3.2基因工程的基本操作程序第2課時(shí)課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

第三章第2節(jié)基因工程的基本操作程序(第二課時(shí)）3、目的基因的獲?。?）從基因文庫中獲取

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（了解）基因組文庫cDNA文庫3、目的基因的獲?。?）從基因文庫中獲取將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。（了解）基因組文庫cDNA文庫怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因呢？

根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如根據(jù)基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA以及基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。3、目的基因的獲取（3）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（常用方法）從基因文庫中獲取并擴(kuò)增目的基因通常采用PCRPCR（polymerasechainreaction）聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。DNA半保留復(fù)制。體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）。對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。原理：操作環(huán)境：目的：優(yōu)點(diǎn)：模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程思考：結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過程，PCR的進(jìn)行需要哪些條件？

在能量的驅(qū)動(dòng)下,解旋酶將DNA雙螺旋的兩條鏈解開，氫鍵斷裂。CGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATACGTATACGGCTAGCCGTA3'5'CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ATP解旋酶（1）解旋：目的基因的篩選與獲取回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制

DNA聚合酶等以解開的每一條母鏈為模板，以游離的四種脫氧核苷酸為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，各自合成與母鏈互補(bǔ)的一條子鏈。CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT（2）合成子鏈：回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATATA3'5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTTACGCAAGCTAGTCATTADNA聚合酶5'3'TATGCATGATCGAGCTT5'3'ATPATPDNA聚合酶作用下形成磷酸二酯鍵子鏈延伸合成的方向？只能從5′－端→3′－端延伸，細(xì)胞內(nèi)有RNA引物結(jié)合到模板3′－端引發(fā)子鏈的延伸回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制（2）合成子鏈：CCGTAGTATACGGCTAGCCGTATACGGCCGTATAGCCGATATCGATCGTATATAA5'ACGCAAGCTAGTCATTATATGCATGATCGAGCTT5'3'TAGCCGTATAGCCGATAT3'5'TTACGCGTATATATA5'3'（3）重新螺旋形成新的DNA分子回顧：體內(nèi)DNA復(fù)制3、目的基因的獲?。?）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因（常用方法）參與的組分

在DNA復(fù)制中的作用打開DNA雙鏈提供DNA復(fù)制的模板合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸體內(nèi)DNA復(fù)制所需的基本條件解旋酶DNA母鏈4種脫氧核苷酸DNA聚合酶思考：DNA體外復(fù)制條件？引物（體外）高溫耐高溫的DNA聚合酶dATP與ATP在結(jié)構(gòu)上有什么區(qū)別？dATP為什么能用作DNA復(fù)制的底物？如圖所示，ATP結(jié)構(gòu)中的五碳糖為核糖，而dATP結(jié)構(gòu)中的五碳糖為脫氧核糖。ATP轉(zhuǎn)移掉兩個(gè)磷酸基團(tuán)后剩下的結(jié)構(gòu)就是腺嘌呤核糖核苷酸，所以ATP是轉(zhuǎn)錄的底物；同理，dATP轉(zhuǎn)移掉兩個(gè)磷酸基團(tuán)后剩下的結(jié)構(gòu)就是腺嘌呤脫氧核糖核苷酸，所以dATP可以用作DNA復(fù)制的底物。在PCR過程中加入的并不是4種脫氧核苷酸，實(shí)際加入的是4種dNTP（即dATP、dGTP、dTTP、dCTP）。這些分子都有3個(gè)磷酸基團(tuán)，磷酸基團(tuán)之間通過特殊的化學(xué)鍵相連。dNTP既可作原料，又能提供能量。3′5′DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端，即子鏈的延伸方向是5′→3′。由于DNA聚合酶不能將單個(gè)的核苷酸鏈連接成鏈，因此子鏈合成需要引物（最初的已有鏈）。DNA聚合酶3′5′模板鏈(4)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因2.目的基因的獲取方法一、第一步：目的基因的篩選與獲取ATCGAATCGGTT

TACCTTAGCCAADNA聚合酶母鏈DNA子鏈DNA引物3′3′5′5′

需要引物原因：DNA復(fù)制時(shí)，DNA聚合酶不能從頭合成子鏈，只能從3’端延伸DNA鏈，所以子鏈延伸的方向都是從5’→3’端引物是一小段能與DNA母鏈的一小段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。（長度通常為20-30個(gè)核苷酸）為DNA聚合酶提供了游離的3’端，使DNA聚合酶從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。3、類型：①自然引物（細(xì)胞內(nèi)）:RNA(主要）②人工引物（PCR）：DNA單鏈或RNA1、定義：2、作用：拓展：引物3、目的基因的獲取3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物23’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2子鏈延伸方向5’3’PCR擴(kuò)增的前提是：

根據(jù)一段已知目的基因的核苷酸序列合成引物

（不需要知道整個(gè)目的基因的堿基序列）

由于DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，?/p>

種引物才能保證DNA的兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增時(shí)至少需要

引物22種微量離心管緩沖液PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行。真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2+。DNA模板四種脫氧核苷酸(dNTP)引物分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物耐高溫的DNA聚合酶目的基因的篩選與獲取一3、目的基因的獲取PCR擴(kuò)增儀）微量離心管緩沖液離心處理后目的基因的篩選與獲取一3、目的基因的獲取緩沖液目的基因的篩選與獲取一3、目的基因的獲取3、目的基因的獲?。?）.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因925075℃3`5`5`3`TaqDNA聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因3、目的基因的獲取905072℃3`5`5`3`（1）.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增過程：第一輪當(dāng)溫度超過_____以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA(1)變性：90℃不需要解旋酶思考：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。905072℃復(fù)性（退火）（1）.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3、獲取目的基因的方法PCR擴(kuò)增過程：3`5`5`3`第一輪當(dāng)溫度下降

到左右時(shí)，

種引物通過

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

堿基互補(bǔ)配對(duì)50℃兩思考2：耐高溫的DNA聚合酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？結(jié)合在引物的3’端當(dāng)溫度上升到____左右時(shí)，溶液中的4種_________在_______________

的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

（1）.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3、獲取目的基因的方法PCR擴(kuò)增過程：905072℃第一輪3`5`5`3`脫氧核苷酸DNA聚合酶72℃(3)延伸：思考1：為什么溫度要上升至72℃？耐高溫的905072℃變性（1）利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3、獲取目的基因的方法PCR擴(kuò)增過程：第一輪結(jié)束3`5`5`3`第二輪DNA

個(gè)，中-長

個(gè)，中-短

個(gè)，短-短

個(gè)，共消耗引物

個(gè)。22002（1）.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3、獲取目的基因的方法PCR擴(kuò)增過程：905072℃復(fù)性第二輪3`5`5`3`5`3`3`5`（1）.利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因3、獲取目的基因的方法PCR擴(kuò)增過程：905072℃延伸第二輪3`5`5`3`5`3`3`5`第二輪結(jié)束DNA

個(gè)，中-長

個(gè)，中-短

個(gè)，短-短

個(gè)，共消耗引物

個(gè)。422063、獲取目的基因的方法905072℃變性第三輪3`5`5`3`5`3`5`3`3`5`3`5`5`3`3`5`3、獲取目的基因的方法905072℃復(fù)性第三輪3`5`5`3`5`3`5`3`3`5`3`5`5`3`3`5`3、獲取目的基因的方法905072℃延伸第三輪3、獲取目的基因的方法PCR擴(kuò)增過程：第三輪結(jié)束3`5`5`3`5`3`5`3`3`5`3`5`5`3`3`5`5`3`3`5`5`3`5`3`3`5`5`3`3`5`3`5`DNA

個(gè)，中-長

個(gè)，中-短

個(gè)，短-短

個(gè)，共消耗引物

個(gè)。8242目的基因14非目的DNA數(shù)目目的DNA數(shù)目循環(huán)次數(shù)1234567246810121400282252114非目的DNA數(shù)目目的DNA數(shù)目循環(huán)次數(shù)1202403624885102261252714114n2n2n-2n思考：PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能從DNA分子中

分離出目的基因？3次1.PCR的結(jié)果

由于一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。即成

形式擴(kuò)增（約為

，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。指數(shù)2n拓展：假設(shè)一個(gè)DNA分子擴(kuò)增n次2、總共需消耗引物1和2共多少個(gè)？引物1、2各消耗多少個(gè)？2n+1－23、含引物的DNA分子多少個(gè)？同時(shí)含有兩種引物的DNA分子多少個(gè)？2n2n－1總結(jié)：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因2n-24、第n代復(fù)制，消耗了______個(gè)引物2n1、非目的DNA數(shù)目:目的DNA數(shù)目:2n2n-2n思考：2.PCR技術(shù)與DNA復(fù)制過程比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原則原料條件不同點(diǎn)解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)（主要在細(xì)胞核內(nèi)）耐高溫的DNA聚合酶解旋酶、DNA聚合酶短時(shí)間內(nèi)形成大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子緩沖液瓊脂糖凝膠電泳

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會(huì)向與它所帶電荷相反的電極移動(dòng)，這個(gè)過程就叫電泳。思考：如何對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定？思考：復(fù)性的過程一定是引物與DNA模板鏈結(jié)合嗎？思考：用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？不能！由于RNA不穩(wěn)定，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行擴(kuò)增。單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈DNA鏈RNA鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNAPCR擴(kuò)增總結(jié)：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因復(fù)性時(shí)引物與DNA模板的結(jié)合是隨機(jī)的，也存在解開的兩條DNA單鏈的結(jié)合，但兩條模板鏈重新結(jié)合的概率較低，原因是：①模板鏈一般比較長，比引物復(fù)雜得多，重新結(jié)合的概率較低。②加入引物的量足夠多，而模板鏈數(shù)量少，引物與模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞機(jī)會(huì)。TaqDNA聚合酶的應(yīng)用

高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的TaqDNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。PCR過程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA單鏈，其長度通常為20－30個(gè)脫氧核苷酸。PCR和細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的不同點(diǎn)？緩沖液需要為PCR反應(yīng)提供的物質(zhì)？DNA模板，四種脫氧核苷酸，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，TaqDNA聚合酶。關(guān)于PCR的幾點(diǎn)說明：總結(jié)：利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(2022·天津一中高二期中)下圖表示利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的部分過程，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似。下列敘述錯(cuò)誤的是A.耐高溫的DNA聚合酶總將游離的脫氧核苷酸連接到3′端B.在第三輪循環(huán)產(chǎn)物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段C.引物之間或引物自身發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，則不能有效擴(kuò)增目的基因D.從理論上推測，第三輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段占3/4√

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述若干次循環(huán)：90℃以上使模板DNA解聚為單鏈→50℃左右下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR反應(yīng)過程的敘述中，不正確的是A.變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)B.復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合依靠堿基