《子宮頸癌PD-L1免疫組織化學(xué)檢測規(guī)范》（征求意見稿）

T/CRHAXXX-202X子宮頸癌PD-L1免疫組織化學(xué)檢測規(guī)范本文件規(guī)定了子宮頸癌PD-L1免疫組織化學(xué)檢測的適用人群、免疫組織化學(xué)檢測、質(zhì)控要求、報(bào)告模板。本文件適用于各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)病理醫(yī)務(wù)人員進(jìn)行子宮頸癌PD-L1免疫組織化學(xué)檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T40352人類組織樣本采集與處理CNAS-CL02-A007：2018醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在組織病理學(xué)檢查領(lǐng)域的應(yīng)用說明3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1子宮頸癌cervicalcancer發(fā)生在子宮頸部位的惡性上皮性腫瘤，通常與人乳頭瘤病毒（HPV）感染相關(guān)。3.2程序性死亡配體-1programmeddeath-Ligand1，PD-L1PD-L1是程序性死亡配體-1，是一種膜表面蛋白，通常在癌細(xì)胞和某些免疫細(xì)胞上表達(dá)。通過與免疫細(xì)胞上的PD-1受體結(jié)合，PD-L1可以抑制免疫細(xì)胞的活性，從而幫助腫瘤細(xì)胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊。3.3免疫檢查點(diǎn)抑制劑immunecheckpointinhibitors一類靶向免疫檢查點(diǎn)的藥物，通過解除免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫抑制，從而增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊力。PD-1/PD-L1抑制劑就是其中一類免疫檢查點(diǎn)抑制劑。3.4免疫組織化學(xué)immunohistochemistry，IHC一種檢測組織中特定抗原的方法，通過使用抗原特異性的抗體和適當(dāng)?shù)娜旧椒ǎ梢栽诮M織切片上定位和可視化特定蛋白質(zhì)。3.5伴隨診斷adiointdiagnostic2T/CRHAXXX-202X利用特定的檢測方法，如分子技術(shù)、免疫組化染色等檢測與特定藥物相關(guān)聯(lián)的基因改變及蛋白表達(dá)情況，來提供給患者對(duì)某種特定治療方法的反應(yīng)信息，有助于確定患者是否可以從該藥物中獲益。3.6伴隨診斷試劑adiointdiagnosticreagent藥物在臨床使用時(shí)提示患者使用相應(yīng)藥物安全有效性的體外診斷試劑，醫(yī)生可根據(jù)伴隨診斷試劑所給出的結(jié)果進(jìn)行臨床治療方案的調(diào)整及預(yù)后評(píng)價(jià)3.7綜合陽性評(píng)分combinedpositivescore，CPS評(píng)估PD-L1表達(dá)水平的一種評(píng)分方法，結(jié)合了PD-L1陽性腫瘤細(xì)胞、相關(guān)免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞（詳見附錄）的數(shù)量，用于預(yù)測患者對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑治療的反應(yīng)。3.8一抗primaryantibody特異性結(jié)合到目標(biāo)抗原的抗體，常用于免疫組織化學(xué)、免疫熒光等實(shí)驗(yàn)。3.9二抗secondaryantibody結(jié)合到一抗的抗體，通常帶有熒光或酶標(biāo)記，用于檢測和放大信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)抗原的可視化。3.10克隆號(hào)clonenumber用來標(biāo)示單克隆抗體的抗原表位的,標(biāo)示篩選這個(gè)抗體來源的細(xì)胞株。4縮略語下列縮略語適用于本文件。H&E染色法——蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin-eosinStaining)ORR——客觀緩解率（Objectiveresponserate）MICs——細(xì)胞質(zhì)染色的單核炎癥細(xì)胞（Cytoplasmicstainingofmononuclearinflammatorycells）NMPA——國家藥品監(jiān)督管理局（NationalMedicalProductsAdministration）FDA——美國食品藥品監(jiān)督管理局（U.S.FoodandDrugAdministration）NCCN——美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NationalComprehensiveCancerNetwork）FFPE——福爾馬林固定的石蠟包埋樣本（FormalinFixationandParaffinEmbedding）5子宮頸癌免疫監(jiān)查點(diǎn)抑制劑的適用人群PD-L1檢測的人群以藥物獲批的適應(yīng)癥目標(biāo)人群為主。如，帕博利珠單抗pembrolizumab(Keytruda)聯(lián)合化療，聯(lián)合或不聯(lián)合貝伐單抗，用于治療持續(xù)性、復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性子宮頸癌；賽帕利單抗適用于接受過一線或以上含鉑標(biāo)準(zhǔn)化療后進(jìn)展的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移、PD-L1表達(dá)陽性（CPS≥1）子宮頸癌。注：雖然臨床用藥前對(duì)PD-L1檢測的適用人群有一定規(guī)定，但是在病理臨床實(shí)踐中，有時(shí)不能判斷或不能及時(shí)知曉其用藥選擇，因此，建議在兼顧檢測成本、臨床送檢需求與實(shí)際操作的前提下，盡量為所有可能具有免疫治療機(jī)會(huì)的子宮頸癌患者提供PD-L1免疫組化檢測結(jié)果。3T/CRHAXXX-202X6子宮頸癌PD-L1免疫組織化學(xué)檢測6.1樣本類型首選手術(shù)切除標(biāo)本，切除標(biāo)本不可及的情況下，可選擇活檢的組織學(xué)標(biāo)本，由于子宮頸癌PD-L1的表達(dá)采用CPS評(píng)分，免疫細(xì)胞的計(jì)數(shù)相對(duì)復(fù)雜，不推薦使用細(xì)胞包埋蠟塊進(jìn)行檢測。6.2樣本前處理要求6.2.1樣本選擇及處理新鮮活檢或手術(shù)樣本組織，樣本處理應(yīng)符合GB/T40352的要求，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范-病理學(xué)分冊(cè)》取材、固定、脫水、石蠟包埋并制成蠟塊。6.2.2組織切片操作方法組織切片厚度建議4μm。將切片黏附在聚賴氨酸載玻片或帶正電荷的玻片上，在空氣中略干燥后，60°C～65°C烤片2小時(shí)，2～8℃或25±2℃存放待用。為了防止抗原降解，準(zhǔn)備好的組織切片應(yīng)盡快使用。如需保存，2～8℃條件下保存的切片，需在16周內(nèi)完成檢測；25±2℃條件下保存的切片，應(yīng)在4周內(nèi)完成檢測。注：研究顯示3個(gè)月的樣本PD-L1陽性率為31.2%；≥3個(gè)月至1年的陽性率為32.8%，1～3年為29.1%3年為13.3%(n=83)，盡量選擇3年以內(nèi)的蠟塊進(jìn)行檢測。對(duì)于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者，如無法取得近期的組織進(jìn)行檢測，可考慮三年內(nèi)的樣本。6.3免疫組化檢測6.4子宮頸癌PD-L1表達(dá)的判讀標(biāo)準(zhǔn)6.4.1判讀要求應(yīng)由具有資質(zhì)的病理醫(yī)生使用光學(xué)顯微鏡對(duì)PD-L1染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)估。在檢查用于PD-L1染色的患者標(biāo)本之前，檢查用于評(píng)估染色質(zhì)量的對(duì)照非常重要。建議選擇3張連續(xù)組織切片（H&E、PD-L1染色和空白對(duì)照染色）進(jìn)行PD-L1染色評(píng)估。首先對(duì)H&E切片進(jìn)行樣本可使用性評(píng)估,如通過，則剩余2個(gè)連續(xù)切片的IHC染色是可接受的。6.4.2樣本可用性評(píng)估確認(rèn)至少有100個(gè)可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，建議使用H&E染色切片評(píng)估標(biāo)本是否足夠可用。應(yīng)對(duì)標(biāo)本同一石蠟塊的連續(xù)切片進(jìn)行PD-L1免疫組化和H&E染色。PD-L1染色切片中必須存在至少100個(gè)可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞，以確保標(biāo)本足夠用于PD-L1評(píng)估。如可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞少于100個(gè)的樣本，建議選用同一蠟塊的深切切片或另一蠟塊的組織切片，確保有足夠數(shù)量的可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞用于PD-L1免疫組化染色評(píng)估。6.4.3子宮頸癌PD-L1染色強(qiáng)度，陽性和陰性對(duì)照組織陽性及陰性對(duì)照可采用組織樣本或細(xì)胞系對(duì)照切片。1）使用組織樣本評(píng)估整體染色強(qiáng)度，如圖1所示：4T/CRHAXXX-202X1+/弱陽只在40×物鏡下可見清晰細(xì)胞膜染色2+/中陽4-5×物鏡下可見，10-20×物鏡下可見清晰細(xì)胞膜染色3+/強(qiáng)陽4-5×物鏡下可見清晰細(xì)胞膜染色ABACDC圖1PD-L1（克隆號(hào)：WD160）在子宮頸癌樣本中的染色強(qiáng)度評(píng)估，其中：A:無腫瘤細(xì)胞染色（20X放大）；B：1+腫瘤細(xì)胞PD-L1染色（20X放大）；C：2+腫瘤細(xì)胞PD-L1染色（20X放大，如箭頭所示D：3+腫瘤細(xì)胞PD-L1染色（20X放大，如箭頭所示）。2）使用細(xì)胞系對(duì)照切片評(píng)估，如圖2、圖3所示：檢查PD-L1IHC22C3pharmDx細(xì)胞系對(duì)照切片，確定試劑是否正常發(fā)揮作用。每個(gè)切片含有PD-L1表達(dá)呈陽性和陰性的細(xì)胞團(tuán)塊切片。評(píng)估陽性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度。如果細(xì)胞系對(duì)照切片的染色不理想，則患者標(biāo)本的所有結(jié)果均應(yīng)視為無效。對(duì)于PD-L1陽性細(xì)胞團(tuán)塊，以下染色可接受（見圖2）：①≥70%的細(xì)胞呈細(xì)胞膜染色；②平均染色強(qiáng)度≥2+；③非特異性染色強(qiáng)度<1+。圖2PD-L1（克隆號(hào)22C3）陽性對(duì)照細(xì)胞團(tuán)塊對(duì)于PD-L1陰性細(xì)胞團(tuán)塊，以下染色可接受（見圖3）：①多數(shù)細(xì)胞應(yīng)顯示無染色。注：細(xì)胞膜明顯染色的細(xì)胞≤10個(gè)即視為可接受；②非特異5T/CRHAXXX-202X圖3PD-L1（克隆號(hào)22C3）陰性對(duì)照細(xì)胞團(tuán)塊FFPE的扁桃體可作為對(duì)照標(biāo)本。PD-L1染色的扁桃體隱窩上皮細(xì)胞膜表現(xiàn)為強(qiáng)染色；生發(fā)中心的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為中等到弱的膜染色（見圖4），血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞和表面鱗狀上皮細(xì)胞無染色。FFPE的胎盤組織可作為對(duì)照樣本。PD-L1染色的胎盤組織滋養(yǎng)層細(xì)胞膜：細(xì)胞膜呈很強(qiáng)的一致性染色；胎盤間質(zhì)組織和脈管系統(tǒng)沒有染色（見圖5）。圖4PD-L1（克隆號(hào)：WD160）染色的扁桃體（20X放大）間質(zhì)細(xì)胞無染間質(zhì)細(xì)胞無染圖5PD-L1（克隆號(hào)：WD160）染色的胎盤組織（20X放大）4）空白對(duì)照抗體試劑6T/CRHAXXX-202X檢查空白對(duì)照抗體試劑染色的切片，確定可能干擾PD-L1染色判讀、使標(biāo)本無法評(píng)估的非特異性背景染色。無染色表明對(duì)照合格。檢查空白對(duì)照抗體試劑染色的患者標(biāo)本，確定是否存在可能干擾PD-L1染色切片判讀的任何非特異性染色。6.4.4子宮頸癌PD-L1判讀方法子宮頸癌中PD-L1蛋白的表達(dá)水平采用CPS來確定，即PD-L1陽性細(xì)胞與可計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞的比例乘以100，其中納入評(píng)分的PD-L1陽性細(xì)1）任何強(qiáng)度下具有完整或部分細(xì)胞膜染色的腫瘤，但僅有細(xì)胞質(zhì)染色的腫瘤細(xì)胞不納入評(píng)2）任何強(qiáng)度下位于腫瘤巢內(nèi)或相鄰的基質(zhì)內(nèi)直接與腫瘤反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞膜染色和/或細(xì)胞質(zhì)染色的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。其他的CPS評(píng)分公式納入/排除的標(biāo)準(zhǔn)見附錄C表1和表2。3）腫瘤異質(zhì)性樣本的判讀見附錄D。6.4.5子宮頸癌PD-L1檢測規(guī)范化報(bào)告模板子宮頸癌PD-L1檢測報(bào)告除患者基本信息，還應(yīng)包括樣本類型、試劑克隆號(hào)，質(zhì)控結(jié)果、檢查測結(jié)果等。見附錄E7子宮頸癌PD-L1檢測的質(zhì)控要求為保障子宮頸癌PD-L1檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理應(yīng)符合CNAS-CL02-A007：2018的要求。7.1室內(nèi)質(zhì)控室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)滿足以下要求：1）確保檢驗(yàn)試劑和方法的正確性，采用的試劑符合NMPA及相關(guān)法規(guī)要求，且在用于臨床診斷前，對(duì)試劑和檢測方法進(jìn)行充分的驗(yàn)證，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。室內(nèi)質(zhì)控應(yīng)設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。2）可采用已知PD-L1表達(dá)結(jié)果的樣本（最好兼具高表達(dá)（CPS≥10）、中表達(dá)（CPS1-10）、及低表達(dá)CPS＜1）。3）陽性對(duì)照樣本可以是扁桃體（隱窩上皮細(xì)胞膜表現(xiàn)為強(qiáng)染色，生發(fā)中心的巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為中等到弱的胞膜染色，血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維細(xì)胞和表面鱗狀上皮細(xì)胞無染色。）和胎盤組織（滋養(yǎng)層細(xì)胞膜很強(qiáng)的一致性染色，胎盤間質(zhì)組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞無染色）。4）應(yīng)進(jìn)行PD-L1抗體不同克隆號(hào)和染色平臺(tái)的比對(duì)，對(duì)不同操作人員進(jìn)行定期抽檢。規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，可溯源，同時(shí)對(duì)操作和判讀人員進(jìn)行定期培訓(xùn)和考核。7.2室間質(zhì)評(píng)進(jìn)行子宮頸癌PD-L1檢測的實(shí)驗(yàn)室每年應(yīng)至少參加2次室間質(zhì)評(píng)，既可以通過參加國內(nèi)外權(quán)威機(jī)構(gòu)舉辦的室間質(zhì)評(píng)活動(dòng)完成，也可以通過與其他獲得相應(yīng)資格認(rèn)可和使用相同方法學(xué)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行比對(duì)完成。7T/CRHAXXX-202X（資料性）免疫組織化學(xué)染色操作流程（手工染色）A.1檢驗(yàn)所需儀器、設(shè)備a)移液器；b)免疫組化油筆；c)電磁爐或高壓鍋（也可使用自動(dòng)抗原修復(fù)儀）；d)孵箱；f)孵育盒；g)染色架；h)蓋玻片；j)洗瓶。A.2溶液配制PBST磷酸鹽緩沖液（0.01M，0.05%Tween-20，pH7.4）、免疫組化抗原修復(fù)緩沖液以及DAB顯色液的配制參見各產(chǎn)品說明書。A.4檢測步驟將福爾馬林固定石蠟包埋切片于60℃~65℃孵箱中烤片1～2小時(shí)，室溫保存?zhèn)溆?。a)石蠟切片置于新鮮二甲苯中，浸泡10分鐘×2次；b)去除多余的液體后，置無水乙醇中，浸泡3分鐘，1～2次；c)去除多余的液體后，置95%乙醇中，浸泡3分鐘；d)去除多余的液體后，置85%乙醇中，浸泡3分鐘；e)去除多余的液體后，置70%乙醇中，浸泡3分鐘；——推薦使用pH9.0EDTA熱修復(fù)法，水浴可設(shè)置98。C高溫修復(fù)20～30分鐘；——若使用高壓修復(fù)法，建議修復(fù)2～3分鐘（高壓閥門頂起時(shí)開始計(jì)時(shí)），完成修復(fù)后，讓切片自然冷卻至室溫；——用免疫組化油筆將待測組織圈起來，純化水沖洗2次，每次3分鐘。滴適量（約150μL）內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑完全覆蓋組織，室溫孵育10分鐘后，純化8T/CRHAXXX-202X加入1～3滴（50-150ul）PD-L1抗體試劑或空白對(duì)照抗體試劑完全覆蓋組織，室溫孵育30分鐘后，PBST沖洗3次，每次5分鐘。被檢切片依照所用染色系統(tǒng)DAB染色液試劑盒的說明書進(jìn)行孵育，完畢后PBST沖洗3次，每次5分鐘，純化水沖洗2次，每次3分鐘。依照所用試劑說明書進(jìn)行DAB顯色液配制，滴適量配制好的DAB顯色液完全覆蓋組織，依據(jù)顏色變化終止染色，純化水沖洗3次（必要條件下可使用DAB增強(qiáng)液染色）。依照蘇木素廠家說明書操作步驟及建議對(duì)切片進(jìn)行襯染，PBST或依次浸泡梯度酒精70%，85%，95%，100%（1～2次），每次3分鐘；2次二甲苯透明，用中性樹膠對(duì)切片進(jìn)行封片。T/CRHAXXX-202X（資料性）CPS評(píng)分公式納入/排除的標(biāo)準(zhǔn)B.1表1CPS評(píng)分公式分子納入/排除標(biāo)準(zhǔn)-與潰瘍有關(guān)的MICs(包括淋無B.2表2：CPS評(píng)分公式分母納入/排除標(biāo)準(zhǔn)無無T/CRHAXXX-202X（資料性）腫瘤異質(zhì)性樣本的判讀腫瘤異質(zhì)性樣本的判讀，可按照以下方法進(jìn)行：1）較低放大倍數(shù)下（4倍）：目測將腫瘤區(qū)域劃分為細(xì)胞數(shù)量接近的若干部分（見圖C.1）圖C.1低倍鏡下，將腫瘤區(qū)域劃分為細(xì)胞數(shù)量接近的幾部分2)在更高的放大倍數(shù)（20倍）下：觀察每個(gè)區(qū)域和評(píng)估存活的腫瘤細(xì)胞和PD-L1染色細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）的總數(shù)。計(jì)算每個(gè)地區(qū)的綜合陽性分?jǐn)?shù)（見圖C.2）圖C.2在更高的放大倍數(shù)（20倍）下：觀察每個(gè)區(qū)域和評(píng)估存活的腫瘤細(xì)胞和PD-L1染色細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）的總數(shù)。如圖所示四個(gè)區(qū)域有~80、~30、~50和~100個(gè)PD-L1染色細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞）。每個(gè)切片有100個(gè)腫瘤細(xì)胞（包括PD-L1染色細(xì)胞）。每個(gè)區(qū)域的CPS：~CPS80、~CPS30、~CPS50和~CPS100。計(jì)算整個(gè)腫瘤區(qū)域的綜合陽性評(píng)分（CPS）：（80+30+50+100）/4=~CPS65。T/CRHAXXX-202X（資料性）子宮頸癌PD-L1檢測規(guī)范化報(bào)告模板圖子宮頸癌PD-L1檢測報(bào)告模板T/CRHAXXX-202X參考文獻(xiàn)[1]NCCNGuidelinesVersion1.2023CervicalCancer.[2]中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦科腫瘤學(xué)分會(huì)．婦科腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑臨床應(yīng)用指南.協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志，2021:12(6):854—880.[3]PD-L1IHC22C3pharmDxInterpretationManual–CervicalCancer.FDA-approvedforinvitrodiagnosticuse.[4]FDAapprovespembrolizumabcombinationforthefirst-linetreatmentofcervicalcancer.FDA.UpdatedOctober13,2021.AccessedDecember1,2021.https://bit.ly/3G5r6yd[5]ColomboN,DubotC,LorussoD,etal;KEYNOTE-826Investigators.Pembrolizumabforpersistent,recurrent,ormetastaticcervicalcancer.NEnglJMed.2021;385(20):1856-1867.doi:10.1056/NEJMoa2112435[6]/immuno22hybrid/attendee/confcal/show/session/33(79P-EfficacyandSafetyofZimberelimab(GLS-010)MonotherapyinPatientswithRecurrentorMetastaticCervicalCancer:AMulticenter,Open-Label,