3.2基因工程的基本操作程序（第1課時(shí)）高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

3.2基因工程的基本操作程序1997年，我國(guó)政府首次批準(zhǔn)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉。到2015年，我國(guó)已育成轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉新品種100多個(gè)，減少農(nóng)藥用量40萬(wàn)噸，增收節(jié)支社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益450億元。

你知道轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉抗蟲(chóng)的機(jī)制是什么嗎？培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉與普通棉花

從社會(huì)中來(lái)蘇云金桿菌與載體拼接

普通棉花（無(wú)抗蟲(chóng)特性）棉花細(xì)胞抗蟲(chóng)棉提取表達(dá)Bt基因?qū)隑t基因重組DNA分子培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉的簡(jiǎn)要過(guò)程1.目的基因的篩選與獲取2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4.目的基因的

檢測(cè)與鑒定培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉一般需要哪些步驟？在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞性狀或獲得預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物等相關(guān)的基因。根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。資料：蘇云金桿菌通過(guò)產(chǎn)生蘇云金桿菌伴胞晶體蛋白（Bt抗蟲(chóng)蛋白），破壞鱗翅目昆蟲(chóng)的消化系統(tǒng)來(lái)殺死棉鈴蟲(chóng)?？茖W(xué)家將“殺蟲(chóng)基因”轉(zhuǎn)入棉花中，棉花產(chǎn)生Bt抗蟲(chóng)蛋白抵抗蟲(chóng)害。培育轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉用到的目的基因一、目的基因(1)定義：(2)實(shí)例：Bt抗蟲(chóng)蛋白基因（簡(jiǎn)稱(chēng)Bt基因）目的基因的篩選與獲取01

當(dāng)Bt抗蟲(chóng)蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲(chóng)腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲(chóng)死亡。相關(guān)信息P77：1.Bt抗蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)原理？2.抗蟲(chóng)棉中的Bt抗蟲(chóng)蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？

Bt抗蟲(chóng)蛋白只有在某類(lèi)昆蟲(chóng)腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒(méi)有特異性受體，因此，Bt抗蟲(chóng)蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響。1.較為有效的方法之一:隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，以及序列數(shù)據(jù)庫(kù)（GenBank）、序列比對(duì)工具（如BLAST）等的應(yīng)用，越來(lái)越多的基因的結(jié)構(gòu)和功能為人們所知，為找到合適的目的基因提供了更多的機(jī)會(huì)和可能。二、篩選合適的目的基因從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選。2.認(rèn)識(shí)基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法DNA測(cè)序儀核苷酸序列比對(duì)氨基酸序列比對(duì)1.人工合成目的基因。2.通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)來(lái)獲取目的基因。3.常用

PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。重點(diǎn)了解什么是PCR？將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入到受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。什么叫基因文庫(kù)？前提與方法：若基因較小、核苷酸序列已知，可通過(guò)DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。DNA合成儀目的基因的篩選與獲取01三.目的基因的獲取方法1.PCR的概念PCR是____________的縮寫(xiě)，是一項(xiàng)根據(jù)______

____的原理，在____提供參與DNA復(fù)制的_______與_______，對(duì)__________________進(jìn)行________的技術(shù)；①全稱(chēng)：______________________________②原理：______________________________③操作環(huán)境：__________________________④目的：______________________________⑤優(yōu)點(diǎn)：______________________________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外各種組分反應(yīng)條件目的基因的核苷酸序列大量復(fù)制聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因PCR擴(kuò)增儀控制溫度PCR由穆里斯等人于1985年發(fā)明，為此，穆里斯于1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。四、利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因結(jié)合體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，思考PCR的進(jìn)行需要哪些組分和條件？要點(diǎn)回顧:體內(nèi)DNA復(fù)制模板：原料：能量：酶：DNA的兩條母鏈4種游離的脫氧核苷酸解旋酶、DNA聚合酶復(fù)制特點(diǎn):①邊解旋邊復(fù)制②半保留復(fù)制堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（保證復(fù)制的準(zhǔn)確進(jìn)行）條件復(fù)制原則:子鏈的延伸方向：5'端→3'端

因?yàn)镈NA聚合酶只能從5'端向3'端延伸子鏈。ATP2.DNA復(fù)制所需的基本條件:參與的組分在DNA復(fù)制中的作用

解旋酶DNA母鏈合成DNA子鏈的原料催化合成DNA子鏈引物維持反應(yīng)體系pH穩(wěn)定提供DNA復(fù)制的模板斷開(kāi)氫鍵，打開(kāi)DNA雙鏈?zhǔn)笵NA聚合酶能夠從引物的3’端開(kāi)始連接脫氧核苷酸（體外用耐高溫的DNA聚合酶，如Taq酶）（體外用高溫代替）4種脫氧核苷酸DNA聚合酶緩沖溶液引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2什么是引物？3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈2引物可以是DNA單鏈，也可以為RNA單鏈，體內(nèi)的DNA復(fù)制通常以RNA單鏈為引物體外（PCR）一般以DNA單鏈為引物用于PCR的引物長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸。引物結(jié)合在模板鏈的3’端相關(guān)信息P77：3′5′為什么子鏈的延伸方向是5′→3′？DNA聚合酶3′5′模板鏈子鏈因?yàn)镈NA聚合酶不能頭開(kāi)始合成子鏈DNA，只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有鏈的3′-端為什么子鏈合成需要引物？01目的基因的篩選與獲取耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物緩沖溶液（一般添加Mg2+）3.PCR條件:四種脫氧核苷酸②激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶（2種）

①提供相對(duì)穩(wěn)定的pH環(huán)境與某些離子；實(shí)際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的原料，又可為DNA的合成提供能量。(實(shí)際是dNTP)要有一段已知目的基因的核苷酸序列PCR擴(kuò)增儀（PCR儀）——控制溫度（重點(diǎn)）1）變性（不需要解旋酶）：當(dāng)溫度上升到_______以上時(shí)，

斷裂，雙鏈DNA解聚為兩條

。

氫鍵單鏈DNA第一步：變性待擴(kuò)增的DNA片段3’3’5’5’3’5’3’5’變性90℃思考2：變性的溫度為何是90℃以上的一個(gè)溫度范圍，而不是95℃？因?yàn)樽冃缘臏囟扰c氫鍵的數(shù)量有關(guān)。當(dāng)氫鍵數(shù)量越多時(shí)，所需溫度就越高；反之，當(dāng)氫鍵數(shù)量越少時(shí)，所需溫度也就越低。01目的基因的篩選與獲取4.PCR反應(yīng)的過(guò)程思考1：變性破壞的是哪種化學(xué)鍵，是否需要酶？（重點(diǎn)）2）復(fù)性：當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過(guò)

與兩條單鏈DNA結(jié)合。

第二步：復(fù)性DNA引物3’5’3’5’堿基互補(bǔ)配對(duì)思考：為什么需要引物？引物結(jié)合在模板鏈的什么位置？①因?yàn)門(mén)aq酶不能頭開(kāi)始合成子鏈DNA②引物結(jié)合在DNA模板鏈

3'端位置，引導(dǎo)子鏈從5'端→3'端方向復(fù)制。引物15’3’引物25’3’4.PCR反應(yīng)的過(guò)程01目的基因的篩選與獲取由于DNA兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，序列不同，所以需?種引物。引物設(shè)計(jì)1.引物長(zhǎng)度：20-30個(gè)核苷酸2.引物自身不能互補(bǔ)配對(duì)3.兩種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì)（重點(diǎn)）3）延伸：當(dāng)溫度上升到______左右時(shí)，溶液中的4種____________在耐高溫的____________的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。

第三步：延伸引物1引物2Taq酶Taq酶3’5’3’5’脫氧核苷酸5’5’DNA聚合酶72℃3’3’3’3’思考1：為什么溫度要上升至72℃？思考2：Taq酶結(jié)合在引物的3’還是5’端？72℃是Taq酶的最適溫度Taq酶結(jié)合在引物的3’端01目的基因的篩選與獲取4.PCR反應(yīng)的過(guò)程思考3：延伸過(guò)程是否需要ATP供能不需要，由dNTP水解供能（重點(diǎn)）PCR反應(yīng)的過(guò)程、產(chǎn)物第一輪循環(huán)的產(chǎn)物第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物

由于一個(gè)循環(huán)得到的產(chǎn)物又可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，因而每一次循環(huán)后目的基因的量可以增加一倍。

即成指數(shù)形式擴(kuò)增（約為2n，其中n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）。01目的基因的篩選與獲取變性復(fù)性延伸

過(guò)程：PCR反應(yīng)的過(guò)程、產(chǎn)物第一輪循環(huán)的產(chǎn)物第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物01目的基因的篩選與獲取變性復(fù)性延伸

過(guò)程：（1）要保證目的基因能與載體相連接，還要對(duì)引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識(shí)別序列。3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2【問(wèn)題探究1】（2）若循環(huán)n次，理論上可獲得DNA數(shù)

，其中

含引物的DNA數(shù)

，含引物的DNA鏈數(shù)

，共需引物對(duì)數(shù)

。共需引物個(gè)數(shù)

。2n2n+1-22n+1-22n2n－1引物個(gè)數(shù)=新增單鏈數(shù)=2n+1-2若消耗了引物62個(gè),則進(jìn)行了幾輪的擴(kuò)增。5（2）如果循環(huán)n次，則共需消耗

對(duì)引物。

則共需消耗

個(gè)引物。2n－12n+1－2（3）兩種引物都結(jié)合在DNA模板鏈的

端；

脫氧核苷酸連接在引物的

端進(jìn)行延伸。3’3’5’DNA母鏈13’5’DNA母鏈23’5’引物13’5’引物2（4）設(shè)計(jì)引物的依據(jù)是？已知目的基因兩端（3’端）的部分核苷酸序列，以便根據(jù)該序列合成引物。

3’用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。1.逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交雙鏈；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子5’3’5’5’第一次循環(huán)第二次循環(huán)3’5’第三次循環(huán)3’3’【拓展思維】PCR技術(shù)獲取目的基因時(shí)至少要經(jīng)過(guò)幾次循環(huán)才能從DNA分子中分離出目的基因？【拓展思維】PCR擴(kuò)增的是整個(gè)模板DNA分子嗎？不是，PCR擴(kuò)增的是兩種引物之間所對(duì)應(yīng)的特定DNA片段活動(dòng)：構(gòu)建模型，模擬PCR獲取和擴(kuò)增目的基因的過(guò)程材料：扭扭棒，透明膠，剪刀提示：1、DNA分子兩條鏈反向平行2、引物是一段短單鏈核酸，可以定位目的基因的3′端3、DNA子鏈延伸的方向是從5′端到3′端4、新合成的子鏈可以用與母鏈不同顏色的扭扭棒表示3’5’3’5’3’5’5’3’（一）利用PCR在體外進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增①PCR利用了DNA的熱變性原理，通過(guò)調(diào)節(jié)溫度來(lái)控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合；PCR儀實(shí)質(zhì)上就是一臺(tái)能夠自動(dòng)調(diào)控溫度的儀器，一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。②PCR擴(kuò)增DNA片段還利用了DNA半保留復(fù)制的原理。探究?實(shí)踐DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定1.實(shí)驗(yàn)原理①PCR儀（自動(dòng)控溫，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增）②微量離心管（實(shí)際上是進(jìn)行PCR反應(yīng)的場(chǎng)所）③微量移液器（用于向微量離心管轉(zhuǎn)移PCR配方中的液體）④一次性吸液槍頭（微量移液器吸取一種試劑更換一次槍頭）PCR儀微量離心管微量移液器2.材料用具（一）DNA片段的擴(kuò)增推動(dòng)桿調(diào)節(jié)旋鈕卸槍頭按鈕體積刻度吸液桿槍頭（注意：加不同樣品時(shí)，需要更換槍頭）2.材料用具（一）DNA片段的擴(kuò)增10倍濃縮的擴(kuò)增緩沖液（含Mg2+）5μL20mmol/L的4種脫氧核苷酸的等量混合液1μL20μmol/L的引物Ⅰ2.5μL20μmol/L的引物Ⅱ2.5μLH2O28～33μL1-5U/μL的TaqDNA聚合酶（即耐高溫的DNA聚合酶）1～2U模板DNA（用量為1pg-1μg）5～10μL總體積50μL⑥PCR反應(yīng)體系的配方⑤4種脫氧核苷酸等量混合液、2種引物、TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴(kuò)增緩沖液、無(wú)菌水。注意：酶和緩沖液要在冰塊上緩慢融化，用后置于-20℃冰箱中保存。酶和緩沖液一般分裝成小份，避免反復(fù)融化導(dǎo)致活性降低甚至失活。2.材料用具3.方法步驟（一）DNA片段的擴(kuò)增①移液：②離心：③反應(yīng)：用微量移液器按照PCR反應(yīng)體系配方或PCR試劑盒的說(shuō)明書(shū)，在微量離心管中依次加入各組分待所有組分都加入后，蓋嚴(yán)離心管的蓋子，將微量離心管放入離心機(jī)里，離心約10s，使反應(yīng)液集中在離心管的底部（提高反應(yīng)速率）參照下表的參數(shù)，設(shè)置好PCR儀的循環(huán)程序。將裝有反應(yīng)液的微量離心管放入PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。循環(huán)程序變性復(fù)性延伸預(yù)變性94℃,5min//30次94℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次94℃,1min55℃,30s72℃,1min

使DNA充分變性，以利于引物更好地和模板結(jié)合?？筛鶕?jù)目的片段長(zhǎng)度適當(dāng)調(diào)整延伸時(shí)間PCR實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程①DNA分子具有_____________，在一定的___下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場(chǎng)的作用下，這些帶電分子會(huì)向著__________________的電極移動(dòng)，這個(gè)過(guò)程就是_____；可解離的基團(tuán)pH電泳與它所帶電荷相反②PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)__________________來(lái)鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、________________和_____等有關(guān)④凝膠中的DNA分子通過(guò)_____，可以在波長(zhǎng)為_(kāi)_______的______下被檢測(cè)出來(lái)。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度染色300nm紫外燈DNA分子的大小構(gòu)象（二）利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物1.實(shí)驗(yàn)原理：一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便向正極泳動(dòng)。DNA分子質(zhì)量越小，遷移速率越快常用的核酸染色劑有EB（溴化乙錠）②鑒定方法：PCR的產(chǎn)物一般通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定。瓊脂糖來(lái)源于紅藻的多糖，其主要成分為多聚半乳糖，瓊脂糖在水中一般加熱到90℃以上溶解，溫度下降到35-40℃時(shí)形成良好的半固體狀的凝膠。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（孔徑），孔徑大小與瓊脂糖凝膠濃度有關(guān)，濃度越高，孔徑越小，能夠通過(guò)的核酸分子越小。（二）利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物1.實(shí)驗(yàn)原理：核酸染色劑常用的核酸染色劑有EB（溴化乙錠）等，EB能插入DNA分子中的堿基對(duì)之間，導(dǎo)致EB與DNA結(jié)合。嵌入核酸堿基間的EB能吸收300nm波長(zhǎng)的紫外光，發(fā)出可見(jiàn)熒光。其熒光強(qiáng)度與DNA分子的含量成正比。1.實(shí)驗(yàn)原理分子量大（長(zhǎng)片段）分子量?。ǘ唐危㎝arker:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)一般使用的電泳緩沖液pH=8，DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中DNA便向正極泳動(dòng)。DNA分子質(zhì)量越小，遷移速率越快加樣孔應(yīng)連在電極的哪一極2.材料用具電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）（二）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液

根據(jù)待分離DNA片段的大小，用電泳緩沖液配制瓊脂糖溶液，一般配制質(zhì)量體積比0.8%-1.2%的瓊脂糖溶液。在沸水浴或微波爐內(nèi)加熱至瓊脂糖熔化。稍冷卻后，加入適量的核酸染料混勻②制備凝膠

將溫?zé)岬沫傊侨芤貉杆俚谷肽＞?，并插入合適大小的梳子，以形成加樣孔。將電泳緩沖液加入電泳槽中，電泳緩沖液沒(méi)過(guò)凝膠1mm為宜。待凝膠溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝膠放入電泳槽內(nèi)。③加樣

將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。④電泳⑤觀察記錄3.方法步驟梳子孔為加樣孔③加樣：將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物與凝膠載樣緩沖液（內(nèi)含指示劑）混合，再用微量移液器將混合液緩慢注入凝膠的加樣孔內(nèi)。留一個(gè)加樣孔加入指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）。①常使用一種有顏色的標(biāo)記物指示樣品遷移的速率及方向；②使樣品呈現(xiàn)顏色，便于加樣。標(biāo)準(zhǔn)參照物（Marker）DNAMarker是已知分子質(zhì)量的DNA片段，在實(shí)驗(yàn)時(shí)和樣本DNA同時(shí)進(jìn)行凝膠電泳，通過(guò)對(duì)比兩者的遷移速率，可以大致估計(jì)樣本DNA的大小。④電泳（二）DNA片段的電泳鑒定①配制瓊脂糖溶液②制備凝膠③加樣接通電源，根據(jù)電泳槽陽(yáng)極至陰極之間的距離來(lái)設(shè)定電壓，一般為1～5V/cm。待指示劑前沿遷移接近凝膠邊緣時(shí)，停止電泳⑤觀察記錄取出凝膠置于紫外燈下觀察和照相熒光染色電泳結(jié)果照片①為避免外源DNA等因素的污染，PCR實(shí)驗(yàn)中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進(jìn)行高壓滅菌處理。②該實(shí)驗(yàn)所需材料可以直接從公司購(gòu)買(mǎi)，緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份，并在-20