)胞的保護(hù)劑）

③疫苗冷凍真空干燥制備時(shí)：加脫脂乳（或二甲基亞颯）和蔗糖等（不同國家有不同配方）

④干擾素類生物活性物質(zhì)的保存：加葡聚糖

保護(hù)劑分類：機(jī)理——滲透劑（DM$。、甘油和蔗糖）非滲透齊ij（聚乙烯毗咯咤酮（PVP）和蛋白質(zhì)）；分子量大小

——高分子物質(zhì)、低分子物質(zhì)；化學(xué)性質(zhì)——復(fù)合物、糖類、鹽類、醇類、酸類和聚合物

疫苗凍干保護(hù)劑組成：營養(yǎng)液；賦形劑；抗氧化劑

常用的凍干保護(hù)劑（穩(wěn)定劑）

＞細(xì)菌的保護(hù)劑

①需氧或兼氧厭氧菌：5%蔗糖脫脂乳或5%蔗糖、1.5%明膠;

②厭氧性細(xì)菌：含1.5%谷氨酸鈉的1%乳糖或10%脫脂乳或7.5%葡糖血清。

注:脫脂乳:20%脫脂奶粉溶于水配制而成。

＞病毒的保護(hù)劑

①5%蔗糖脫脂乳；

②馬立克814活細(xì)胞疫苗：保存液氮.穩(wěn)定劑為10%二甲基亞颯和50%犢牛血清的199液。

注:微生物保護(hù)劑緩沖液的組成比例,不同廠家有不同的配方。

常用的保護(hù)劑：5%蔗糖（乳糖）脫脂乳保護(hù)劑；明膠蔗糖保護(hù)劑；SPGA保護(hù)劑

免疫佐劑：

?氫氧化鋁膠（鋁膠）?油乳佐劑?乳化劑?白油佐劑?蜂膠佐劑?脂質(zhì)體佐劑

?細(xì)胞因子類免疫佐劑（IL-2、IL-4、IL-12、IFN-Y）

?CpGDNA（指含有非甲基化CpG（胞喀嚏鳥瞟吟二核苜酸）基序的脫氧核糖核酸DNA）

?CpGOND（含有非甲基化CpG基序的寡聚脫氧核苦酸）

?基因工程減毒素（霍亂毒素，CT;大腸桿菌不耐熱毒素，LT;破傷風(fēng)類毒素，TT）

?免疫刺激復(fù)合物（ISCOM,抗原：糖昔QuilA:膽固醇=1:1:1）

作用機(jī)理：抗原遞呈；抗原尋的；免疫調(diào)節(jié)

?CpGDNA對多種免疫細(xì)胞有激活作用：引起B(yǎng)細(xì)胞分化，直接激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞，

在IL-12協(xié)同下激活NK細(xì)胞，協(xié)同刺激抗原特異性B細(xì)胞和T細(xì)胞分化

?CpGODN的體內(nèi)效應(yīng)與應(yīng)用：對天然免疫系統(tǒng)的刺激活性（抗感染、抗腫瘤活性）；對特異性免疫反應(yīng)的

調(diào)節(jié)作用一一疫苗佐劑（對蛋白質(zhì)抗原的作用；對DNA疫苗的作用）；過敏性疾病治療

第六章酶工程制藥

概述

酶是一類具有催化活性的生物大分子，包括蛋白質(zhì)和核酸

一般催化劑的特征：1.只能進(jìn)行熱力學(xué)上允許進(jìn)行的反應(yīng)；2.可以縮短化學(xué)反應(yīng)到達(dá)平衡的時(shí)間，而不改變反

應(yīng)的平衡點(diǎn)；3.通過降低活化能加快化學(xué)反應(yīng)速度。

★酶的特點(diǎn):高效性、專一性、反應(yīng)條件溫和、可調(diào)節(jié)性。

酶的分類：六大類，氧化還原酶類（脫氫酶、氧化酶、過氧化物酶、羥化酶以及加氧酶類）、轉(zhuǎn)移酶類、水解酶

類（淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶）、裂解酶類（醛縮酶、水化酶及脫氨酶）、異構(gòu)酶類（消旋酶、順

反異構(gòu)酶）和合成酶類（又稱為連接酶）

酶的來源和生產(chǎn)：直接從動(dòng)植物獲得，即從生物體中分離和提純；化學(xué)合成方法；工業(yè)微生物發(fā)酵

發(fā)酵法產(chǎn)酶的優(yōu)點(diǎn)：微生物種類繁多，制備出的酶種類齊全。微生物繁殖快，生產(chǎn)周期短，酶的產(chǎn)量高，成本

低。微生物具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和應(yīng)變能力，可以通過適應(yīng)、誘導(dǎo)、誘變以及基因工程等方法培育出新的高

產(chǎn)酶的菌株。

研究內(nèi)容：酶的大量生產(chǎn)和分離純化；新穎酶的發(fā)現(xiàn)、研究和應(yīng)用；酶的固定化技術(shù)和固定化酶反應(yīng)器；基因

工程技術(shù)應(yīng)用于酶制劑的生產(chǎn)；酶分子改造與化學(xué)修飾；有機(jī)介質(zhì)中酶的反應(yīng)；酶抑制劑、激活劑

的開發(fā)及應(yīng)用研究；抗體酶、核酸酶的研究；模擬酶、合成酶的研究；酶的定向進(jìn)化研究

酶的分離純化

分離純化遵循蛋白質(zhì)分離純化的一般原則，但又有特殊性：

?低溫：一般1?4℃

?條件溫和：避免極端條件（劇烈攪拌、pH、鹽濃度等）

?加入保護(hù)劑：EDTA、2-筑基乙醇等

?對純化過程進(jìn)行監(jiān)測：不斷檢測酶活力和蛋白濃度

★酶分離純化的步驟:預(yù)處理f初步純化高度純化f濃縮與干燥

＞酶的提取

?來源選擇:含目的多的原料。同時(shí)考慮原料的來源、取材方便經(jīng)濟(jì)等方面因素

?細(xì)胞破碎：機(jī)械法、物理法、化學(xué)法（有機(jī)溶劑、表面活性劑）、生物法（酶解）

?保護(hù)措施：采用緩沖系統(tǒng)；添加保護(hù)劑；抑制水解酶的作用；其他：注意溫度、攪拌、紫外光等的影響

＞酶的抽提：

?目標(biāo)：將目的酶最大限度地溶解出來；保持生物活性。

?原則：相似相溶；使用遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。

?方法：鹽溶液提?。ǔＳ肗aCI溶液）；酸、堿溶液提??；有機(jī)溶劑提取

A沉淀分離：等電點(diǎn)沉淀；鹽析；有機(jī)溶劑沉淀

＞酶的純化

?根據(jù)分子量大小分離：離心、膜分離、凝膠層析等

?根據(jù)電荷性質(zhì)進(jìn)行分離：離子交換、電泳等

?根據(jù)疏水作用進(jìn)行分離：疏水層析、反相色譜等

?根據(jù)親和作用分離：親和層析

酶和細(xì)胞的固定化

游離酶的缺點(diǎn)：酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差（熱、酸堿、有機(jī)溶劑對其有影響）。酶不能回收，無法重復(fù)使用。產(chǎn)物中混雜酶蛋

白，分離純化困難。

★固定化酶:

?優(yōu)點(diǎn)：（1）可提高酶的穩(wěn)定性。（2）酶能回收，易與產(chǎn)物分離，可反復(fù)使用。

?缺點(diǎn)：（1）存在擴(kuò)散限制。適于催化小分子物質(zhì)。（2）酶活性下降。

固定化細(xì)胞：

?優(yōu)越性：（1）降低成本，省去酶的分離純化工作：（2）既可作為單一酶，也可作為復(fù)合酶系完成部分代謝

過程。

?局限性：（1）細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物。（2）細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限

制作用。

固定化酶（細(xì)胞）的制備

★傳統(tǒng)的酶固定化方法:載體結(jié)合法（物理吸附法、離子結(jié)合法、共價(jià)結(jié)合法）交聯(lián)法（常用戊二醛試劑法

包埋法（網(wǎng)格型、微囊型）

吸附法

固定化方法包埋法共價(jià)結(jié)合法交聯(lián)法

物理吸附法離子吸附法

制備難易易易較難難較難

結(jié)合程度弱中等強(qiáng)強(qiáng)強(qiáng)

活力回收高，酶易流失高高低中等

費(fèi)用低低低高中等

底物專一性不變不變不變可變可變

酶固定化的新方法：光偶聯(lián)法；等離子體法；偶合固定化法；無載體固定化酶的新技術(shù)

★固定化酶（細(xì)胞）的性質(zhì)和指標(biāo)

＞固定化酶活力的改變：通常低于天然酶（有例外）

原因：酶的構(gòu)象發(fā)生變化，影響活性中心的氨基酸；空間障礙：形成立體屏蔽；內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與

活性中心的接近受阻；包埋時(shí)，大分子底物不能透過膜

＞固定化酶的穩(wěn)定性：酶的耐熱性提高，對變性劑、抑制劑、pH值、蛋白酶以及操作條件的抵抗力增

加。

可能的原因：固定化增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形。抑制酶的自身降解。固定化

部分阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。

＞固定化酶的最適溫度變化：最適溫度與酶穩(wěn)定性有關(guān)。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有

例外）

＞固定化酶的最適pH變化：帶負(fù)電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏

移。

＞固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km的變化：固定化酶的表觀Km隨載體的帶電性能變化。

＞固定化載體與酶的底物電荷相反時(shí)，固定化酶的表觀Km值降低；相同時(shí)，表觀Km值顯著增加。

＞固定化酶的作用專一性改變：與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導(dǎo)致酶的專一性發(fā)生

改變

＞固定化細(xì)胞的性質(zhì)：有活性升高的現(xiàn)象；穩(wěn)定性的增加；最適溫度和最適pH常保持不變

＞★固定化酶（細(xì)胞）的評價(jià)指標(biāo)：活力、偶聯(lián)率及相對活力、半衰期、熱穩(wěn)定性

?活力回收=（加入酶蛋白活力一上清液酶蛋白活力）/加入酶蛋白活力x100%

?偶聯(lián)率=固定化酶總活力/（加入酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力）XI00%

偶聯(lián)率=［，表明固定化對酶活性影響不明顯；

偶聯(lián)率＜1,表明固定化對降低酶活性；

偶聯(lián)率＞1,可能有細(xì)胞分裂，或從載體中排除影響酶活性的抑制劑

酶傳感器：主要由固定化酶膜和變換器組成

?生物傳感器：醵傳感器（酶電極;熱敏電阻酶傳感器「離子敏場效應(yīng)晶體管酶傳感器,…光紅酸傳感

器）、組織傳感器、微生物傳感器、免疫傳感器

?酶傳感器的應(yīng)用：水質(zhì)監(jiān)測；葡萄糖傳感器和血糖測定儀；肉鮮度傳感器

酶反應(yīng)器★