《雜交瘤抗體開(kāi)發(fā)過(guò)程中重難點(diǎn)解析及案例分享》

雜交瘤抗體開(kāi)發(fā)過(guò)程中重難點(diǎn)解析及案例分享北京義翹神州科技股份有限公司義翹神州CONTENT單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)概述1雜交瘤技術(shù)開(kāi)發(fā)不同應(yīng)用抗體的技術(shù)難點(diǎn)2抗體開(kāi)發(fā)相關(guān)平臺(tái)介紹3義翹神州單克隆抗體開(kāi)發(fā)技術(shù)概述01義翹神州抗體——生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥創(chuàng)新的重要工具

神經(jīng)生物學(xué)免疫學(xué)研究病毒研究放射免疫微量成分測(cè)定病原體診斷腫瘤研究細(xì)胞治療靶向治療蛋白提純工具探針科研診斷治療

醫(yī)學(xué)檢測(cè)科研型抗體試劑治療性抗體藥物診斷性抗體試劑義翹神州雜交瘤技術(shù)經(jīng)典單克隆抗體制備途徑噬菌體文庫(kù)展示技術(shù)大庫(kù)容量、多種屬單B細(xì)胞克隆技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)、微流控技術(shù)、光導(dǎo)流體技術(shù)單克隆抗體制備技術(shù)抗原抗體義翹神州雜交瘤技術(shù)開(kāi)發(fā)不同應(yīng)用抗體的技術(shù)難點(diǎn)分析02義翹神州雜交瘤技術(shù)流程YYYYYYYYYYYYYYYYYSplenocytesMyelomaHybridomacellsScreeningAmplificationpurification技術(shù)路線(xiàn)成熟，可進(jìn)行多種功能性篩選，成本低、易操作義翹神州抗原設(shè)計(jì)表位差異性構(gòu)象正確性抗原易獲得性1免疫方案高滴度免疫效價(jià)多表位免疫反應(yīng)識(shí)別功能位點(diǎn)2融合篩選高效融合快速精準(zhǔn)篩選鑒別多功能抗體3表達(dá)生產(chǎn)減少外源污染高產(chǎn)能（≥mg級(jí)）高通量4質(zhì)控驗(yàn)證理化檢測(cè)功能驗(yàn)證5雜交瘤平臺(tái)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)義翹神州抗體開(kāi)發(fā)的多樣化需求抗原制備困難的抗體開(kāi)發(fā)指定檢測(cè)功能的抗體開(kāi)發(fā)試劑盒配對(duì)抗體的開(kāi)發(fā)成藥性抗體的開(kāi)發(fā)抗獨(dú)特型抗體的開(kāi)發(fā)義翹神州1.免疫原（重組蛋白）制備困難的抗體開(kāi)發(fā)重組蛋白類(lèi)免疫原多肽DNA/細(xì)胞不同膜蛋白形式凝膠免疫因需制宜，根據(jù)功能需求選擇多樣化免疫原類(lèi)型義翹神州除重組蛋白外，不同形式免疫原比較

免疫原類(lèi)型免疫原優(yōu)勢(shì)免疫原缺點(diǎn)多肽、蛋白片段選擇性避開(kāi)免疫原性差的序列；可同時(shí)選取多個(gè)序列，保證表位的多樣性免疫反應(yīng)弱，需要偶聯(lián)載體；線(xiàn)性表位DNA、細(xì)胞保留蛋白天然構(gòu)象；抗原制備周期短、成本低目的蛋白免疫劑量不能保證；雜蛋白影響大（細(xì)胞免疫）不同形式膜蛋白保留蛋白天然構(gòu)象；免疫劑量相對(duì)明確（VLP形式除外）技術(shù)門(mén)檻高、制備難度大；VLP形式雜蛋白比例高凝膠免疫保證一定的免疫原純度、劑量；成本相對(duì)低操作復(fù)雜；有動(dòng)物死亡風(fēng)險(xiǎn)義翹神州細(xì)胞免疫案例細(xì)胞名稱(chēng)蛋白表達(dá)情況DaudiCD20+CD19+CD45RA+CD10+對(duì)照細(xì)胞1CD20-CD19-CD45RA-CD10dim對(duì)照細(xì)胞2CD20-CD19-CD45RA-CD10dimControl商品化CD45RA抗體細(xì)胞免疫免疫生產(chǎn)的CD45RA抗體義翹神州操作流程：Daudi細(xì)胞，免疫6只小鼠挑選高效價(jià)2只小鼠融合主克隆階段--Daudi

細(xì)胞檢測(cè)陽(yáng)性克隆134株，其中，對(duì)照細(xì)胞檢測(cè)陰性克隆17株2~3次有限稀釋—Daudi(+)&對(duì)照細(xì)胞(-)克隆8株抗體質(zhì)控--CD45RA(+)抗體2株，CD19(+)抗體1株凝膠免疫案例0.1μg/mL包被目的蛋白進(jìn)行ELISA結(jié)合檢測(cè)，8株抗體均有強(qiáng)結(jié)合反應(yīng)?？贵w編號(hào)克隆1克隆2克隆3克隆4克隆5克隆6克隆7克隆8ELISA檢測(cè)OD值1.3902.7612.9322.2392.5262.6092.3752.970義翹神州操作流程：SDS凝膠條免疫5只小鼠重組蛋白檢測(cè)效價(jià)，5只小鼠均效價(jià)合格1只小鼠融合，陽(yáng)性主克隆數(shù)>400選擇10株克隆進(jìn)行有限稀釋獲得陽(yáng)性單克隆8株根據(jù)最終需求選擇合適的免疫原、佐劑、免疫方式動(dòng)物免疫效價(jià)檢測(cè)篩選方式ELISA效價(jià)檢測(cè)為主，輔助功能性檢測(cè)主克隆及亞克隆階段，進(jìn)行相應(yīng)功能介入篩選2.指定功能（FACS、WB、IF/ICC、IHC）的抗體開(kāi)發(fā)功能需求為導(dǎo)向，盡早開(kāi)展應(yīng)用特異性篩選義翹神州FACS應(yīng)用抗體開(kāi)發(fā)案例5株抗體FACS檢測(cè)結(jié)果良好義翹神州操作流程：重組蛋白免疫5只小鼠，均ELISA及FACS效價(jià)合格挑選ELISA高效價(jià)&FACS（+）1只小鼠融合主克隆階段，ELISA&FACS--120株結(jié)合陽(yáng)性,其中FACS陽(yáng)性24株；挑選10株克隆進(jìn)行穩(wěn)定株篩選2~3次有限稀釋?zhuān)珽LISA&FACS--獲得7株FACS雜交瘤陽(yáng)性克??；挑選5株提基因構(gòu)建表達(dá)scFv抗體質(zhì)控--5株scFvFACS檢測(cè)陽(yáng)性IHC應(yīng)用抗體開(kāi)發(fā)案例——診斷原料抗體開(kāi)發(fā)小腸（20×）十二指腸（20×）結(jié)腸（20×）陽(yáng)性組織（部分?jǐn)?shù)據(jù)展示）陽(yáng)性組織（部分?jǐn)?shù)據(jù)展示）平滑?。?0×）前列腺癌（20×）平滑肌瘤（20×）抗體經(jīng)多種組織檢測(cè)合格義翹神州操作流程：多肽免疫5只小鼠，免疫血清進(jìn)行ELISA效價(jià)檢測(cè)和IHC篩選（2個(gè)陽(yáng)性組織、1個(gè)陰性組織）挑選ELISA及IHC均合格的1只小鼠融合主克隆階段，ELISA&IHC（雙組織）-->200株結(jié)合陽(yáng)性,首批73株IHC檢測(cè)；挑選12株合格克隆進(jìn)行穩(wěn)定株篩選2~3次有限稀釋?zhuān)珽LISA&IHC（多組織）--獲得11株ELISA與IHC合格抗體；挑選最優(yōu)的6株克隆放大生產(chǎn)及抗體純化抗體質(zhì)控--1株抗體IHC多組織驗(yàn)證陽(yáng)性，可作為診斷原料；3株抗體滿(mǎn)足科研試劑要求3.試劑盒應(yīng)用抗體開(kāi)發(fā)增加多樣性、保證親和力、關(guān)注特異性抗原選擇：蛋白、多肽、顆?？乖庖叻绞剑鹤魟⒔o藥部位

動(dòng)物品系保留足夠雜交瘤細(xì)胞株篩選方式動(dòng)物免疫：少量、多次效價(jià)檢測(cè)：挑選高表現(xiàn)小鼠

克隆篩選：親和力初篩個(gè)性化免疫方案高通量篩選模式多樣性親和力特異性義翹神州試劑盒抗體開(kāi)發(fā)案例——IL6配對(duì)抗體篩選方法待檢抗體備用抗體（非鼠單抗）特異性小鼠IgG檢測(cè)二抗目標(biāo)蛋白目標(biāo)蛋白待檢抗體備用抗體義翹神州操作流程：重組蛋白免疫5只小鼠，免疫血清進(jìn)行ELISA效價(jià)（低濃度包被）挑選ELISA效價(jià)最好的2只小鼠融合主克隆階段，ELISA（低濃度結(jié)合\配對(duì)）-->200株結(jié)合陽(yáng)性，

挑選配對(duì)效果好的5株；親和力檢測(cè)好的克隆8株進(jìn)行穩(wěn)定株篩選2~3次有限稀釋?zhuān)珽LISA（低濃度結(jié)合\配對(duì)）--獲得11株陽(yáng)性克隆，其中4株與備選單抗配對(duì)效果良好抗體質(zhì)控--一對(duì)抗體成功開(kāi)發(fā)試劑盒產(chǎn)品靈敏度pg級(jí)別，稀釋線(xiàn)性良好，試劑盒回收率>80%試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，靈敏度達(dá)到pg級(jí)別試劑盒抗體回收率>80%試劑盒抗體稀釋線(xiàn)性良好試劑盒抗體開(kāi)發(fā)案例——IL6Sample稀釋倍數(shù)OD450-1OD450-2OD450-3Aver.OD-Blank標(biāo)定含量回收率混合血清-2倍稀釋+0.25ng/mL12.1122.1321.5801.9411.8520.15276%21.4991.4340.8651.2661.1770.19396%40.8410.8850.460.7290.6400.207104%80.4650.4690.2710.4020.3130.19698%160.2840.2730.2020.2530.1640.19598%標(biāo)準(zhǔn)品:(添加ng/mL）OD450-1OD450-2Aver.標(biāo)定含量標(biāo)定含量-Blank回收率混合血清-2倍稀釋00.1060.1090.10750.000

0.020.2890.2920.29050.0170.01785%0.040.4510.4730.4620.0320.03280%0.080.8380.880.8590.0790.07999%義翹神州4.成藥性抗體開(kāi)發(fā)抗原選擇活性蛋白、DNA、顆粒抗原動(dòng)物免疫增加多樣性、保護(hù)天然構(gòu)象雜交瘤融合高效融合方式抗體生產(chǎn)減少動(dòng)物源性污染、穩(wěn)定、高量克隆篩選快速、高效組合篩選活性鑒定理化鑒定、體內(nèi)外功能驗(yàn)證功能活性、親和力、表位多樣性義翹神州成藥性抗體開(kāi)發(fā)案例——Anti-CD47CurrentOpinioninImmunologyVolume24,Issue2,

April2012,Pages225-232義翹神州操作流程：活性重組蛋白免疫10只小鼠挑選高效價(jià)且FACS合格4只小鼠部分脾細(xì)胞融合主克隆階段--264株結(jié)合陽(yáng)性；其中，ELISA競(jìng)爭(zhēng)活性且FACS陽(yáng)性29株2~3次有限稀釋及競(jìng)爭(zhēng)篩選--獲得26株陽(yáng)性克隆抗體質(zhì)控--抗體鑒定26株FACS陽(yáng)性克隆，抗體親和力亞nM級(jí)，其中18株ELISA競(jìng)爭(zhēng)陽(yáng)性抗體功能驗(yàn)證KD(M)Kon(1/Ms)Kdis(1/s)8.78E-114.15E+053.64E-05KD(M)Kon(1/Ms)Kdis(1/s)2.47E-101.97E+054.88E-05KD(M)Kon(1/Ms)Kdis(1/s)2.29E-103.91E+058.94E-0518株抗體具有ELISA競(jìng)爭(zhēng)活性達(dá)ng/mL級(jí)別抗體MM39抗體MM52陽(yáng)性對(duì)照抗體陰性對(duì)照抗體26株抗體FACS檢測(cè)陽(yáng)性抗體親和力達(dá)到亞nM級(jí)別2株抗體不引起紅細(xì)胞凝集義翹神州5.抗獨(dú)特型抗體（Anti-IDAb.）開(kāi)發(fā)抗體藥Anti-ID抗體靶標(biāo)蛋白非競(jìng)爭(zhēng)型Anti-ID抗體——檢測(cè)總抗體藥靶標(biāo)蛋白抗體藥Anti-ID抗體Anti-ID抗體抗體藥靶標(biāo)蛋白競(jìng)爭(zhēng)型Anti-ID抗體——檢測(cè)游離抗體藥和部分結(jié)合抗體藥義翹神州抗獨(dú)特型抗體開(kāi)發(fā)要點(diǎn)免疫反應(yīng)免疫原的選擇提高CDR區(qū)的免疫反應(yīng)片段抗體的整體反應(yīng)融合篩選與人IgG的交叉檢測(cè)ELISA競(jìng)爭(zhēng)分型檢測(cè)義翹神州抗獨(dú)特型抗體開(kāi)發(fā)案例1靶標(biāo)蛋白A雙特異性抗體藥物靶標(biāo)蛋白B靶標(biāo)蛋白B項(xiàng)目要求：A、B兩個(gè)靶點(diǎn)的Anti-ID抗體各2~10株，包含競(jìng)爭(zhēng)和非競(jìng)爭(zhēng)至少1株；完成抗體配對(duì)義翹神州操作流程：酶切后F(ab′)2免疫10只小鼠，全部達(dá)到融合標(biāo)準(zhǔn)挑選2只高效價(jià)小鼠融合，接種60塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板主克隆階段--全長(zhǎng)抗體藥ELISA陽(yáng)性克隆數(shù)>1500株；挑選人IgG不結(jié)合且A靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型克隆9株，B靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型克隆19株，A\B靶點(diǎn)均非競(jìng)爭(zhēng)型抗體15株2~3次有限稀釋及競(jìng)爭(zhēng)篩選--A靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型克隆9株，B靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型抗體11株；A\B靶點(diǎn)均非競(jìng)爭(zhēng)型抗體15株抗體質(zhì)控及配對(duì)檢測(cè)--A靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型抗體4株，B靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型抗體8株，A\B靶點(diǎn)均非競(jìng)爭(zhēng)型抗體14株；完成兩靶點(diǎn)抗體配對(duì)，配對(duì)抗體靈敏度到達(dá)pg級(jí)別配對(duì)結(jié)果展示——檢測(cè)低限0.09~0.2ng/mL，樣品檢測(cè)回收率可達(dá)90%~110%樣品稀釋劑稀釋0.1%血清基質(zhì)稀釋1%血清基質(zhì)稀釋10%血清基質(zhì)稀釋靶標(biāo)蛋白量ng/mL靶標(biāo)蛋白量ng/mL義翹神州靶標(biāo)蛋白量ng/mL靶標(biāo)蛋白量ng/mL抗獨(dú)特型抗體開(kāi)發(fā)案例2項(xiàng)目要求：2~10株Anti-ID抗體，其中競(jìng)爭(zhēng)型和非競(jìng)爭(zhēng)型抗體各至少1株；篩選純化抗體親和力EC50值在0.1~100.0ng/mL范圍靶標(biāo)蛋白AscFv治療性抗體義翹神州操作流程：使用三種佐劑免疫15只小鼠，9只達(dá)到融合標(biāo)準(zhǔn)挑選2只高效價(jià)小鼠融合，接種60塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板主克隆階段--抗體藥ELISA陽(yáng)性克隆數(shù)>600株；挑選人IgG不結(jié)合且A靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型克隆7株，

非競(jìng)爭(zhēng)型克隆4株2~3次有限稀釋及競(jìng)爭(zhēng)篩選--A靶點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)型克隆4株，非競(jìng)爭(zhēng)型抗體2株抗體質(zhì)控及配對(duì)檢測(cè)--競(jìng)爭(zhēng)型抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制率>80%，非競(jìng)爭(zhēng)型抗體競(jìng)爭(zhēng)抑制率<10%；EC50值在20~100ng/mL范圍內(nèi)純化后抗體數(shù)據(jù)展示——競(jìng)爭(zhēng)型、非競(jìng)爭(zhēng)型抗體分型明確，EC50值20~100ng/mL競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)方法2nd：SA-HRP-0.007μg/mL

Coating:（TargetProtein）-1μg/mLSample1:

(1μg/mL)-100μL+Sample2:

(1μg/mL)-100μLOD450-1PI%BlankscFv-His-B-0.25μg/mL0.9268/Clone#10.151683.6%Clone#20.116987.4%Clone#30.84648.7%Clone#40.84768.5%Clone#50.126586.4%Clone#60.168781.8%義翹神州EC50=22.41ng/mLEC50=24.59ng/mLEC50