TCAAA 113-2023 梅花鹿體細胞冷凍技術(shù)規(guī)范

ICS65.020.30T/CAAA113—2023梅花鹿體細胞冷凍技術(shù)規(guī)范2023-10-10發(fā)布2023-11-30實施中國畜牧業(yè)協(xié)會發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國畜牧業(yè)協(xié)會提出并歸口。本文件起草單位：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)、哈爾濱工業(yè)大學(xué)、哈爾濱博蒙生物科技有限公司、黑龍江普惠特產(chǎn)有限公司、黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院?！疚募饕鸩萑耍喉n歡勝、王雪、郭喜明、鄭家三、許艷麗、張愛忠、趙樹臣、徐馨、趙曉靜、王偉、梁宇祥、柴孟龍、道楞、趙育國、孫義樂、王敏、史文清、韋春波、張瑩、李美鑫、賈志英、王崢、宋軍、杜佩澤、尚念鵬、張馨元、張巖、彭新宇、王紀元?！?梅花鹿體細胞冷凍技術(shù)規(guī)范本文件規(guī)定了梅花鹿體細胞冷凍的基本要求、組織采集前準備、組織采集、組織運送、細胞培養(yǎng)、細胞冷凍保存、細胞復(fù)蘇、細胞質(zhì)量檢測、細胞貯存與檔案管理。本文件適用于梅花鹿體細胞遺傳資源的冷凍保存。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。NY/T1900畜禽細胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1細胞原代培養(yǎng)primarycellculture直接從機體取出的細胞、組織和器官分散成細胞后進行的首次培養(yǎng)。3.2細胞傳代培養(yǎng)cellsubcultureculture將培養(yǎng)的細胞分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿(瓶)內(nèi)，再繼續(xù)培養(yǎng)的過程。3.3細胞系cellline原代細胞培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后所增殖的細胞群體，可泛指一般可能連續(xù)傳代的細胞。將體外培養(yǎng)細胞與凍存液按一定比例混勻后，按設(shè)定的降溫速率降溫，使其于液氮中長期保存的過程。4縮略語下列縮略語適用于本文件。FBS:胎牛血清(fetalbovineserum)PBS:磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline)5基本要求5.1實驗室應(yīng)干凈、清潔、無菌，滿足細胞培養(yǎng)條件。5.2細胞樣品處理、培養(yǎng)和凍存操作應(yīng)在生物安全柜中進行。5.3用于體細胞凍存的鹿應(yīng)臨床健康，經(jīng)檢疫無法定動物疫病。5.4操作人員應(yīng)嚴格消毒，做好防護，戴手套、口罩，穿工作服。6組織采集前準備應(yīng)調(diào)試設(shè)備，準備消毒器械，配制試劑，具體參見附錄A。2T/CAAA113—20237組織采集7.1采集鹿耳緣(尖)組織。7.2采樣前應(yīng)對鹿進行機械保定或麻醉保定。7.3鹿保定好后按實際采樣組織面積的1.2倍用剃毛工具除凈采樣部位耳毛。7.4按75%酒精→5%碘酒→75%酒精→生理鹽水的先后順序，對剃毛后的采樣部位進行消毒脫碘清洗。7.5用采樣鉗快速剪取耳緣(尖)組織樣。7.6將組織樣本用75%酒精噴霧消毒，并快速放入含有2%雙抗的PBS中涮洗3遍。7.7將涮洗后的組織樣快速的放入含有2%雙抗的PBS的15mL的離心管中，用封口膜封口。7.8記錄樣本名稱、性別、年齡、采樣地點、采樣部位、個體編號及采樣時間等信息，具體參見附8組織運送將封存好的組織樣放入保溫箱冷藏條件下4h內(nèi)運回實驗室，盡快進行原代培養(yǎng)。9細胞培養(yǎng)9.1原代培養(yǎng)9.1.1將組織樣放入培養(yǎng)皿再次消毒，用含有2%雙抗的PBS中洗滌3次。9.1.2在皿中用鑷子進一步去掉組織塊表皮上的耳毛。9.1.3用PBS清洗后將組織塊轉(zhuǎn)移到新皿中，剪成1mm3左右的碎塊。9.1.4用1.6mg/mL的膠原酶IV在37℃的恒溫水浴搖床上消化30min后取出，間隔5min晃動一次。9.1.5將終止消化的組織塊移入到15mL離心管中，在1200r/min條件下離心5min。9.1.6離心后用含10%FBS培養(yǎng)液將組織塊重懸接種到24孔板中。9.1.7將培養(yǎng)板放入5%CO?、37.0℃的飽和濕度培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。9.1.8隔天換液，重新加入含10%FBS培養(yǎng)液，2d后原代細胞培養(yǎng)至鋪滿24孔板底部停止換液。9.1.9停止換液后按正常程序繼續(xù)培養(yǎng)。9.2傳代培養(yǎng)9.2.1原代培養(yǎng)中細胞增殖至培養(yǎng)板底壁80%～85%時，可進行傳代培養(yǎng)。9.2.2棄掉培養(yǎng)液，用PBS清洗后加入0.25%胰蛋白酶，在37.0℃下消化3min～5min。9.2.3在顯微鏡下觀察，當(dāng)細胞由梭形變?yōu)閳A形時立即添加含10%FBS培養(yǎng)液終止消化，制成細胞懸9.2.4將細胞懸液移至離心管中，1000g離心5min后棄去上清，用含10%FBS培養(yǎng)液重懸細胞。9.2.5用血球計數(shù)板或細胞計數(shù)儀計數(shù)細胞，調(diào)整細胞密度為5.0×10?個/mL,按本文件9.1的條件進行傳代培養(yǎng)。10細胞冷凍保存10.1對數(shù)生長期的細胞在凍存前24h應(yīng)更換新鮮全培養(yǎng)液。10.2按原代細胞消化方法逐步處理細胞，用PBS清洗胰酶消化，制備成單細胞懸液。10.3將細胞懸液收集于15mL離心管中，1000g離心5min后棄去上清。10.4逐次加4℃預(yù)冷的凍存液，用血球計數(shù)板計數(shù)調(diào)整密度到1.0×105個/mL～5.0×105個/mL。10.5輕輕吹打使細胞重懸，將細胞懸液按每管1mL標(biāo)準分裝在凍存管中，嚴密封口。10.6在凍存管上按附錄B編號方法，標(biāo)明細胞名稱、凍存管編號、性別、凍存日期、代次等。10.7將凍存管投入凍存盒中-80℃過夜后，液氮中保存。10.8做好相應(yīng)記錄，記錄表參見附錄C。11細胞復(fù)蘇311.1從液氮中取出細胞凍存管，快速投入37℃~40℃水浴中不斷搖動，待冷凍液徹底解凍后取出，用75%酒精消毒凍存管。11.2吸出細胞懸液，放入離心管中，加入10倍體積的細胞培養(yǎng)液，1000g/min離心5min,棄上清，再重復(fù)清洗一次，重懸。11.3將細胞稀釋至所需濃度，進行培養(yǎng)。12細胞質(zhì)量檢測應(yīng)按NY/T1900規(guī)定的方法進行。13細胞貯存抽檢細胞復(fù)蘇后細胞存活力≥75%可進行貯存。14檔案管理4T/CAAA113—2023序號品名單位數(shù)量規(guī)格1手術(shù)剪個22剃毛剪/打毛剪個13手術(shù)刀個24一次性手套/口罩包適量5鑷子把適量675%酒精棉球瓶適量7碘酒棉球瓶適量82%雙抗PBS溶液適量9生理鹽水瓶適量75%酒精瓶適量麻醉藥/蘇醒藥盒適量無菌離心管個適量冰袋袋適量保溫箱個1超凈工作臺個1CO?培養(yǎng)箱臺1恒溫水浴鍋臺1顯微鏡臺1消毒剪刀把1離心機臺1液氮灌個2酒精燈個1移液槍把適量細胞計數(shù)板個適量冰箱臺1細胞凍存管個若干工作服件適量記號筆支適量消毒刀片個適量封口膜包適量24孔培養(yǎng)板個若干培養(yǎng)皿個若干離心管包若干新吉爾滅消毒液瓶適量PBS溶液細胞凍存液膠原酶消化液0.25%胰蛋白酶10%FBS培養(yǎng)液5(資料性)細胞凍存管編號方法B.1細胞凍存管編號方法細胞系命名采用6級命名法，細胞凍存管編號由物種代號、品種代號、性別代號、采樣組織代號、細胞系編號、培養(yǎng)代數(shù)六部分九位字母和數(shù)字組成，排列順序如下：細胞系編號、培養(yǎng)代數(shù)六部分九位字母和數(shù)字組成，排列順序如下：XXXXXXXX細胞系編號采樣組織代號性別代號一品種代號注1:物種代號由一位大寫字母組成，應(yīng)由物種英文名稱首字母代表，如梅花鹿英文名Sikadeer由S代表。注2:品種代號：由二位大寫字母組成，應(yīng)由品種名漢字字母代表，8個梅花鹿品種對應(yīng)的代號為吉林梅花鹿(JL)、雙陽梅花鹿(SY)、西豐梅花鹿(XF)、東豐梅花鹿(DF)、四平梅花鹿(SP)、興凱湖梅花鹿(XK)、敖東梅花鹿(AD)、東大梅花鹿(DD)。注3:性別代號：由二位數(shù)字組成，公鹿應(yīng)由數(shù)字11代表、母鹿應(yīng)由數(shù)字12代表。注4:采樣組織代號：由一位大寫字母組成，應(yīng)由采樣組織的英文名首字母代表，如耳組織由E代表。注5:細胞系編號：由一位數(shù)字組成，應(yīng)與細胞系對應(yīng)，如1細胞系第用1代表。例：同一物種同一性別，取3頭不同的個體耳緣組織，就有3個細胞系。注6:培養(yǎng)代數(shù)：由一位大寫字母和一位數(shù)字組成，傳代培養(yǎng)應(yīng)用F代表，傳代培養(yǎng)的代數(shù)應(yīng)用數(shù)字代表，如第1代細胞用F1代表。示例：興凱湖品種梅花