目的基因的篩選與獲取 教學(xué)課件

目的基因的篩選與獲取我國(guó)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉應(yīng)時(shí)而生

1992年，我國(guó)棉鈴蟲(chóng)災(zāi)大爆發(fā)，農(nóng)藥噴灑量增加，棉農(nóng)損失慘重。

1991年，我國(guó)開(kāi)始轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉項(xiàng)目；1993年底，轉(zhuǎn)基因植株培育成功，創(chuàng)造了具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉，打破國(guó)際壟斷。

1990年，美國(guó)利用基因工程技術(shù)，將Bt殺蟲(chóng)基因?qū)朊藁?，獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。截至2010年，我國(guó)棉花主產(chǎn)省抗蟲(chóng)棉種植率超過(guò)95%，全國(guó)累計(jì)推廣種植2100萬(wàn)公頃，新增產(chǎn)值超過(guò)440億元，農(nóng)民增收250億元。殺蟲(chóng)劑的使用下降了80%。問(wèn)題：轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉是怎么獲得的？

培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？Bt基因來(lái)自蘇云金芽孢桿菌(簡(jiǎn)稱Bt),編碼一類具有殺蟲(chóng)活性的毒蛋白，但對(duì)人等哺乳動(dòng)物無(wú)害?；蚬こ膛嘤瓜x(chóng)棉的簡(jiǎn)要流程蘇云金芽孢桿菌獲取抗蟲(chóng)基因抗蟲(chóng)基因與載體連接導(dǎo)入棉花細(xì)胞檢測(cè)與鑒定轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的檢測(cè)與鑒定在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等的基因。目的基因的篩選與獲取第一步目的基因根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。目前被廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌抗蟲(chóng)基因、植物抗病基因（抗病毒、抗細(xì)菌)、人胰島素基因、人干擾素基因等。如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。目的基因的獲取人工合成條件方法基因比較小，核苷酸序列已知化學(xué)合成法目的基因的獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)全稱：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)穆里斯等人于1988年發(fā)明，1993年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。PCR誕生的理論基礎(chǔ)：DNA的半保留復(fù)制。細(xì)胞內(nèi)復(fù)制過(guò)程：解旋-子鏈延伸-復(fù)旋1.DNA復(fù)制需要解旋，細(xì)胞中這一過(guò)程如何實(shí)現(xiàn)？在試管中如何實(shí)現(xiàn)？細(xì)胞中，DNA的解旋由DNA解旋酶催化完成。在試管中，可以通過(guò)加熱斷開(kāi)氫鍵完成解旋。所需溫度一般為90-95℃。PCR的條件2.催化DNA子鏈合成的酶是哪一種酶？PCR反應(yīng)過(guò)程需要較高的溫度，所使用的酶需要具有什么樣的特點(diǎn)？催化DNA合成的是DNA聚合酶。該酶由中國(guó)科學(xué)家錢嘉韻于黃石公園熱泉微生物中分離得到，70℃條件下反應(yīng)2h活性殘余>90%。PCR過(guò)程中，需要熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）催化完成。PCR的條件3.DNA聚合酶的特點(diǎn)：在已有核苷酸鏈的3’端添加單個(gè)核苷酸。據(jù)此推測(cè)，PCR還需要提供什么樣的條件？根據(jù)目的基因兩條鏈

端的堿基序列，設(shè)計(jì)并添加相應(yīng)引物。兩種引物序列往往既不相同，也不互補(bǔ)。PCR過(guò)程中，需要提供一小段已有核苷酸鏈，我們稱為引物。3’請(qǐng)同學(xué)們思考，子鏈的延伸方向是什么？自身的5’→3’5’端3’端PCR的條件4.細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制利用

提供能量，并以

作為原料。PCR過(guò)程中，利用dATP、dTTP、dCTP、dGTP同時(shí)提供原料和能量。統(tǒng)稱為dNTP。d代表脫氧核糖，dATP：脫氧腺苷三磷酸。ATP脫氧核苷酸PCR的條件5.利用PCR復(fù)制DNA的過(guò)程中，所需要的模板是什么？目的基因的雙鏈作為復(fù)制的模板。6.適宜的PH值和液體環(huán)境：試管內(nèi)加入緩沖液。PCR的條件（1）DNA（目的基因）模板。（2）分別與模板DNA相結(jié)合的兩種引物。（3）A、T、G、C四種脫氧核苷酸和能量。（4）耐高溫的DNA聚合酶。（5）穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）。耐高溫的DNA聚合酶引物四種脫氧核苷酸DNA模板PCR的條件PCR的反應(yīng)過(guò)程A．變性當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈。待擴(kuò)增的DNA片段B．復(fù)性溫度下降到50℃左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合。C．延伸溫度上升到72℃左右，溶液中的四種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。觀看視頻，跟隨視頻畫出前三個(gè)循環(huán)的過(guò)程，并思考：1.幾輪循環(huán)后會(huì)出現(xiàn)只有目的基因片段的DNA分子？2.理論上講，N個(gè)循環(huán)后，會(huì)出現(xiàn)多少個(gè)DNA片段？PCR的過(guò)程資料PCR的過(guò)程幾輪循環(huán)后會(huì)出現(xiàn)只有目的基因片段的DNA分子？理論上講，N個(gè)循環(huán)后，會(huì)出現(xiàn)多少個(gè)DNA片段？3輪循環(huán)后會(huì)出現(xiàn)只有目的基因片段的DNA分子。產(chǎn)物的計(jì)算公式：2NPCR的過(guò)程動(dòng)腦想一想

胞內(nèi)復(fù)制PCR反應(yīng)解旋在

酶作用下，細(xì)胞提供

，雙鏈

解開(kāi)加熱至

℃，雙鏈

解開(kāi)，不需要

酶特點(diǎn)

酶

復(fù)制次數(shù)

相同點(diǎn)都需要

，

，

，都需要在一定的

中進(jìn)行，都遵循

。DNA解旋ATP部分9