高中三年級(jí)上學(xué)期生物《動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體的制備和應(yīng)用》教學(xué)課件

動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體一、動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)概述1.概念：使兩個(gè)或多個(gè)動(dòng)物細(xì)胞結(jié)合形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。2.結(jié)果：形成的雜交細(xì)胞具有原來兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的遺傳信息。3.原理：細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性5.意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能

4.誘導(dǎo)融合的常用方法：PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法。6.應(yīng)用：（1）細(xì)胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。相關(guān)信息1.“滅活病毒”中滅活的具體含義是什么？

用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。2.滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理是什么？

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。植物體細(xì)胞雜交動(dòng)物細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合前的處理方法誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法細(xì)胞融合成功的標(biāo)志主要用途意義細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性用果膠酶和纖維素酶去除細(xì)胞壁用胰蛋白酶或膠原蛋白酶使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞電融合法、離心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法再生出細(xì)胞壁細(xì)胞核的融合獲得完整的雜種植株主要用于制造單克隆抗體打破生殖隔離，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育植物新品種突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能動(dòng)物細(xì)胞融合和植物體細(xì)胞雜交的比較二、單克隆抗體的制備1.早期獲得抗體的方法向動(dòng)物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原從動(dòng)物血清中分離所需抗體產(chǎn)量低、純度低、特異性差缺點(diǎn)：2.單克隆抗體(1)概念：化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體(2)制備：理論基礎(chǔ)：每一個(gè)B細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。B淋巴細(xì)胞不能無限增殖

克隆單一的B淋巴細(xì)胞，得到的細(xì)胞群就能分泌出化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強(qiáng)的抗體制備思路：困難：米爾斯坦科勒

由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術(shù)，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)大膽設(shè)想：B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（能產(chǎn)生抗體）（能大量增殖）融合細(xì)胞（既能產(chǎn)生抗體，又能大量增殖）單克隆抗體制備的過程：注射特定的抗原培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞從脾中提取B淋巴細(xì)胞多種骨髓瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合能產(chǎn)生抗體，但不能大量增殖不能產(chǎn)生抗體，但能大量增殖PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法單克隆抗體制備的過程：多種雜交細(xì)胞：未融合的細(xì)胞B-骨、骨-骨、B-B、第一次篩選：用特定的選擇培養(yǎng)基在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會(huì)死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長雜交瘤細(xì)胞：（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）第二次篩選：克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)（可進(jìn)行多次）抗體檢測(cè)呈陽性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞克隆化培養(yǎng)多孔細(xì)胞培養(yǎng)板（能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）單克隆抗體制備的過程：抗體檢測(cè)呈陽性的雜交瘤細(xì)胞（分泌的抗體能與特定抗原結(jié)合）注射到小鼠腹腔內(nèi)體外培養(yǎng)單克隆抗體從細(xì)胞培養(yǎng)液中提取從小鼠腹水中提取（能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞）第一次篩選第二次篩選原因方法結(jié)果誘導(dǎo)融合后得到的細(xì)胞中，除雜交瘤細(xì)胞之外，還有未融合的親本細(xì)胞，也有融合的具有同種核的細(xì)胞由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)第一次篩選之后獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行篩選用96孔板培養(yǎng)，在每一個(gè)孔中盡量只接種一個(gè)雜交瘤細(xì)胞的情況下，進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測(cè)（進(jìn)行多次篩選）篩選獲得雜交瘤細(xì)胞獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞兩次篩選的比較應(yīng)用到的技術(shù)：原理：

細(xì)胞膜具有一定的流動(dòng)性、細(xì)胞增殖多種雜交細(xì)胞及未融合的細(xì)胞誘導(dǎo)

融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選用特定的選擇性培養(yǎng)基第二次篩選足夠數(shù)量的能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體克隆化培養(yǎng)、抗體檢測(cè)（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）（產(chǎn)生抗體）（能無限增殖）從腹腔液中提取從培養(yǎng)液中提取歸納：（可進(jìn)行多次）動(dòng)物細(xì)胞融合、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體的應(yīng)用資料1用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對(duì)胎兒造成不利影響。該方法檢測(cè)的準(zhǔn)確率在90%以上。資料2使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進(jìn)行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還會(huì)對(duì)健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細(xì)胞毒素與能特異性識(shí)別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細(xì)胞毒素)三部分組成，它的作用機(jī)制如下圖所示?？贵w藥物接頭ADC被細(xì)胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細(xì)胞凋亡1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？討論

抗體主要發(fā)揮靶向運(yùn)輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢(shì)？①可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進(jìn)行靶向放療；②一些作用于細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行治療①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測(cè)的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒；②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識(shí)別的靶向作用和細(xì)胞毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點(diǎn)清楚、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)

單克隆抗體能準(zhǔn)確地識(shí)別抗原的細(xì)微差異，與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并且可以大量制備。