TCSHB 0010-2024 豬瘟熒光PCR 快速檢測技術(shù)規(guī)范

T/CSHB河 北 省 版 權(quán) 協(xié) 會(huì) 團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/CSHB0010—2024豬瘟熒光PCR快速檢測技術(shù)規(guī)范TechnicalspecificationsforrapiddetectionofswinefeverusingPCR2024-7-22發(fā)布 2024-7-22施河省版協(xié)會(huì) 發(fā)布PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術(shù)語和定義 1縮略語 1試劑和材料 2儀器與設(shè)備 2樣品采集與處理 3檢測 4存儲(chǔ) 5前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由唐山怡安生物工程有限公司提出。本文件由河北省版權(quán)協(xié)會(huì)歸口。PAGEPAGE1豬瘟熒光PCR快速檢測技術(shù)規(guī)范范圍本文件規(guī)定了豬瘟熒光PCR本文件適用于豬瘟快速檢測，適用于對(duì)臨床樣本中的豬瘟病毒（Classicalswinefevervirus，CSFV）RNA進(jìn)行定性檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。NY/T541 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存于運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范GB/T27540-2011 豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測方法術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。擴(kuò)增Amplification指基因擴(kuò)增，細(xì)胞內(nèi)染色體上的某一個(gè)基因選擇性地拷貝數(shù)大量增加的現(xiàn)象。擴(kuò)增曲線AmplificationCurve指在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中，通過連續(xù)監(jiān)測反應(yīng)體系內(nèi)生物分子的濃度變化，得到的曲線圖?？s略語熒光PCR：熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction）FAM：6-羧基熒光素（6-carboxfluorescein）CSFV：豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus）RNA：核糖核酸（RibonucleicAcid）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethlpyrocarbonate）5試劑和材料除另有說明，所有試劑均為分析純，所有試劑均用無RNA酶的容器分裝。RNA核酸提取試劑盒PCR反應(yīng)液陽性對(duì)照品陰性對(duì)照品酶混合液DEPC水去離子水中加入0.1%DEPC，37°C作用1h，（121±2）°C，高壓滅菌15min。材料（含EDTA抗凝劑/儀器與設(shè)備核算提取儀4°C12000g以上渦旋震蕩儀6.4冰箱：2~8°C和-20°C以下6.5適用儀器試劑盒適用于ABI7000/7300/7500/7900ABIStepOnePlusSLAN-48P/96SRochelightCycler480、RochelightCycler96、AglientMX3000P/3005P、iCycleriQ、Bio-RadCFX96等熒光定量PCR儀。樣品采集與處理總則樣品采集、保存與運(yùn)輸按照NY/T541執(zhí)行，樣本類型為RNA病毒，且需在提取后盡快檢測。采樣人員采樣人員需經(jīng)過專業(yè)技術(shù)機(jī)構(gòu)培訓(xùn)、掌握采樣技術(shù)的人員實(shí)施。樣品采集全血樣品采集生豬樣品采集部位為豬耳緣靜脈或前腔靜脈血液，生豬采集2mL~5mL血液置于真空采血管（含EDTA抗凝劑）中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩Ｊ米訕悠凡杉脽o菌拭子在鼻腔內(nèi)或口腔內(nèi)輕輕擦拭并緩慢旋轉(zhuǎn)至少3周，或用無菌拭子輕輕擦拭眼分泌物后，將拭子置于DEPC水中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩?nèi)臟組織樣品采集采集適量肝、脾、肺組織樣品，并按1：5倍體積加入DEPC水，研磨勻漿，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆?。糞便樣品采集稱取適量糞便樣品置入無菌保存管中，密封后，4°C以下保存?zhèn)溆谩；铙w樣品采集樣品處理全血樣品處理血液混勻后，轉(zhuǎn)入容量為1.5mL滅菌離心管中，直接用于核酸提取。拭子樣品處理將含有鼻咽拭子或口腔拭子或眼分泌物拭子樣品，搖勻，保存管在渦旋震蕩儀上充分混合，在4°C以下3000rpm離心5min，取上清液，轉(zhuǎn)入1.5mL滅菌離心管中。內(nèi)臟組織和糞便樣品處理將含有組織或糞便勻漿液無菌保存管在渦旋振蕩儀上充分混合后，在4°C以下3000rpm離心15min，取上清液?；铙w組織樣品處理取適量樣本于研缽或組織勻漿器中充分研磨，3000rpm15min，取上清液。8檢測檢測方法核酸提取在樣本制備區(qū)進(jìn)行。按照GB/T27540-2011執(zhí)行。擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備在試劑存儲(chǔ)和準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。將試劑盒從-20°C冰箱取出，冰浴條件下融化，待其融化完全后，振蕩混勻，瞬時(shí)離心，并按表1體系，在0.2mLPCR管中配制反應(yīng)液。表1擴(kuò)增試劑配制成分體積CSFV-PCR反應(yīng)液19μL酶混合液1μL總體積20μL熒光PCR擴(kuò)增體系將提取的樣本RNA，取5μL上樣。PCR擴(kuò)增按如下步驟設(shè)置熒光定量PCR儀的程序：表2操作步驟步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)150°C5min1cycle295°C1min1cycle395°C5s40cycle62°C30s（采集熒光步驟）儀器檢測通道選擇：選擇FAM通道（Reporter：FAM）檢測CSFV；具體檢測通道設(shè)置可參照各儀器使用說明。檢測結(jié)果說明通過檢測樣本擴(kuò)增曲線和Ct值組合判定，陽性/陰性，具體數(shù)值如下：1Ct值2、結(jié)果判斷：如果檢測樣本有擴(kuò)增曲線且Ct值≤35，報(bào)告為CSFV檢測陽性。如果檢測樣本有擴(kuò)增曲線且35<Ct值<40時(shí)，需重新對(duì)樣本進(jìn)行檢測。若重復(fù)檢測結(jié)果顯示有擴(kuò)增曲