植物蛋白飲料多種植物源性成分快速檢測數(shù)字微流控芯片法

2植物蛋白飲料多種植物源性成分快速檢測數(shù)字微流控芯片法本文件規(guī)定了植物蛋白飲料中大豆、核桃、榛子、花生、杏仁和椰子6種成分的快速檢測方法（數(shù)字微流控芯片法）。本文件適用于植物蛋白飲料中上述6種植物源性成分的快速定性檢測。本文件中植物蛋白飲料6種植物源性成分的檢出限：大豆、核桃、榛子、花生均為0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），杏仁、椰子均為1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測實驗室技術(shù)要求GB/T27403實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測3術(shù)語、定義和縮略詞3.1術(shù)語與定義下列術(shù)語與定義適用于本文件。微流控芯片技術(shù)Microfluidicchip采用微機電系統(tǒng)技術(shù)在數(shù)平方厘米大小的芯片上加工微米至納米尺度的微通道網(wǎng)絡(luò)，通過對微米或納米尺度下液體的精確操控，在芯片上實現(xiàn)樣品引入、混合、化學(xué)反應(yīng)、分離、檢測等功能，其系統(tǒng)具有微量、高效、高通量、低成本、微型化、集成化和自動化等特點。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)Loop-mediatedisothermalamplification利用具有鏈置換特異性的BstDNA聚合酶和四條能夠特異性識別靶標(biāo)序列上多個特異性區(qū)域（F3、F2、F1、B1、B2、B3）的引物，開啟循環(huán)鏈置換反應(yīng)，從而實現(xiàn)等溫條件下的連續(xù)快速反應(yīng)。數(shù)字微流控芯片技術(shù)Digitalmicrofluidicchip利用液滴在疏水表面的介電濕潤現(xiàn)象，通過電子電路控制液體表面張力，實現(xiàn)離散液滴的精準(zhǔn)控制，結(jié)合引物試劑預(yù)包埋、LAMP擴增技術(shù)，實現(xiàn)將配液、分裝、檢測等操作在封閉的芯片內(nèi)自動進行。3.2縮略詞下列縮略詞適用于本文件。Bst：嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）LAMP：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediatedisothermalamplification）DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonuleicacid）DNase：脫氧核糖核酸酶（Deoxyribonuclease）CTAB：十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammoniumbromide）Tris：三羥甲基氨基甲烷[Tris（Thdroxymethyl）aminomethane]Tris-HCl：三羥甲基氨基甲烷－鹽酸[Tris（Thdroxymethyl）aminomethane-hydrochloricacid]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）Na2EDTA：乙二胺四乙酸二鈉（Ethylenediaminetetraaceticaciddisodium）Tt：時間閾值（Timethreshold）4原理將植物蛋白飲料常見的大豆、核桃、榛子、花生、杏仁、椰子源性成分LAMP特異性引物，分別包埋在微流控芯片的相應(yīng)位置，將提取樣本的DNA與恒溫擴增反應(yīng)液混合后，加入微流控芯片中進行63℃恒溫擴增反應(yīng)，通過微流控芯片檢測儀實時檢測熒光信號，根據(jù)擴增產(chǎn)物熒光信號出現(xiàn)的時間、強度和位置，判斷樣本中是否含有目標(biāo)植物源性成分。5試劑與材料除另有說明外，所用試劑、耗材均應(yīng)不含DNA和DNase；試劑為分析純、生化試劑；實驗用水為GB/T6682中規(guī)定的一級水。5.1陰性對照、陽性對照的成分。a）陰性對照：用非目標(biāo)源性成分提取的核酸；b）陽性對照：從含有6種目標(biāo)成分陽性樣本中提取的核酸，或含有人工合成的6種目標(biāo)核酸序列的DNA片段。5.2RNA酶（10mg/μL）。5.3蛋白酶K（20mg/mL）。5.4異丙醇（分析純）。5.5硅羥基磁珠。5.670%乙醇（V/V）。5.7三氯甲烷（分析純）。45.8氯仿：異戊醇（V/V，24:1）。5.9氯化鈉溶液：1mol/L。5.10數(shù)字微流控芯片法檢測反應(yīng)體系、引物配制及引物序列：見附錄A。5.11十六烷基三甲基溴化銨提取液（CTAB提取液）：成分和配制方法見附錄B中B.1。5.12十六烷基三甲基溴化銨沉淀液（CTAB沉淀液）：成分和配制方法見附錄B中B.2。5.13TE溶液（Tris-HCl、EDTA緩沖液）：成分和配制方法見附錄B中B.3。5.14數(shù)字微流控芯片結(jié)構(gòu)及排布示意圖：見附錄C。6儀器設(shè)備——漩渦混合儀；——電子天平：感量0.01g；——高速離心機：12000r/min；——恒溫金屬浴：65℃±1℃;——生物安全柜；——高壓滅菌鍋；——核酸蛋白分析儀；——磁力架；——微流控芯片檢測儀；——微量移液器：0.5μL~10μL、2μL~20μL、10μL~100μL、20μL~200μL、100μL~1000μL。7檢測流程5圖1數(shù)字微流控芯片法檢測流程8操作步驟8.1核酸提?。?）固體樣品按照產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)示沖調(diào)比例稀釋至液體狀態(tài)，含固型物樣品則將固型物均質(zhì)后取樣，液體樣品搖勻后吸取0.5mL~1mL至滅菌離心管中。（2）加入1mLCTAB提取緩沖液，10μLRNA酶和20μL蛋白酶K，振蕩混勻，65℃±1℃孵育1h以上，期間上下顛倒混勻4次～5次。（3）加入600μL氯仿/異戊醇混合液，充分振蕩混勻30s，12000r/min離心10min，取上清液于潔凈的離心管中，注意不要吸到上清液下面的蛋白層。注意：脂肪含量高的植物蛋白飲料（花生、核桃等），需要增加以下步驟，具體方法為：加入2倍體積CTAB沉淀液，混勻后室溫靜置60min后，12000r/min離心10min；棄去上清液，加入350μL1mol/LNaCl溶液充分溶解沉淀；加入350μL三氯甲烷，高速漩渦振蕩混勻，12000r/min離心10min，取上清液。6（4）加入等0.8倍體積冰上預(yù)冷的異丙醇，15μL磁珠懸浮液，充分混勻后，靜置15min，將離心管置于磁力架靜置1min，棄去廢液。（5）加入70%乙醇，充分混勻后，將離心管置于磁力架靜置1min，棄去廢液。（6）重復(fù)操作步驟5，將吸附DNA的磁珠于室溫干燥5min。（7）加入50μLTE溶液，65℃±1℃溫浴3min，將離心管置于磁力架靜置1min，吸取溶液于潔凈的1.5mL離心管中，即得到樣品DNA?？闪⒓从糜趯嶒灒部杀３钟?20℃條件備用。注：也可使用等效的其他DNA提取方法或商品化DNA提取試劑盒。8.2DNA濃度和純度測定使用核酸蛋白分析儀檢測其濃度及質(zhì)量，OD260/280值應(yīng)在1.7~2.0之間。8.3恒溫擴增8.3.1試劑配制從-20℃±5℃冰箱取出試劑，將各試劑于室溫下解凍，充分混勻并離心后備用。取出200μLPCR管，按照附錄A構(gòu)建檢測體系，漩渦振蕩混勻并瞬時離心，總體積為25μL。8.3.2數(shù)字微流控芯片加樣用移液槍吸取550μL白油，從數(shù)字微流控芯片的進油口緩慢加入，使芯片全部浸潤白油為止，用移液槍吸取18μL配制好的反應(yīng)試劑從芯片的弧形進液口緩慢加入。8.3.3上機測試將加樣后的芯片連同卡托一同放入微流控芯片檢測儀中，反應(yīng)溫度和程序如表1：表1恒溫擴增反應(yīng)條件溫度反應(yīng)時間熒光采集63℃45min每分鐘采集1次8.4結(jié)果判斷8.4.1閾值線設(shè)置手動設(shè)置為擴增曲線熒光強度的1/10左右，或以閾值線剛好超過非典型S型擴增的最高點為設(shè)定原則，儀器配套軟件自動分析結(jié)果。8.4.2結(jié)果判定任意一個反應(yīng)孔或多個反應(yīng)孔中熒光信號出現(xiàn)典型擴增曲線，且Tt值≦40，則該反應(yīng)孔對應(yīng)檢測判斷為陽性，即該樣本中含有對應(yīng)檢測項目的核酸；未出現(xiàn)典型擴增曲線或Tt值＞40的反應(yīng)孔判斷為陰性，即該樣本不含有對應(yīng)檢測項目的核酸。9質(zhì)量控制通過設(shè)置空白對照、陰性對照和陽性對照進行反應(yīng)的控制，具體判斷如下：空白對照：反應(yīng)時間45min內(nèi)，熒光信號未出現(xiàn)典型擴增曲線；陰性對照：反應(yīng)時間45min內(nèi)，熒光信號未出現(xiàn)典型擴增曲線；陽性對照：反應(yīng)時間45min內(nèi)，熒光信號出現(xiàn)典型擴增曲線，Tt值＜40。以上條件有一條不滿足時，實驗視為無效。10結(jié)果表述結(jié)果為陰性，表述為“未檢出××成分”；結(jié)果為陽性，表述為“檢出××成分”。11防止污染措施實驗室操作和廢棄物處理應(yīng)符合GB/T19495.2的規(guī)定，應(yīng)嚴(yán)格按照GB/T27403的要求操作。8數(shù)字微流控芯片檢測試劑體系及引物配制A.1數(shù)字微流控芯片檢測反應(yīng)體系組分表表A.1數(shù)字微流控芯片檢測反應(yīng)體系組分表63MgSO4（100mmol/L）11樣品DNA模板56X-100。引物已預(yù)先固定到微流控芯片上，最A(yù).2數(shù)字微流控芯片的引物混合固定體系表A.2數(shù)字微流控芯片的引物混合固定體系F3（ForwardOuterPrimer）上游外部引物（100μmoB3（BackwardOuterPrimer）下游外部引物（100μmFIP（ForwardInnerPrimer）上游內(nèi)部引物（200μmolBIP（BackwardInnerPrimer）下游內(nèi)部引物（200μLF（ForwardRingPrimer）上游環(huán)引物（200μLB（BackwardRingPrimer）下游環(huán)引物（200μmoA.3植物源性成分基因檢測用引物序列表A.3植物源性成分基因檢測用引物序列LectinGAGTACCAAAGCTTGCAAATGCGCACTTACATAGGAGGTAGTTGTCAGAATTTTTCTTAGAGTTTACCTCAGAAACvicilin-likeproteinprecursorCACGAAGGAGCTCGGTTCTCTCTGAGTCCGTCCTAACACCTCCATGCTCCCATCCTCTTGTGATTGCATGTAGACGAAGGGGCACAGACTTAAATCCTGCATGAAAACTTCCTAACACGTGGGTTTTATATArah2.02AACATCTCATTGATTATACCTTCCACGTTACATTTTCATGCAAAACAACATGGTAATGAAGCAAACACAGCCACCATTTTGCATGTGPR5-1Hd3aCATGGCTTCCCGATGGGTACCTCAGGGAGTATGCTATATATTGGGCCGGACTTCGCAATCTCTTCT試劑配制B.1十六烷基三甲基溴化銨提取液（CTAB提取液）CTABNaCl0.5mol/LNa2EDTA1mol/LTris-HCl（pH8.0）20.0g81.9g40mL100mL先加入500mL超純水充分溶解，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0，最后定容至1000mL，121℃高壓滅菌15min，室溫保存。B.2十六烷基三甲基溴化銨沉淀液（CTAB沉淀液）CTABNaCl超純水5.0g2.34g加至1000mL充分溶解，121℃高壓滅菌15min，室溫保存。B.3TE溶液（Tris-HCl、EDTA緩沖液）1mol/LTris-HCl（pH8.0）0.5mol/LEDTA（pH8.0）超純水10mL2mL加至1000mL充分溶解，121℃高壓滅菌15min，室溫保存。數(shù)字微流控芯片結(jié)構(gòu)及模擬示意圖，見圖C.1圖C.1數(shù)字微流控芯片結(jié)構(gòu)及排布模擬示意圖注：1-12反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔可預(yù)包埋相應(yīng)植物源性成分引物混合液，提供擴增反應(yīng)的場所，根據(jù)檢測需求，設(shè)置使用預(yù)包埋孔位；13加油口；14進樣口。數(shù)字微流控芯片的制作與質(zhì)量控制D.1數(shù)字微流控芯片的制作采用微量點樣儀，將各個引物均勻點布在數(shù)字微流控芯片的特定位置，每