第十六章 心肌損傷標志物檢驗

第十六章

心肌損傷標志物檢驗

第一節(jié)概述

第二節(jié)心肌損傷標志物的選擇與評價第三節(jié)心肌損傷標志物測定第一節(jié)概述

心臟是人體最重要的器官之一，它與血管組成人體的血液循環(huán)系統(tǒng)。擔負著氧、二氧化碳、營養(yǎng)物質、中間代謝產物、激素等物質的運輸。急性心肌梗死（AMI）是最常見的疾病之一，且發(fā)病率呈逐年增加的趨勢。急性心肌梗死的早期診斷對于治療是非常重要的。一、心臟的結構和功能

(一)心臟的解剖與生理

心臟分為左心和右心，被房間隔和室間隔分開。左心室→主動脈→毛細血管→下腔靜脈→右心房（體循環(huán)）。右心室→肺動脈→肺泡毛細血管→肺靜脈→左心房（肺循環(huán)）。

（二）心肌的超微結構心肌細胞占心臟重量一半以上，細胞內含有大量的肌原纖維和高度發(fā)達的肌管系統(tǒng)。肌原纖維由粗肌絲和細肌絲構成。粗肌絲主要由肌球蛋白分子組成。每條粗肌絲約有200～300個肌球蛋白分子，每個肌球蛋白分子又分為頭、頸和尾三部分，形如豆芽。頭部尾部肌球蛋白頸部細肌絲由肌動蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白（Tn）三種蛋白組成。在細肌絲中，肌動蛋白單體聚合成雙股螺旋鏈，構成細肌絲的主干。肌動蛋白單體聚合成雙股螺旋鏈

肌球蛋白和肌動蛋白因能直接參與心肌的舒縮故稱為收縮蛋白，占肌原纖維蛋白的80%左右。原肌球蛋白和肌鈣蛋白不直接參與收縮，但在心肌收縮過程中起著重要調節(jié)作用故稱為調節(jié)蛋白。二、心臟疾病的診斷心臟疾病的診斷技術常用的有物理診斷（心電圖、超聲心動圖、核素心血管造影、CT等）和化學診斷（酶類標志物、蛋白類標志物測定等）。

（一）冠心病的定義冠狀動脈性心臟病簡稱冠心病，又稱缺血性心臟病，指各種原因使冠狀動脈管腔狹窄或阻塞，導致心肌缺血、缺氧而引起的心臟病。

（二）冠心病的分型

根據冠狀動脈病變的部位、范圍和程度的不同，1979年WHO將冠心病分為五型：隱匿型（無癥狀）、心絞痛型、心肌梗死型、缺血性心肌病型和猝死型。在動脈硬化初期，當血管腔狹窄＜50%時，由于冠狀動脈有較強的儲備能力，心肌的血液供應未受影響，病人無癥狀。當冠狀動脈管腔狹窄＞50%～75%，安靜時尚能代償，而運動、心動過速、情緒激動造成心肌需氧量增加時，導致短暫的心肌供血不足，表現(xiàn)為心絞痛；若病人休息時也出現(xiàn)心絞痛，且持續(xù)時間較長（＞10min），則表現(xiàn)為不穩(wěn)定性心絞痛；若病情繼續(xù)進展，某支冠狀動脈閉塞，血供急劇減少或中斷，其供血區(qū)域心肌因持久性缺血而發(fā)生局部壞死，稱急性心肌梗死（AMI）。AMI因發(fā)病急，常致心源性猝死。（三）急性心肌梗死的診斷標準

血液生化檢查對缺血性心臟疾病的診斷和治療提供了重要的實驗室依據。急性心肌梗塞（AMI）是心臟疾病中的主要疾病，發(fā)病急和死亡率較高，早期診斷困難。1969年，WHO規(guī)定AMI的診斷必須滿足下面的兩條：

1.典型的病史和長期的胸痛；2.明顯的心電圖改變；3.心肌酶的異常。但是酶類標志物存在特異性較差等不足，新的生化標志物心肌肌鈣蛋白在靈敏度和特異性方面均優(yōu)于酶學測定，因此，WHO診斷標準的第三條受到了挑戰(zhàn)。2000年，歐洲心臟病學會（ESC）和美國心臟病學會（ACC）修訂了AMI的診斷標準，將心肌損傷標志物（心肌肌鈣蛋白，cTn）的異常變化作為診斷AMI的必要條件。

心肌損傷時的血中生化標志物檢測值異常是急性心肌梗死（AMI）的主要診斷標準之一。一般認為，反映急性心肌損傷的理想的生化標志物應具備的特點主要有：高度心臟專一性；心肌損傷后很快增高；增高后持續(xù)較長時間；容易檢測；可很快得到檢測結果（在1小時內）；其診斷價值已經臨床證實。迄今為止，尚無完全符合上述要求的標志物。第二節(jié)心肌損傷標志物的選擇與評價

酶類標志物

蛋白類標志物LDH及同工酶CK及同工酶AST心肌肌鈣蛋白肌紅蛋白心肌損傷標志物一、血清酶標志物

20世紀50年代LDH、AST、HBDH用于AMI的診斷。20世紀60年代肯定CK在診斷AMI中特異性更高。20世紀70年代發(fā)現(xiàn)CK-MB特異性更高。是公認的診斷AMI的“金標準”。

（一）天冬氨酸氨基轉移酶自1954年發(fā)現(xiàn)AMI患者血清中天冬氨酸氨基轉移酶（AST）升高，而使AST成為診斷AMI的第一個血清酶標志物。AST分布較廣，主要存在于肝臟、心臟、骨骼肌和腎臟。AST有兩種同工酶，胞漿型（AST-s）和線粒體型（AST-m）。在AMI發(fā)作6~8小時，血清中AST-s酶活性增強，當出現(xiàn)AST-m酶時表明心肌細胞損傷嚴重?！緟⒖挤秶?/p>

AST：0－40U/L【臨床意義】既往認為AST主要存在于心肌中，主要用于診斷AMI。但目前由于AST在AMI時升高遲于CK，恢復早于LDH，故診斷AMI價值越來越小，國外不少學者認為診斷AMI，完全可以不測AST。

（二）乳酸脫氫酶及同工酶LDH是由兩種亞基（H和M）組成的四聚體，有五種同工酶，心肌細胞中的LDH主要是LDH1。LDH1活性增高可作為診斷心肌梗塞的一個有用指標。心肌梗塞發(fā)生后24～48小時，LDH1開始升高，2～4天達到高峰，8～9天恢復正常。LDH1/LDH2比值＞1.0是AMI的特異性指標，且持續(xù)時間可達半個月左右，特別適用于就診較晚的病人。

【測定方法】

乳酸脫氫酶根據催化反應方向的不同，有兩大類測定LDH方法，一大類為國際臨床化學協(xié)會（IFFC）推薦方法，以丙酮酸為底物；另一大類以乳酸為底物，在我國應用較普遍?！緟⒖挤秶縇DH：成人120～130U/L（L→P法）兒童140～260U/L（L→P法）LDH同工酶：成人LDH114%～26%；LDH229%～39%；LDH320%～26%；LDH48%～16%；LDH56%～16%；LDH1/LDH20.45～0.74；

【臨床意義】

LDH增高主要見于AMI、充血性心衰和心肌炎；還見于病毒性肝炎、肝硬化、原發(fā)性肝癌、梗阻性黃疸、肌肉損傷、肌萎縮、某些惡性腫瘤（白血病，結腸癌……）等。AMI在常測酶中，LDH升高最慢（8～10h），但升高時間最長（5～10d），峰值可達10倍正常上限。在LDH同工酶中LDH1＞LDH2，并可持續(xù)到兩周（部分病例總LDH正常）。

（三）肌酸激酶及同工酶主要存在于骨骼肌和心肌細胞，是由一個M亞基和一個H亞基組成的二聚體，有三種同工酶；CK-MM，CK-MB，CK-BB。心肌中CK-MB的活性是骨骼肌的5倍。CK-MB分子量86000，一般在AMI發(fā)病4～8小時升高，12～20小時達到高峰，由于它升高和消失都較另外的血清酶標志物早，特別是特異性和敏感性均較優(yōu)，七十年代初以來被公認為是診斷AMI的“金標準”。

【參考范圍】

CK：成年男性45～180U/L（37℃）

女性25～130U/L（37℃）

兒童75～540U/LCK-MB：10～25U/L或CK-MB/CK＜5%

【臨床意義】

CK及其同工酶是目前世界上臨床測定次數最多的酶，80年代初期統(tǒng)計分別達一億次和一千萬次。此酶測定主要用于早期診斷AMI和判斷溶栓治療的療效以及判斷疾病預后，特別在無Q波型AMI，此時心電圖無Q波變化，常需其它檢查來協(xié)助臨床醫(yī)師診斷和鑒別診斷AMI。

AMI常測定的酶中CK增高最早（4～8h），24h達峰值，2～3d恢復正常，中度升高，常在3000U/L以下。

CK-MB由于大量存在于心肌組織中，其它組織和器官中含量很少，所以CK-MB是目前診斷AMI的一個極其可靠的生化指標，特異性可達95％乃至更高。一般認為其靈敏度比CK總活性稍差，但也有文獻報道，約有12.5％AMI患者總CK不高，但CK-MB超過正常。

（四）AST、LDH和CK的特異性比較

（1）AST在心肌細胞中含量最多，但也大量存在于其它器官，故診斷特異性較低。（2）LDH分布廣泛，特異性不高，電泳分析LDH1可提高LDH的特異性。（3）CK在心肌細胞中的含量僅次于骨骼肌，CK分子量較小，且主要存在于胞漿中，故在發(fā)生AMI時，較其它酶更早進入血液。（五）AMI后心肌酶的時相變化急性心肌梗塞血清酶活力增高時間和倍數

酶延緩時間（小時）活力高峰期（小時）維持天數增高倍數CK-MB3～816～241～420總CK4～1020～303～610AST4～1020～303～61LDH6～1230～607～146AST-m8～124884（六）心肌酶的生理變異1.性別

CK在男女之間有明顯差異，男性明顯高于女性，因CK主要存在于肌肉組織中，男性肌肉比女性發(fā)達。2.年齡新生兒血清LDH、CK為成人的2～3倍，隨年齡增長逐步降低，到14歲時達到成人水平。LDH1在兒童期比成人高，正常兒童可出現(xiàn)LDH1＞LDH2。3.運動劇烈運動可引起心肌酶升高，升高的程度和運動量及持續(xù)的時間有關，也與運動者是否經常鍛煉有關。二、蛋白類標志物

血清心肌酶的測定對AMI的診斷有一定的幫助，但仍存在許多不足；主要為：1.酶活性升高出現(xiàn)較晚，對AMI的早期診斷受到一定的限制。

2.持續(xù)時間短，AMI發(fā)生3天后CK即可恢復正常。3.特異性較差，其它組織的損傷也可導致心肌酶的升高。而現(xiàn)在發(fā)展起來的蛋白類標志物，如肌紅蛋白、肌鈣蛋白等對AMI的診斷明顯優(yōu)于酶類標志物。

（一）肌紅蛋白（Mb）

肌紅蛋白是存在于心肌和骨骼肌胞漿中的色素蛋白，不存在于平滑肌中，分子量為17500，半衰期約15分鐘。肌紅蛋白在AMI發(fā)病后1～4小時就可在血中檢測到增高，6～7小時達到峰值，是目前代表心肌損傷的升高最早的生化標志物之一。

肌紅蛋白無心肌特異性，但其心肌和骨骼肌中含量豐富，AMI時能迅速釋放入血，具有高度的敏感性。因此，肌紅蛋白的陰性有助于排除AMI的診斷。但其特異性較差。Mb的測定方法很多，主要有免疫化學法，如熒光免疫法、放射免疫法、酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光免疫法等。

（二）心肌肌鈣蛋白（cTn）

作為心肌損傷標志物，在臨床上已應用了多年（1987年用于AMI的診斷）。由于其高度的心肌特異性，對于心肌損傷的高度敏感性及較長的診斷窗口期，cTnI

已被國外臨床醫(yī)生及檢驗人員廣泛接受，正逐漸取代CK－MB，成為判斷心肌損傷，特別是診斷AMI的“金標準”。

在心肌細胞膜完整狀態(tài)下，cTnI、cTnT不能透過細胞膜進入血循環(huán)，故健康人血內不含或含極低量的cTnI和cTnT，當心肌缺血缺氧，發(fā)生變性壞死，細胞膜破損時，cTnI、cTnT彌散進入細胞間質，較早地出現(xiàn)在外周血中。心肌肌鈣蛋白在發(fā)病后出現(xiàn)較早（4小時），持續(xù)時間長（4～10天），而且對心肌損傷的敏感性和特異性都較高，故是目前診斷AMI較好的確定標志物。1994～1995年cTnT、cTnI分別被美國食品及藥品管理局（FDA

）批準用于臨床AMI診斷。

（三）CK-MB質量

1985年，Chan等首先報道了CK-MB質量分析的方法。CK-MB質量分析的方法測定其蛋白濃度（μg/L），避免了活力測定方法中可能遇到（如巨CK等）的干擾。CK-MB質量分析方法采用抗CK-M抗體和抗CK-B抗體或采用CK-MB抗體，適合于自動化分析，具有高度的靈敏性（最低檢測限<μg/L）和準確性，測定時間短（最快僅需7min），明顯優(yōu)于其他分析測定CK-MB的方法，1990年后逐漸被廣泛接受。

心肌損傷標志物的選擇心肌損傷標志物依其特點的不同可分為：

1.早期標志物

指在癥狀出現(xiàn)6小時內血液升高的標志物。Mb、CK、CK-MB、cTnT和cTnI可作為早期標志物，其中Mb是AMI發(fā)生后最早出現(xiàn)的標志物，AMI發(fā)生后0.5～2小時升高，CK和CK-MB是3～8小時，cTnT和cTnI是3～6小時。

2.中晚期標志物對癥狀發(fā)生后2～3天或更長時間的病人，可選擇中晚期標志物進行測定。LDH及其同工酶、cTnT和cTnI可作為中晚期標志物，AMI發(fā)生后，LDH及其同工酶升高可維持6～10天，cTnI可維持5～7天，cTnT可維持10～15天。而早期標志物Mb僅維持18～30小時，CK和CK-MB維持2～3天。3.排除標志物

可作為排除標志物的有Mb、cTnT和cTnI，Mb在癥狀出現(xiàn)早期為陰性一般可排除AMI，但癥狀出現(xiàn)晚期Mb陰性不能排除AMI，同樣，中晚期cTnT和cTnI不升高也不能完全排除AMI。

4.確證標志物

是指在癥狀出現(xiàn)后6～12小時升高，并能維持異常升高數天，且具有較高的靈敏度和特異性的標志物。cTnT和cTnI是目前認為最好的確證標志物。蛋白類標志物雖優(yōu)于心肌酶類標志物，但測定花費較高，而心肌酶分析價格低廉、方法成熟，也不失為有效的AMI輔助診斷指標。第三節(jié)心臟標志物的測定

一、肌酸激酶的測定（一）測定方法簡介CK測定的方法有化學法、酶法、熒光法和化學發(fā)光法，在臨床上廣泛應用的有化學法和酶法。1.肌酸顯色法在肌酸激酶的催化下，磷酸肌酸與ADP反應生成肌酸和ATP，生成的肌酸與雙乙酰、α-萘酚直接結合生成紅色化合物。磷酸肌酸＋ADP肌酸＋ATP肌酸＋雙乙酰＋α-萘酚紅色化合物540nmCK酶活力單位定義：1ml血清在37℃與底物作用1h產生1μmol肌酸為1個CK活性單位，若將此單位乘以1000/60可換算成國際單位（U/L）。方法簡便，試劑易得，靈敏度能滿足臨床要求，但特異性較低，顯色不穩(wěn)定。

2.酶偶聯(lián)法

在CK的催化下，磷酸肌酸與ADP反應生成肌酸和ATP；隨即在己糖激酶（HK）催化下，生成的ATP使葡萄糖磷酸化為6-磷酸葡萄糖（G6P）；再在6-磷酸葡萄糖脫氫酶催化下（G6PDH），6-磷酸葡萄糖與NADP+反應，生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH；在340nm波長下，監(jiān)測NADPH的生成速率。

【參考范圍】男性：46~171U/L(37℃)女性：34~145U/L(37℃)

【注意事項】1.總CK測定值超過2000U/L時，建議在測定CK前，采用不含CK的混合血清稀釋樣本，混合血清在56℃孵育2h后即不含CK，測定結果乘以稀釋倍數。因為血清中存在內源性的抑制劑，如用生理鹽水稀釋，CK活性將隨血清稀釋倍數的增加而增加。2.最好采用血清標本，肝素抗凝血漿亦可。勿用檸檬酸鹽、EDTA和氟化物作抗凝劑，否則會影響測定結果。3.紅細胞中不含CK，輕度溶血對測定無影響，但中度和重度溶血時，紅細胞釋放出腺苷酸激酶（AK）、ATP及6-磷酸葡萄糖等干擾測定的成分，影響測定結果。4.黃疸和脂血可干擾測定。

二、肌酸激酶測定的臨床意義肌酸激酶（CK）主要存在于骨骼肌、腦組織和心肌細胞中，血清CK活性測定主要用于心肌、骨骼肌和腦疾患的診斷和鑒別診斷及預后判斷。1.臨床上主要用于AMI的診斷。在AMI時，血清中CK活性可顯著升高，升高倍數為5～25倍，其增高的程度與心肌損傷的程度基本一致。但在心肌損傷，特別是急性心肌梗死時可顯著升高，為應用最廣泛的心肌損傷指標之一。3.骨骼肌疾病和損傷，CK活性極度升高，可高達參考范圍上限200倍。4.腦血管意外、腦膜炎等中樞神經系統(tǒng)疾患以及甲狀腺功能減退等均可致血清CK活性升高。5.某些藥物如拉貝洛爾、兩性霉素B、利多卡因、琥珀酰膽堿、奎尼丁、貝特類降血脂藥等亦可致CK活性升高。二、肌鈣蛋白的測定目前，臨床實驗室cTnT測定多采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA法），檢測試劑盒至今仍僅一個廠家生產，為德國Roche公司獨家專利；cTnI檢測方法較多，定性檢測采用膠體金免疫層析法，定量檢測多采用化學發(fā)光免疫法、ELISA法和免疫比濁法。（一）測定方法簡介1.膠體金免疫層析法快速檢測cTnI此法集免疫反應與色譜層析之特點，用膠體金代替酶標記抗cTnI，使待測樣品中cTnI與金-抗cTnI結合物結合，通過層析，在包被有抗cTnI處形成“抗cTnI-cTnI-金標抗體”夾心物而出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色水平帶。該方法最低檢出限為0.3μg/L。具有標本用量少，不需任何設備，易于操作，整個檢測過程在10min內即可完成。2.化學發(fā)光免疫法該法是采用針對cTnI的單克隆抗體建立的雙抗體夾心法。用單克隆抗cTnI抗體包被于固相載體磁性微粒上，作為捕獲抗體；用堿性磷酸酶（ALP）標記另一抗體，為檢測抗體；樣品中的cTnI（抗原）與此二抗體結合形成復合物；在反應體系中，加入磷酸酯發(fā)光劑（AMPPD），AMPPD在ALP催化下去磷酸化，生成具有熒光活性的物質。

3.免疫比濁法測定血清cTnI在溶液中，抗原抗體按一定比例反應時，形成抗原抗體免疫復合物，均勻分散在溶液介質中，光線通過溶液時，混濁液內的顆粒能夠吸收光線，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比。目前，測定血清cTnI普遍采用膠乳增強免疫比濁法，這是新一代免疫測定技術，膠乳使抗原抗體復合物體積增大，大大提高了免疫比濁法的敏感性，最低檢出限達到了ng/ml水平。

4.ELISA法測定