博士后研究報(bào)告(出站)

PAGEPAGE18分類號(hào) 級(jí) UDC 號(hào) 南方醫(yī)科大學(xué)結(jié)構(gòu)及功能性鑒定與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的二型膠原蛋白特異性、HLA-DRB1*0405限制型T細(xì)胞表位FunctionalandStructuralCharacterizationofanHLA-DRB1*0405-restrictedTcellEpitopefromTypeIICollagenRelevanttoRheumatoidArthritis張娜茹工作完成日期 2017年7月至2019年12月報(bào)告提交日期 2020年1月南方醫(yī)科大學(xué)（廣東）2020年1月結(jié)構(gòu)及功能性鑒定與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的二型膠原蛋白特異性、HLA-DRB1*0405限制型T細(xì)胞表位FunctionalandStructuralCharacterizationofanHLA-DRB1*0405-restrictedTcellEpitopefromTypeIICollagenRelevanttoRheumatoidArthritis博士后姓名：張?jiān)崎_(kāi)流動(dòng)站（一級(jí)學(xué)科）名稱：藥理學(xué)專業(yè)（二級(jí)學(xué)科）名稱：抗炎免疫藥理學(xué)研究工作起始時(shí)間 2017年7月1日研究工作期滿時(shí)間 2019年12月31日南方醫(yī)科大學(xué)人事部（廣東）2020年1月內(nèi)容摘要類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）TII類分（MHC30-40%HLA-DRB1*0405（CII）T細(xì)胞表位及它是如何與HLA-DRB1*0405分子結(jié)合進(jìn)而相互作用的尚未被科研工作者報(bào)道。通過(guò)多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)了一條來(lái)源于CII的多肽hCII931-949與HLA-DRB1*0405分子具有很高的結(jié)合力,HLA-DRB1*0401分ThCII259-273HLA-DRB1*0405E266LhCII259-273_E266LHLA-DRB1*0405分子的結(jié)合力大幅hCII931-949HLA-DRB1*0405分子的主要結(jié)合位點(diǎn)并得到了DRB1*0405-hCII931-949的晶體結(jié)構(gòu)。CII特異性，HLA-DRB1*0405T細(xì)胞表位的鑒定為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疫苗的研發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。HLA-DRB1*0405,二型膠原蛋白，T細(xì)胞表位，AbstractRheumatoidarthritisisaTcelldependentautoimmunediseasewithastrongassociationwiththemajorhistocompatibilitycomplexclassII(MHCII)gene.Upto30-40%oftheEastAsianRApatientspossessHLA-DRB1*0405allelwhichisassociatedwiththedisease.AjointproteinthathasbeensuggestedtoplayaroleintheonsetofarthritisistypeIIcollagen(CII)butitissofarunknownhowtherelevantpeptideisboundandrecognizedwhenpresentedbyHLA-DRB1*0405allele.WehavenowidentifiedhowhCII931-949peptidefromhumanCIIbindstotheHLA-DRB1*0405allelebycompetitivepeptidebindingassayandcrystalstructure.TheDRB1*0405moleculewasfoundtobindthehCII931-949peptidebutwithdramaticallyreducedaffinitytothewellidentifiedHLA-DRB1*0401TcellepitopehCII259-273.TheE266LaminoacidsubstitutionatP4pocketofthehCII259-273peptideincreasedthebindingaffinitywithHLA-DRB1*0405molecule.ThekeyresiduesthatareimportantforHLA-DRB1*0405bindingwereidentified.Furthermore,wegotthecrystalstructureofHLA-DRB1*0405complexedwithhCII931-949peptide.TheCII-specific,HLA-DRB1*0405restrictedTcellepitopeidentificationmightlayascientificfoundationfortheRAvaccinedevelopmentandclinicaluse.Keywords:Rheumatoidarthritis;MHCII;HLA-DRB1*0405;typeIIcollagen(CII);Tcellepitope目次引言 9類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究意義 9類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀 11類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素 11類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的自身抗原及其T細(xì)胞表位 12實(shí)驗(yàn)材料與方法 14實(shí)驗(yàn)材料 14實(shí)驗(yàn)試劑與耗材 14主要儀器 15實(shí)驗(yàn)方法 16E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備 16PCEP4-DRA1*0101及PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 16質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染ExpiHEK293F細(xì)胞以表達(dá)DRB1*0405-hCLIPmutd蛋白 16DRB1*0405-hCLIPmut蛋白的純化 17西方印跡法鑒定DRB1*0405-hCLIPmut蛋白 17多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn) 19HLA-DRB1*0405-hCII931-949復(fù)合物結(jié)晶及其晶體結(jié)構(gòu)解析 20從RA病人全血中提取基因組DNA. 20從RA病人抗凝血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC). 21酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 22統(tǒng)計(jì)處理和分析 22實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 22表達(dá)質(zhì)粒獲得成功構(gòu)建 22西方印跡法鑒定HLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白獲得成功表達(dá) 24對(duì)影響蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行餓優(yōu)化 24多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)HLA-DRB1*0405分子可特異性結(jié)合hCII931-949多肽 24P-2、P1、P4和P8是hCII931-949多肽與HLA-DRB1*0405分子結(jié)合的主要位點(diǎn) 27HLA-DRB1*0405分子與hCII931-949多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu) 28PBMC體外刺激實(shí)驗(yàn) 294.討論 305.結(jié)論 346.致謝 357.參考文獻(xiàn) 368.結(jié)尾 39圖表清單圖1 10圖2 20圖3(A-B) 23圖4 24圖5 24圖6(A-C) 26圖6(D) 27圖7… 28圖8 29圖9 30英文縮略詞對(duì)照表AlanineAntigenpresentingcell

AAPCCollagen-inducedarthritis CIACollagentypeIIEnzymelinkedimmunosorbentassayGlycineGlutamineHemagglutininHumanleukocyteantigenMajorhistocomplexclassOpticaldensityPheripheralbloodmononuclearcellPhenylalanineRheumatoidarthritisProlineSharedepitopeTcellreceptorTheronine

CIIELISAGQHAHLAMHCODPBMCFRAPSETCRT結(jié)構(gòu)及功能性鑒定與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的二型膠原蛋白特異性、HLA-DRB1*0405限制型T細(xì)胞表位引言類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的研究意義類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoidarthritis,RA)是一種以慢性滑膜炎為主的自身15-25%的患者中也可能會(huì)影響到身體的其它器官，比如眼睛、皮膚、心臟、腎臟和神經(jīng)系2016RA6000萬(wàn)。RA發(fā)病率及致殘率都非常高，對(duì)人類健康造成非常嚴(yán)重的威脅，被稱為“不死的癌癥”。目前臨床上采用的藥物治療主要包括非甾類抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥（Disease-modifyinganti-rheumaticdrugs，DMARDs）、免疫抑制劑、生物制劑及植物藥等，治療的主要目的在于減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制病變發(fā)展及不可逆骨質(zhì)破壞，盡可能保護(hù)關(guān)節(jié)和肌肉的功能，最終達(dá)到緩解病情或降低疾病活RA患者使用上述藥物幾年后常常會(huì)出現(xiàn)明顯的毒副RA是一種自身免疫性疾病，自身抗原的確定顯得尤為重要。人體內(nèi)存在多種關(guān)節(jié)特異性蛋白，例如：二型膠原蛋白（CollagentypeII,CII）、人體軟骨糖蛋白（HCgp39）、瓜CIIRACII的抗體[1]（Collagen-inducedarthritis,CIIRACIIRACII可使小鼠產(chǎn)RA的癥狀RACD4+TT細(xì)胞CII中某個(gè)翻譯后修飾肽段被抗原遞呈細(xì)胞（APC）細(xì)胞膜表面表達(dá)的主要組織相容性復(fù)合物（MHC）IICD4+T細(xì)胞受體（TCR）T細(xì)（CIICII263-271已被發(fā)現(xiàn)MHCIIT（Tcellreceptor,間的結(jié)合也獲得了成功鑒定[4]RACD4+TCII主要抗原決定區(qū)的確定顯得至關(guān)重要。圖1.抗原遞呈細(xì)胞（APC）與CD4+T細(xì)胞之間的相互作用。APC遞呈的MHCII分子與之結(jié)合的多肽復(fù)合物被CD4TCR識(shí)別，在共刺激分子的作用下將T細(xì)胞活化。HLA-DRB1（SharedepitopeRA最密[5]RA患者中HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0401和HLA-DRB1*0404基因型所占比重較大，而在亞洲RA患者中（在中國(guó)、日本、韓國(guó)人群尤為顯著）約30-40%的患者攜帶HLA-DRB1*0405等位基因[6-8]。在CIA模型和HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0401或HLA-DRB1*0404等位基因攜帶者的RA病人中間，自身反應(yīng)性T細(xì)胞能夠識(shí)別同一條CII260-273肽段[3]。位于264位點(diǎn)的賴氨酸（K264）T細(xì)胞識(shí)別糖基化的CII多肽在關(guān)節(jié)炎產(chǎn)生方面起到了非常重要的作用[9]。Balik等人研究表明在CIA動(dòng)物模型中，糖基化CII259-273/Aq復(fù)合物有效抑制了關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生[10]。該研究主要針對(duì)攜帶HLA-DRB1*0405主導(dǎo)基因型的亞洲RA患者，旨在確定CII特異性，HLA-DRB1*0405限制性T細(xì)胞表位，該表位的確定將為RA疫苗的研發(fā)奠定科學(xué)基礎(chǔ)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的遺傳因素RA是一種相對(duì)復(fù)雜的多因素導(dǎo)致的慢性自身免疫性疾病，環(huán)境因素比如RA621.31HLA復(fù)合體Stastny1978年首次證實(shí)HLA-DRB1*0401基因與RA[121986Nepom發(fā)現(xiàn)了HLA-DRB1*0404基因也與RA存在著一定關(guān)聯(lián)性[13]RA相關(guān)的等位基因包括：HLA-DRB1*0101、*0102、*0401、*0404、*0405、*0408、*0409*0410*1001*1402*1406和*1409HLA-DR分子β鏈位于70-74位點(diǎn)的第三超變區(qū)共同擁有一個(gè)相似的表位：QRRAA-*0101、*0102、*0404、*0405、*0408、*0410、*1402、*1406；QKRAA-*0401RRRAA-*1001[5]。這一共享表位區(qū)大大影響了與多肽的CD4+THLA-DRB1*0402(DERAA)則被列為保護(hù)基因型[14]。相關(guān)研究證實(shí)該共享表位區(qū)在種族之間存在很大的差異：在歐洲RAHLA-DRB1*0101、*0401和*0404的比重較大[8]，然而RA30-40%HLA-DRB1*0405所占比重最大。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，HLA-DRB1*0405基因尤其與韓國(guó)，日本和中RA11.9%HLA-DRB1*0405等位基因[15]HLA-DRB1*0405基因AIHLA-DRB*05限制型T細(xì)胞表位的鑒定是首要任務(wù)。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的自身抗原及其T細(xì)胞表位RACIIHCgp39RARACII是構(gòu)成關(guān)節(jié)透明軟骨的主要蛋白，在3%-27%RA患者的血清中可檢測(cè)到CII的特異性抗體[16]，而且在最常用到的CIA動(dòng)物模型中用CIICII蛋白的翻譯后修飾在誘發(fā)炎癥過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。RACD4T細(xì)胞[18]在Aq和DR4轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，位于CII264和270位點(diǎn)的兩個(gè)賴氨酸可羥基化繼而糖基化，這一修飾可被T細(xì)胞識(shí)別，從而誘發(fā)CIA或者對(duì)自身CII產(chǎn)生免疫耐受[19,20]。目前研究最多的HLA-DRB1*0401分子與RA相關(guān)的T細(xì)胞表位為CII261-273,IC50表示為180nM[21]和*0101轉(zhuǎn)基因CIA動(dòng)物模型中自身反應(yīng)性T細(xì)胞能夠識(shí)別CII蛋白259-273段表位[22]，這段表位與Aq相結(jié)合。T細(xì)胞可以特異性識(shí)別這段翻DR4的RA患者中[17]，這一發(fā)現(xiàn)表明RA患者帶來(lái)光明。然而種族差異，不同的種族攜帶不同的HLA-DRB1分子，不同的HLA-DRB1分子結(jié)合的T細(xì)胞表位也會(huì)存在一些差據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)可以結(jié)合HLA-DRB1*0405分子的多肽包括CII256-271：GEPGIAGFKGEQGPKG[23]CII429-442:GGVGPIGPPGERGA、CII593-610:SGFQGLPGPPGPPGEGGKP 、和CII 1064-1081:RGFTGLQGP24]I11這條多肽能夠刺激67%的攜帶HLA-DRB1*0405RA患者的PBMC產(chǎn)生IL-2和IFN-γ[25],CII1064-1081是HLA-DRB1*0405TCII的三螺旋結(jié)構(gòu)重新命名多肽一系列多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)和晶體結(jié)構(gòu)首次從結(jié)構(gòu)和功能上鑒定了CII來(lái)源的HLA-DRB1*0405分子限制型的T細(xì)胞表位。實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)試劑與耗材hCII931-949 (GHRGFTGLQGLPGPPGPSG); hCII931-945(GHRGFTGLQGLPGPP)及其被丙氨酸逐一位點(diǎn)替換的多肽;hCII259-273(GIAGFKGEQGPKGEP);hCII259-273_P4E266L(GIAGFKGLQGPKGEP);HA306-318(PKYVKQNTLKLAT)以及生物素標(biāo)記的hCLIPBiotin-Ahx-hCLIP:Biotin-Ahx-KPVSKMRMATPLLMQA)Biomatilk的純度都在95%以上。HLA-DRA*0101,HLA-DRB1*0405-hCLIPmut和HLA-DRB1*0405-hCII931-949EurofinsGenomics,QIAampDNAbloodMidiKitQIAGEN10,000XGelrednucleicacidgelstainBiotium公司。Expi293FTM細(xì)胞,Expi293蛋1640humanIL-2-4-12Bis-Tris蛋白分離膠和IFNgammahumanuncoatedELISAkit均購(gòu)自Thermofisherscientific公司。FectoPROTMPolyplus16/60Superdex200pg凝膠過(guò)濾預(yù)裝柱,2030kDa蛋白濃縮管,AmershamhyperfilmECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和Ficoll-paqueTMplus均購(gòu)自GEHealthcare公司。辣根過(guò)氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗SouthernBiotechDELFIAEu-N1Streptavidin購(gòu)自PerkinElmer公司。5ml,10ml25mlSarstedt公司。HPLC級(jí)純水購(gòu)自山海默ELISACostar3590酶標(biāo)板購(gòu)自VWR公司。主要儀器冰箱 DZHaier冰箱 Ranshen-80℃超低溫冰箱88000ThermoFisherScientific磁力攪拌器 GL-3250CKylin-BellLabInsruments抗體孵育搖床 TSC-8QilivBEIERYIQIZHI水平搖床TS-1 QilivBEIERYIQIZHI電泳儀 BG-Power6000 蛋白電泳槽 Mini-proteanBio-RADDNA電泳槽Mini-SubcellGT 臺(tái)式離心機(jī) 5810REppendorf落地式高速離心機(jī) J-E BECKMAN金屬浴鍋BYQ6044E-216 BIOERTECHNOLOGYCOCTD加熱恒溫水浴鍋HWS12/HWS28 上海一恒科技公渦旋振蕩器 MixerV6ESSENSCIEN手掌離心機(jī) XK-400 珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiDoctouch美國(guó)BiotekG1000基因擴(kuò)增儀 TC-96/G/H（b)B杭州博日科技PH測(cè)量?jī)x S210 梅特勒-拖利多儀器（上海）有限公分析天平220g ME203E METTLERTOLEDO37℃CO2培養(yǎng)箱 HF90/HF240ThermoFisherScientific恒溫?fù)u箱ZHCHENE制冰機(jī) XB-130-FZ/R134A GRANT烤箱 HH-811-500 上海市躍進(jìn)醫(yī)療器械廠倒置顯微鏡 CKX31 OlympusSynergyH1BiotekGEhealthcare實(shí)驗(yàn)方法E.coliDH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞的制備取一管商品化的E.coliDH5α,在制備好的LB固體培養(yǎng)平板375mlLB液體372mlLB37OD600=0.4500ml3000g,41520ml0.1MCaCl2303000g,4104ml15%0.1MCaCl2-80℃低溫保存。PCEP4-DRA1*0101及PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定HLA-DRA1*0101HLA-DRB1*0405-hCLIPmut基因序列送公司合成后，PCEP4DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，371LB平板中挑取單克隆，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后抽提質(zhì)粒，然后通過(guò)雙酶切和測(cè)序的方法共同鑒定質(zhì)粒序列的準(zhǔn)確性。ExpiHEK293FDRB1*0405-hCLIPmut蛋白ExpiHEK293F1x106/ml37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱懸浮培養(yǎng)。24Opti-MEM培養(yǎng)液的試FectoPROOpti-MEM培養(yǎng)液的試管中按一定比例加入PCEP4-DRA1*0101PCEP4-DRB1*0405-hCLIPmut質(zhì)15分鐘后，把混合物逐滴加入ExpiHEK293F37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。DRB1*0405-hCLIPmut蛋白的純化5-680%左右終止細(xì)胞培養(yǎng)，離心細(xì)胞培養(yǎng)0.45μm蛋白經(jīng)純化系統(tǒng)（鎳離子親和層析和尺寸排阻色譜法）純化。首先用含有50mMTris-HCl,150mMNaCl,10mMImidazoleHis-TrapExcel柱子，50mMTris-HCl,150mMNaCl,500mMImidazole的洗脫液洗脫蛋白，洗脫下來(lái)的蛋白經(jīng)過(guò)10KDAmiconUltracentrifugalfilterunitsHiLoadSuperdex200pg純化柱去除蛋白聚集體。純化后的蛋白可Mouseanti-DR和二抗anti-mouse-HRP經(jīng)下述西方印跡法鑒定。DRB1*0405-hCLIPmut蛋白常用緩沖液及其配制①30％丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 29g甲叉丙烯酰胺 1g蒸餾水 100ml攪拌器攪拌溶解，待完全溶解后，過(guò)濾，4℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＂?×上樣緩沖液(pH6.8)62.5mMTris-HClpH6.8，2%w/vSDS，10%甘油，50mMβ-巰基乙醇，0.01w/v1MTris-HCl(pH6.80.6250.21ml，β-巰基乙醇0.5ml，溴酚蘭0.001g，用水補(bǔ)加至5ml。③Tris-甘氨酸電泳緩沖液25mMmMw/vSDS10×mlddH2O30.2g188g100mlw/v10SDS，用ddH2O1000ml。④電轉(zhuǎn)移緩沖液25mmol/Lmmol/Lw/v甲醇(pH8.5)。10×儲(chǔ)液，900mlddH2O58g堿，29g3.7gSDS，ddH2O800ml80mL10×ddH2O800ml，加入200ml甲醇，4℃預(yù)冷備用。⑤10×Tris-鹽緩沖液(TBS)24.2g堿，80gNaCl800mlHClpH7.6，加ddH2O1000ml1×TBS0.1%TBST洗滌液。⑥封閉液1×TBS0.1%5%w/v脫脂奶粉，攪拌溶解。⑦抗體稀釋液1×TBS0.1%5%w/v脫脂奶粉，攪拌溶解。免疫印跡操作步驟4-12%凝膠1.5-2(恒流，16mA/gel)，保證所加樣品蛋白總量一致。SDS-Bio-Rad()。③轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將硝酸纖維素膜置于平緩搖動(dòng)的搖床上，以20ml封閉緩沖液室溫下封閉1小時(shí)或4℃封閉過(guò)夜。④5mlTBST洗膜5次，每次3分鐘。⑤一抗Mouseanti-DRL243單克隆抗體用抗體稀釋液2000倍稀釋，在搖床上室溫孵育1小時(shí)，確?？贵w稀釋液能完全覆蓋膜。⑥用25mlTBST洗膜5次，每次3分鐘。⑦HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗用抗體稀釋液30000倍稀釋，在搖床上室溫孵育1小時(shí)，確?？贵w稀釋液能完全覆蓋膜。25mlTBST53分鐘。⑨膜稍瀝干后加入化學(xué)發(fā)光試劑(125μl/cm230A、B液混合)室1X膠片貼在一起進(jìn)行曝10X多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)PBS2倍稀釋，50μl/non-binding96孔板，然后在上述緩沖液中加入適量的DRB1*0405-hCLIPmut蛋白和Biotin-Ahx-hCLIP0.1μM3μM,50μl/9648L243ELISA板，PBST96ISA31T2000倍稀釋的Eu-Streptavidin,371小時(shí)洗板，最后加入Enhancement溶液，5分鐘后讀板。圖2.多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)圖解HLA-DRB1*0405-hCIIPep.復(fù)合物結(jié)晶及晶體結(jié)構(gòu)解析利用坐滴蒸汽擴(kuò)散法獲得HLA-DRB1*0405-hCII931-949蛋白復(fù)合物晶體，拿到晶體之后進(jìn)行X射線衍射，收集衍射圖譜，通過(guò)計(jì)算，進(jìn)一步得到該蛋白復(fù)合物的原子結(jié)構(gòu)。RADNAA4.4mlddH2OQIAGEN-20B15ml100μlQIAGEN蛋白酶,1ml全血，輕輕混勻。C1.2mlAL151分鐘以充分混勻，然后置于70℃水浴10分鐘。D1ml96-100%10次，然后渦旋震蕩以充分混勻。E、將所有混合液輕輕轉(zhuǎn)移到試劑盒提供的QIAampMidi柱式離心管，3000rpm離心3分鐘。F、棄掉過(guò)濾液，加入2mlAW1緩沖液，5000rpm離心1分鐘。G、加入2mlAW2緩沖液，5000rpm離心15分鐘。HQIAampMidi15ml200μlddH2O,室5分鐘，5000rpm2分鐘。IDNA2μlNanodrop測(cè)濃度，取適量送北京旌準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司做HLA-DRB1DNA樣品置于-20℃冰箱凍存。RA病人全血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）A10mlHLA-DRB1*0405RA病人靜脈血。B、取8ml血液到50ml離心管，以等量PBS稀釋。C、另取50ml離心管，在管底輕輕注入20mlFicoll,將稀釋好的血液輕輕鋪在Ficoll上。D、離心機(jī)升速和降速設(shè)置為0，20℃，400g離心30分鐘。E、用移液槍輕輕吸出PBMC層到一個(gè)新的50ml離心管中，加入30mlPBS,400g離心10分鐘。F、棄上清，2mlRPMIPBMC,1x106個(gè)細(xì)胞/9620μg/mlIL-2細(xì)胞因子，將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）A、待PBMC培養(yǎng)到第6天，用抗人IFN-gamma的抗體鋪酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過(guò)夜。B、第二天，PBST洗板五次，室溫封閉1h。CPBST7μl/過(guò)夜。D、清洗五次，加入生物素標(biāo)記的抗人IFN-gamma抗體，100μl/孔，室溫孵育1小時(shí)。E、清洗五次，加入100μl/孔Avdin-HRP,室溫孵育30分鐘。F、清洗五次，加入100μl/孔1XTMB溶液，室溫孵育15分鐘。G、待標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)明顯階梯狀藍(lán)色之后加入50μl終止液。K、10分鐘之內(nèi)450nm檢測(cè)OD值。L、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和分析GraphpadPrism5±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)unpairedt-test方法；雙方法。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001表明組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析表達(dá)質(zhì)粒獲得成功構(gòu)建如圖3A,His-tag為純化蛋白用，F(xiàn)os/Jun序列的加入能夠保證α和β鏈形成hCLPmut的存在有助于維持α1和β1Pocket的空間構(gòu)象。Thrombin酶切位點(diǎn)的加入3BHLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白的空間結(jié)構(gòu)示意圖。(A)(B)圖3.(A)α和β鏈表達(dá)序列示意圖。(B)HLA-DRB1*0405-hCLIPmut及其嵌合的多肽組成的蛋白復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)示意圖。HLA-DRB1*0405-hCLIPmut蛋白獲得成功表達(dá)4.蛋白；2：HLA-DRB1*0401-hCLIPmut蛋白(陽(yáng)性對(duì)照)；3：BSA(陰性對(duì)照)。一抗MouseAnti-DRL243Anti-mouseIgG-HRP，30000倍稀釋。對(duì)影響蛋白表達(dá)量的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化HLA-DRB1*0405-hCLIPmutαβ5和β3:28.4mg/L。5.α和β1：1；2：HLA-DRB1*0405-hCLIPmut0.01。多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)HLA-DRB1*0405蛋白分子可特異性結(jié)合hCII931-949多肽（Hemagglutinin）的HA306-318多肽作為陽(yáng)性對(duì)照，因?yàn)樵摱嚯囊呀?jīng)被證實(shí)為與HLA-DRB1*04分子結(jié)合力很強(qiáng)的主要抗原表位。如圖6AHLA-DRB1*0405和HLA-DRB1*0401HA308-316之間具有相似的結(jié)合力，hCII259-273多肽與HLA-DRB1*0401分子具有很強(qiáng)的結(jié)合力（IC50=26μM6B顯示hCII931-949與HLA-DRB1*0401分子之間的結(jié)合力非常弱（IC50=5223μM）,HLA-DRB1*0405分子卻具有很強(qiáng)的結(jié)合力（IC50=32μM。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)hCII931-949可特異性結(jié)合HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽序列的比對(duì)顯示P1P6P9P4hCII259-273多肽中P4（Glutamic被亮氨酸(Leucine，L)置換后用多（hCII259-273_P4E266LHLA-DRB1*0401（IC50=187hCII259-273HLA-DRB1*0401之間的結(jié)（IC50=26hCII259-273_P4E266LHLA-DRB1*0405hCII259-273_P4E266LHLA-DRB1*0405分子間的結(jié)合力（IC50=9μM）大幅度增強(qiáng)。(A)(B)(D)圖6. 多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及多肽序列比對(duì)。(A)HLA-DRB1*0401與5分子與II-73HA306-38(A)HLA-DRB1*0401與HLA-DRB1*0405分子與hCII931-949多肽的結(jié)合，HA306-318用來(lái)做陽(yáng)性對(duì)照(C)hCII259-273與hCII931-949多肽的序列比對(duì)。HLA-DRB1*0401 和 HLA-DRB1*0405 分 子 與 hCII259-273 和hCII259-273_P4E266L多肽的結(jié)合。P-2P1P4P8hCII931-949HLA-DRB1*0405分子結(jié)合的主要位點(diǎn)hCII931-949HLA-DRB1*0405分子結(jié)合的主要位點(diǎn)，我（Alanine替換的多肽類似物用來(lái)做多肽競(jìng)7P-2P1苯丙氨酸（Phenylalanine，F(xiàn)）P4亮氨酸（Leucine，L）P9甘氨酸（Glycine，G）位點(diǎn)的替換顯著降低了與HLA-DRB1*0405分子的結(jié)合，相反的，脯氨酸（Proline,P）P8hCII931-949HLA-DRB1*0405P-2、P1P4P8P9hCII931-949HLA-DRB1*0405分子結(jié)合的主要位點(diǎn)。7.由丙氨酸替換的多肽類似物與HLA-DRB1*0405氨酸在P-2、P1、P4P9位點(diǎn)的替換顯著降低了hCII931-949多肽與HLA-DRB1*0405P8hCII931-949多肽HLA-DRB1*0405分子的結(jié)合；其它位點(diǎn)的替換未引起結(jié)合力的改變。數(shù)據(jù)SD，,p<0.05;,p<0.01；,p<0.001。HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)8hCII931-949多肽復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)hCII931-949P1、P4、P6P9的錨定位點(diǎn)：P1935位點(diǎn)（eFP48P6和P9是分940943的甘氨酸（,GR的角度看，II-9多936P2-939位點(diǎn)的P5-谷氨酰胺（Glutamine，Q）942位點(diǎn)的脯氨酸（Proline,P）都朝向口袋凹槽TCR結(jié)合的極性不帶電的界面。8.HLA-DRB1*0405hCII931-949P1、P4、P6P9HLA-DRB1*0405分P2P5P8TCR作用的界面。PBMC體外刺激實(shí)驗(yàn)27A1ml/，2.2.8所述，從1ml全血中提取基因組DNA后送公司測(cè)序以篩選HLA-DRB1*0405RA9RA患者攜帶HLA-DRB1*0405等位基因，其中有四位陽(yáng)性患者和一位陰性患者愿意無(wú)償為10mlPBMC，通過(guò)多肽體外HLA-DRB1*0405等位基因的三位患者RA1、RA2RA3HA306-318多肽刺激產(chǎn)生IFN-gammaHLA-DRB1*0405等位基RARA4和健康對(duì)照（Healthycontrol，HC）對(duì)所加多肽沒(méi)有任何RA1RA3hCII931-949hCII931-945_P8HyPPBMChCII931-945_P8HyP多肽刺激產(chǎn)生IFN-gamma。9.PBMCPBMC1x106個(gè)細(xì)胞/9620μg/mlIL-296377天，IFN-gammaSD，,p<0.05;,p<0.01。討論RA是一種慢性、以炎性滑膜炎為主的系統(tǒng)性疾病。其特征是手、足小關(guān)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形及功能喪失。RA是一種多因素誘發(fā)的疾病，雖然不屬于遺傳性疾病，但其發(fā)病可能與遺傳因素有關(guān)。RA的發(fā)病有輕微的家族聚集傾向和孿RA的發(fā)病中起一定的作用。但是同卵100%30％～50％，而異卵雙生子則更低，5RA像高血壓、糖尿病一樣不是由單一基因所決定的。RAHLA-DR4RARA30%HLA-DRB1*0405等位基因，該基因已被證RAHLA-DRB1*0405基因攜帶者的A(HLA-DRB1*0405-)T細(xì)胞表位，該研究從結(jié)構(gòu)和功能上確定了一個(gè)CII來(lái)源的、HLA-DRB1*0405限T細(xì)胞表位。HEK293F細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)通過(guò)α/β鏈共轉(zhuǎn)染的方法成HLA-DRB1*0405ELISA,Westernblotting方法α/βHLA-DRB1*0401HLA-DRB1*0405二者在蛋白水平僅存在兩個(gè)氨基酸的差異：在第57位點(diǎn)，HLA-DRB1*0401分子是一個(gè)帶有負(fù)電的天冬氨酸（cd，DHLA-DRB1*005分子是一個(gè)不帶電的極性絲氨酸eS71位點(diǎn)，1分子是賴氨酸（sne，K，5分子是精氨酸（e，R，兩者都帶正電荷。已有研-1分子的TIHLA-DRB1*0405分子。于是，我們通過(guò)軟件預(yù)測(cè)及文獻(xiàn)報(bào)道初步確定了一條HLA-DRB1*0405T細(xì)胞表位，將其命名為hCII931-949。通過(guò)多肽競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這條多肽可與HLA-DRB1*0405HLA-DRB1*0401分子間的結(jié)合力卻非常弱。我們進(jìn)而對(duì)兩條多肽的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)P1、P6和P9P4hCII259-273的P4位點(diǎn)EI9的P4（-L，HLA-DRB1*0405HLA-DRB1*0401分子間的結(jié)合力大幅度降低，說(shuō)明P4HLA-DRB1與多肽間的相互作用起到至關(guān)重要的作用。HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽間的具體結(jié)合位點(diǎn)，我們得到了該復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。從晶體結(jié)構(gòu)圖可以看出，hCII931-949P1（Phe935）、P4(Leu938)、P6(Gly940)、P7(Leu941)和P9(Gly943)12HLA-DRB1*0405P2(Thr936)P3Gly937)P5Gln939)P8(Pro942)TCRTCR作用的殘HLA-DRB1*0401T細(xì)胞表位hCII259-273264位點(diǎn)的賴氨酸可被翻譯后修飾羥基化繼而被單TCRhCII931-949942可能hCII931-945_P8HyP。通過(guò)攜HLA-DRB1*0405RAPBMCT能就是THLA-DRB1*0405RAT細(xì)胞沒(méi)有被激活，很可能跟患者的病情嚴(yán)重程度有關(guān)。該研究首次從結(jié)構(gòu)和功能上鑒定了HLA-DRB1*0405限制型、CII特異性T細(xì)胞表位，在接下來(lái)的研究工作中，本項(xiàng)研究依然有幾個(gè)問(wèn)題需要解決：1）（）PBMC中的T細(xì)胞，體外經(jīng)多肽刺激后通過(guò)流式明確T我們會(huì)繼續(xù)針對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行研究和探討，通過(guò)HLA-DRB1*0405人源化轉(zhuǎn)基因小鼠模型，對(duì)篩選的T細(xì)胞表位對(duì)RA的致病性進(jìn)行深入研究，以望對(duì)將來(lái)疫苗的研發(fā)提供新的理論基礎(chǔ)。結(jié)論本研究從結(jié)構(gòu)和功能上鑒定了在亞洲RA患者中與RA密切相關(guān)的HLA-DRB1*0405分子的T細(xì)胞表位。主要工作如下：首次在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了具有結(jié)構(gòu)和功能的HLA-DRB1*0405分子。HLA-DRB1*0405hCII931-949多肽之間的結(jié)合。HLA-DRB1*0405hCII931-949RAPBMC體外刺激實(shí)驗(yàn)確定了T細(xì)胞表位。RA個(gè)性化疫苗的研發(fā)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。致謝201004博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（201659512，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究前期啟動(dòng)項(xiàng)目（QD2017N005）的經(jīng)費(fèi)支持。首先，非常感謝瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)炎癥研究中心許秉澤博士在蛋白表達(dá)和純化方面的指導(dǎo)；感謝葛長(zhǎng)榮博士在蛋白結(jié)晶方面的工作。感謝藥學(xué)院抗炎免疫藥理學(xué)教研室李曉娟教授和NandakumarKuttySelva教授的關(guān)心和幫助。感謝原創(chuàng)性抗炎藥物研發(fā)團(tuán)隊(duì)周春老師，博士研究生童冬梅，碩士研究生林曉吟、覃桂城、梁培彬等對(duì)研究工作的協(xié)助；感謝李露和曾嘉琪在行政方面的工作。感謝珠江醫(yī)院風(fēng)濕科于清宏主任和梁碧波醫(yī)生，檢驗(yàn)科周韶松醫(yī)生和黃永紅護(hù)士在臨床樣品收集工作上的鼎力協(xié)助。感謝曾經(jīng)一起入站的博士后張?jiān)?、王雪兒和張海鷹博士在學(xué)術(shù)上的探討及分享。RikardHolmdahl教授對(duì)士后工作和生活的關(guān)懷及照顧。參考文獻(xiàn)RowleyMJ,WilliamsonDJ,MackayIR.Evidenceforlocalsynthesisofantibodiestodenaturedcollageninthesynoviuminrheumatoidarthritis.ArthritisRheum1987;30:1420-5.LindhI,SnirO,LonnblomE,UysalH,AnderssonI,NandakumarKS,etal.TypeIIcollagenantibodyresponseisenrichedinthesynovialfluidofrheumatoidjointsanddirectedtothesamemajorepitopesasincollageninducedarthritisinprimatesandmice.ArthritisResTher2014;16.MichaelssonE,AnderssonM,EngstromA,HolmdahlR.Identificationofanimmunodominanttype-IIcollagenpeptiderecognizedbyTcellsinH-2qmice:selftoleranceatthelevelofdeterminantselection.Europeanjournalofimmunology1992;22:1819-25.KjellenBrunsbergU,BroddefalkJ,HansenB,M,IvarssonI,etal.ThestructuralbasisofMHCcontrolofcollagen-inducedarthritis;bindingoftheimmunodominanttypeIIcollagen256-270glycopeptidetoH-2AqandH-2Apmolecules.Europeanjournalofimmunology1998;28:755-67.GregersenPK,SilverJ,WinchesterRJ.Thesharedepitopehypothesis.Anapproachtounderstandingthemoleculargeneticsofsusceptibilitytoarthritis.Arthritisandrheumatism1987;30:1205-13.LeeHS,LeeSongGG,KimHA,KimBaeSC.Increasedsusceptibi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