常見的線粒體病及診斷

/常見的線粒體病與診斷線粒體病是指線粒體DNA的缺陷所造成的疾病，包括線粒體DNA的重復(fù)、缺失與點(diǎn)突變。線粒體DNA缺陷的遺傳方式非常特殊，是母體對(duì)子代的垂直遺傳，不受子代性別的影響。這是由于受精卵的全部線粒體DNA來自卵細(xì)胞，精子不提供任何線粒體[1]。線粒體DNA缺陷的另一個(gè)特點(diǎn)是不同家系之間、不同個(gè)體之間的臨床表現(xiàn)可以有很大差異。造成這種變異的原因很多，例如細(xì)胞內(nèi)發(fā)生DNA突變的線粒體數(shù)量與正常線粒體數(shù)量的比例。只有當(dāng)含有突變DNA的線粒體超過一定數(shù)量時(shí)，細(xì)胞功能的異常才能得以表達(dá)，這就是“閾值效應(yīng)”。在有絲分裂過程中，子代細(xì)胞內(nèi)正常線粒體與DNA突變線粒體的比例不僅可能與親代細(xì)胞不同，而且兩個(gè)子代細(xì)胞之間也不相同。子代細(xì)胞之間線粒體的差異，造成不同組織的細(xì)胞之間有線粒體成分的差異，因此同一家系的不同個(gè)體，由于各種組織受累程度的不同，其臨床表現(xiàn)就可能有不同[2]。一、常見的線粒體病主要有：線粒體神經(jīng)胃腸腦肌病(MNGIE)由mtDNA上的胸腺嘧啶磷酸酶基因22q13突變引起[3]，通常在20歲之前發(fā)病，發(fā)病時(shí)會(huì)出現(xiàn)反復(fù)發(fā)生異常疼痛、嘔吐、腹瀉，并伴有進(jìn)行性外展神經(jīng)麻痹、癡呆伴腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、感覺喪失與肌肉無力等神經(jīng)癥狀，放射診斷顯示胃腸蠕動(dòng)遲緩、胃張力缺乏、十二指腸膨脹。肌陣攣性癲癇伴肌肉蓬毛樣紅纖維綜合征(MERRF)是以進(jìn)行性肌陣攣伴癲癇、共濟(jì)失調(diào)、肌病、耳聾和輕度癡呆為特征的母系遺傳病?；颊呒±w維紊亂、粗糙，線粒體形態(tài)異常并在骨骼肌細(xì)胞中積累，大多數(shù)有慢性進(jìn)行性癡呆,部分有感覺性聽力喪失、頸肩部脂肪過多。曾懷疑肌陣攣性癲癇伴肌肉蓬毛樣紅纖維綜合征是由于mtDNA的變異引起，但后來的研究表明MERRF是由于線粒體tRNA的8344或8356或8363位堿基的點(diǎn)突變引起的疾病[4]。慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹綜合征(KSS)由于mtDNA大片段缺失所致的一種粒體病，20歲以前發(fā)病，主要表現(xiàn)為眼肌麻痹、色素性視網(wǎng)膜炎,視力喪失，小腦共濟(jì)失調(diào)、癡呆,心肌傳導(dǎo)功能障礙和腦脊液蛋白增多等癥狀。某些病人也有視神經(jīng)萎縮、聽力喪失、心肌病、腎衰、糖尿病、乳酸酸中毒和慢性腹瀉。mtDNA片段的缺失起源于胚胎發(fā)生早期，多發(fā)生于重鏈與輕鏈兩個(gè)起始點(diǎn)之間，有明顯家族史,并且這些病變的嚴(yán)重程度差異很大[5]。線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征(MELAS)多是由mtDNA第3243或3271或3252或3291號(hào)堿基[6]發(fā)生點(diǎn)突變?cè)斐傻囊环N線粒體疾病,其中由第3243號(hào)堿基突變引起的病例最常見，由第3252與3291號(hào)堿基突變引起的病例很少見。該病在2-10歲兒童中多發(fā)，患病兒童多表現(xiàn)為表現(xiàn)為發(fā)育遲緩,反復(fù)性頭痛、反復(fù)癲癇發(fā)作、智力遲鈍、聽力減弱、嘔吐、抽搐、易疲勞等。代謝檢查顯示多數(shù)病例乳酸酸中毒,肌活檢查顯示破碎紅纖維,血管染色顯示琥珀酸脫氫酶強(qiáng)陽性，CT檢查可見枕葉腦軟化,病灶范圍與主要腦血管分布不一致,常見腦萎縮、腦室擴(kuò)大和基底節(jié)鈣化。原發(fā)性線粒體腦病Leigh綜合征是由于nDNA或mtDNA突變所引起的一組以基底節(jié)、小腦、丘腦血管增生和多部位對(duì)稱性海綿狀變性為特征的遺傳病。nDNA突變導(dǎo)致的COX缺陷,mtDNA上ATP酶基因6T8993G和T8993C的突變,亮氨酸t(yī)RNA的A3243G和賴氨酸t(yī)RNA的G8344A的突變都可以引起Leigh綜合征[7]。患病者通常在出生后1-2年內(nèi)出現(xiàn)進(jìn)食困難、生長發(fā)育遲滯和張力低下,隨后出現(xiàn)生長退化、眼外肌麻痹、視神經(jīng)萎縮、癲癇發(fā)作和窒息，一般發(fā)作數(shù)年后死亡，期間會(huì)出現(xiàn)反復(fù)性恢復(fù)和復(fù)發(fā)。MRI發(fā)現(xiàn)下丘腦核團(tuán)、腦干、基底節(jié)、小腦干和腦室周圍有損傷性病灶,之后腦會(huì)出現(xiàn)慢慢萎縮，當(dāng)基底節(jié)到受影響時(shí),MRI和光鏡分析發(fā)現(xiàn)乳酸增加。Leber遺傳性視神經(jīng)病(LHON)是一種主要累與黃斑束纖維,導(dǎo)致視神經(jīng)退性變的線粒體性遺傳病。該病母系遺傳病且傾向于男性發(fā)病，發(fā)病原因主要是由于mtDNA第11778堿基對(duì)發(fā)生突變引起[8]，一般在20-30歲發(fā)病，最初的癥狀表現(xiàn)是視神經(jīng)中心部機(jī)能消失,隨后色覺喪失、失明，且視力很少能恢復(fù),另外還伴有神經(jīng)、心血管與骨骼肌等系統(tǒng)異常。Pearson綜合征是一種由mtDNA缺失或加倍所致一種線粒體疾病。多發(fā)生于嬰兒時(shí)期，主要影響骨髓,表現(xiàn)為各類血細(xì)胞（白細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞）減少性貧血,張力減低、生長停滯、身材矮小等癥狀，患兒多死于骨髓衰竭和反復(fù)輸血并發(fā)癥，而且患兒很少能活過嬰兒期，就算存活也多發(fā)展成KSS綜合征,有乳酸酸中毒、生長落后、胰腺功能障礙、線粒體肌病、進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙等。二、線粒體病的臨床診斷DNA檢測(cè)：線粒體病mtDNA突變主要為點(diǎn)突變和大片段缺失。檢測(cè)mtDNA點(diǎn)突變最常用的方法是聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析,檢測(cè)時(shí)應(yīng)對(duì)所有可能出現(xiàn)的突變進(jìn)行檢測(cè),常見的突變主要有A3243G、T3271C、A8344G、G8363A、T8993C/G、T9176C、A1555G、G13513A。對(duì)mtDNA片段缺失的檢測(cè)通常可采用長片段PCR方法和Southern轉(zhuǎn)膜法。長片段PCR方法是選擇兩對(duì)引物分別擴(kuò)增mtDNA5200216427和1575625739兩個(gè)片段,根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂電泳條帶來判斷有無缺失。對(duì)有片段缺失的樣本,可通過限制性內(nèi)切酶消化,瓊脂電泳,對(duì)缺失的部位進(jìn)行粗略定位。再據(jù)此設(shè)計(jì)出引物,對(duì)含有缺失的部位進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序以明確缺失的確切部位。生化檢測(cè)：線粒體呼吸鏈功能缺陷的生化檢查對(duì)線粒體病基因診斷的選擇具有一定的指導(dǎo)意義。對(duì)于有nDNA突變引起的隱性遺傳病通常會(huì)引起嚴(yán)重的酶復(fù)合物活性下降，而對(duì)于有mtDNA缺陷引起的隱性遺傳病酶復(fù)合物活性可以從正常到一個(gè)或多個(gè)聯(lián)合缺陷等多種情況。聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)可以用來檢測(cè)復(fù)合物的完整性，尤其用于復(fù)合物Ⅴ活性的檢測(cè)。CN能更干凈有效地將復(fù)合物從線粒體內(nèi)膜上分離出來。乳酸和丙酮酸的水平在一定程度上反映了線粒體的功能，因此對(duì)乳酸和丙酮酸進(jìn)行檢測(cè)對(duì)線粒體病的診斷是很有意義的。對(duì)線粒體疾病的診斷一般測(cè)定有氧和無氧情況下運(yùn)動(dòng)前后的乳酸和丙酮酸水平。在患有MERRF綜合征、KSS、Leigh和處于MELAS綜合征急性發(fā)作期的患者的血清和腦脊液中均有乳酸和丙酮酸增高的現(xiàn)象[9]。乳酸和丙酮酸同時(shí)增高或其比值異常，均不能確診為是線粒體病，不排除是其他疾病的可能性，如要確診還需行肌活檢組織中的線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體的測(cè)定、肌后活檢組織病理學(xué)檢查和分子生物學(xué)分析。肌肉活檢：對(duì)某些疑似線粒體病進(jìn)行肌肉活檢是很有必要的,有助于排除其他神經(jīng)肌肉疾病。多數(shù)線粒體病的患者肉膜下會(huì)出現(xiàn)破碎樣紅纖維（RRF）,肌纖維細(xì)胞色素C氧化酶（COX）缺失,血管琥珀酸脫氫酶(SDH)反應(yīng)增強(qiáng)的現(xiàn)象。因此，對(duì)疑似線粒體病的肌肉活檢主要是對(duì)這三種物質(zhì)的檢測(cè)、但也有一部分線粒體病,如Leber遺傳性視神經(jīng)病、Leigh腦病和神經(jīng)源性肌無力、共濟(jì)失調(diào)和視網(wǎng)膜色素變性(NARP)綜合征,其肌肉活檢完全正常或僅表現(xiàn)為肌纖維輕度大小不等。并且,RRF和COX缺失纖維也不是線粒體病特有的病理變化，因此，肌活檢正常并不能排除線粒體病的診斷，還需要借助于其他的診斷方法。參考文獻(xiàn)[1]LarssonNG,ClaytonD.Moleculargeneticaspectsofhumanmitochondrialdisorders.AnnuRevGenetics,1995,29:151[2]SherrattEJ,ThomasAW,AlcoladoJC.MitochondrialDNAdefects:awideningclinicalspectrumofdisorders.ClinSci,1997,92:225.[3]NishinoI,SpinazzolaA,HiranoM.ThymidinephosphorylasegenemutationsinMNGIE,ahumanmitochondrialdisorder.Science,1999,283:6892692.[4]MichelangeloM,LuciaP,MassimilianoF.MERRFsyndromewithoutragged-redfibers:Theneedformoleculardiagnosis.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2007,354(4):1058[5]LaxNZ，CampbellGR，ReeveAK，etal．LossofmyelinassociatdglycoproteininKearns-Sayresyndrome.ArchNeurol,2011．[6]ChomynA,EnriquezJA,MicolVetal.Themitochondrialmyopathyencephalopathy,Iacticacidosisandstroke-likeepisodesyndromeassociatedhumanmitochondrialtRNALeu(UUR)mutationcausesaminoacylationdeficiencyandconcomitantreducedassociationofmRNAwithribosomes.JournalofBiologicalChemistry,2000,275(25):19198[7]WallaceDC,DiseasesofthemtDNA[J].AnnRevBiochem,1992,(61):1175-1212.[8]YanliJ,XiaoyunJ,QingjiongZ.mtDNAhaplogroupdistributioninChinesepatientswithLeber’shereditaryopticneuropathyandG1