醫(yī)學培訓課件 第12章 固相膜免疫測定

第十二第一節(jié)概述一、免疫測定分類二、免疫測定原理三、固相免疫測定四、固相膜的特點五、常用的固相膜六、固相膜的技術要求第十二章固相膜免疫測定第二節(jié)免疫金標記技術一、膠體金的制備第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理一、膜固相免疫測定的特點二、固相微孔膜測定種類三、免疫滲濾試驗和免疫層析試驗四、酶聯(lián)免疫斑點試驗五、免疫印跡六、放射免疫沉淀試驗思考題小結隨著免疫學技術和相關生物化學技術的發(fā)展，檢測方法上派生出了多種類型的固相膜免疫快速檢測試驗。該類試驗的最大特點是不需要大型設備，對檢測人員稍加培訓即能掌握操作要求和判定標準。

第一節(jié)概述標記免疫測定放射免疫測定1960’酶免疫測定1970’熒光免疫測定1980’－1990’化學發(fā)光免疫測定1990’－膜固相免疫測定1990’－一、免疫測定分類免疫濁度測定Ag+Ab

AgAb+Ab標記免疫測定

Ag+Ab*AgAb*+Ab*

（B）（F）二、免疫測定原理利用抗原抗體反應檢測標本中微量物質(zhì)抗原+抗體抗原抗體復合物

Ag+Ab

Ag*Ab三、固相免疫測定B與F分離

Ab*Ab*Ag+Ag+Ab*

Ab

Ab四、固相膜的特點多孔性

毛細管作用非共價鍵高度吸附抗體或抗原

高度敏感性易于漂洗

操作簡便五、常用的固相膜玻璃纖維素(fiberglass)膜尼龍(nylon)膜聚偏氟乙稀(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜六、固相膜的技術要求孔徑：0.2~0.6μm流速：以ml/cm2/min表示蛋白質(zhì)結合力：吸附力很強，以μg/cm2表示均一性固相NC膜第二節(jié)免疫金標記技術(Immunogold

labelling

techique)

是以膠體金作為標記物的免疫標記技術?；驹碛媒鹑苣z標記蛋白質(zhì)，膠體金顆粒具有高電子密度的特性，故在金標蛋白的抗原抗體結合處，顯微鏡下可見黑褐色顆粒；當這些標記物在相應的標記處大量聚集時，可在載體膜上呈現(xiàn)肉眼可見紅色或粉紅色斑點，從而用于抗原或抗體物質(zhì)的定位或定性。膠體金（colloidalgold）指金微小粒子（1－100nm）分散在溶液中所形成的金溶液。是由金鹽被還原成原金后形成的金顆粒懸液。也稱金溶膠（goldsolution）。技術類型：1.金免疫測定技術

2.金免疫組化技術一、膠體金制備

膠體金（colloidalgold）的制備一般采用還原法，常用的還原劑有檸檬酸鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼氫化鈉等。向一定濃度的金溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子還原成金原子，形成金顆粒懸液。

膠體金的制備方法

原理：向一定濃度的氯金酸溶液內(nèi)加入一定量的還原劑使金離子變成金原子，形成金顆粒懸液。

配HAuC14水溶液加熱沸檸檬酸三鈉攪動加熱沸（約2～3min*）冷卻加蒸餾水至原體積。見淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。通過改變檸檬酸鈉的用量可制得不同大小的膠體金顆粒

膠體金的制備及特性膠體金粒徑1%檸檬酸鈉加入量膠體金特性（nm)（ml)*呈色lmax(nm)162.00橙色51824.51.50橙紅色522411.00紅色52571.50.70紫色535*還原100ml0.01%HAuCl4所需量

制備膠體金的注意事項（1）氯金酸易潮解，應干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，不應使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）制備膠體金應用雙蒸/三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水。（4）玻璃容器必須是絕對清潔的，最好是經(jīng)硅化處理的。

膠體金的保存潔凈的玻璃器皿中可較長時間保存；少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。膠體金的鑒定：肉眼、分光光度計、電鏡等方法觀察應為清亮透明的液體若膠體金混濁或液體表面有漂浮物，則制備的膠體金有較多的凝集顆粒膠體金（ColloidalGold）

15~60nm優(yōu)質(zhì)劣質(zhì)免疫金的制備免疫金（immunogold）：是指膠體金與抗原或抗體等的結合物,在免疫組織化學技術中，習慣上要稱之為金探針。制備方法：

1.膠體金溶液的pH值調(diào)整

2．蛋白質(zhì)最適標記量的確定

3．標記過程

4．離心去除未結合的蛋白質(zhì)，反復洗滌2～4次

5.免疫金最終用稀釋液配成工作濃度保存

膠體金結合物（Conjugate）膜固相免疫測定的特點第三節(jié)膜載體免疫測定的種類與原理優(yōu)點不足之處簡便，快速敏感度略低，價格略高（與ELISA比）單份測定精密度較差，質(zhì)控困難保存期長（優(yōu)質(zhì)試劑）穩(wěn)定性較差（普通試劑）可測定物范圍廣（主要為定性試驗）不易制備定量、半定量試劑感染性疾病的診斷妊娠、排卵的診斷腫瘤標志；心肌標志；濫用藥物固相微孔膜測定種類斑點金免疫滲濾試驗(dotimmunogoldfiltrationassay,DIGFA)免疫層析試驗（immunochromatographyassay,ICA）斑點ELISA

(dotenzymelinkedimmunosorbentassay,Dot-ELISA)酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)

免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)

放射免疫沉淀試驗(radioimmunoprecipitationassay,RIPA)

一、斑點金免疫滲濾試驗

（dotimmunogodl

fitration

assay,DIGFA

原理：將抗原或抗體點加在固相載體NC膜上，制成的包被微孔濾膜貼置于吸水材料上，依次滴加在膜上的標本、免疫金、及洗滌液等液體很快滲入吸水材料中，最后陽性反應在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。

特點：快速、簡便、經(jīng)濟、無需特殊設備、已成為床邊檢測的主要方法之一。技術要點：技術類型：①雙抗體夾心法Ab

＋Ag（標本）＋金標抗體洗滌膜中央形成紅色斑點

②間接法Ag＋Ab（標本）洗滌＋金標抗抗體洗滌膜中央形成紅色斑點一、免疫滲濾測定(IFA)操作示意圖裝置分解圖蓋微孔膜吸水墊料底

DIGFA原理圖（三）技術要點1.試劑盒組成滴金反應板、塑料小盒、吸水墊料、包被了抗原或抗體的硝酸纖維素膜、膠體金標記物、洗滌液2.操作要點孔內(nèi)滴加標本，待完全滲入。孔內(nèi)滴加膠體金標記抗體，待完全滲入?？變?nèi)滴加洗滌液，待完全滲入。膜中央呈現(xiàn)紅色或粉紅色斑點為陽性。斑點深淺相應提示陽性強度。IFA——雙抗體夾心法測抗原AB加尿樣AC

陰性

陽性加膠體金標記抗體C

斑點金免疫滲濾試驗(IFA)除去濾器BD加洗滌液加尿樣A加尿樣AGIFA技術的發(fā)展（間接法測抗體）陽性陰性固相膜固相抗原待測抗體金標記抗人IgG抗體人IgG固相抗人IgG抗體快速檢測（滲濾法）原理圖IFA——結果判斷特點

NC膜對蛋白類物質(zhì)有很強的吸附作用，容易使Ag或Ab包被，封閉后，加待檢標本、酶標Ab、酶不溶性底物，陽性標本呈斑點顯色。原理是用膠體金標記技術和蛋白質(zhì)層析技術結合，以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術。滴加在膜一端的標本液受載體膜的毛細管作用向另一端移動，猶如層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體或抗原結合而被固相化，無關物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判定實驗結果。二、免疫層析測定immunochromatography

assay,ICA

ICA技術類型

①雙抗體夾心法

②競爭法

③間接法技術要點臨床應用及評價

①靈敏度不及酶標法和發(fā)光免疫測定法

②只能定性，不能作定量測定

③有“床邊檢驗”之稱

④用于正常體液中不存在或含量少物質(zhì)的測定ICA試劑條樣品墊結合物墊NC膜吸水墊DICA雙抗體夾心法原理圖金標抗體包被抗體抗金標抗體吸水紙標本？？（三）技術要點1.試劑盒組成：膠體金層析條2.原理：斑點金免疫層析雙抗體夾心法3.操作要點：斑點金免疫層析試驗（一）包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線

手持端包被兔抗鼠IgG包被鼠抗HCG單抗金標鼠抗HCG單抗尿液浸濕標志線

手持端尿樣陽性弱陽性陰性無效斑點金免疫層析試驗（二）DICA競爭法原理圖金標抗體包被抗原抗金標抗體吸水紙陽性結果標本？？？？ICA——間接法測抗體ICA結果觀察

陽性陰性無效DICA間接法原理圖窗吸水材料金標抗人IgG吸水材料吸水材料標本加樣區(qū)包被抗原為了消除待測標本中非特異性IgG與特異性IgG競爭結合金標抗人IgG，故測抗體常用“反流免疫層析法”①②標記線③④⑤合上檢測盒⑥⑥液體流動方向IFA與ICA的比較IFAICA試劑形式滲濾裝置及附加試劑試劑條試劑保存4~8℃6個月室溫一年操作步驟3~51觀察時間3min3~20min陽性反應顏色濃度操作結束顏色不變顏色逐漸加深IFA穿流（FLOWTHROUGH）ICA橫流（LATERALFLOW）GIFA技術的發(fā)展第一代

1988HIVCHEK（DuPont）單點，5~10分鐘，血清，金標試劑瓶裝凍干品改進抗原HIV1+2，提高敏感度和特異性，縮短反應時間，減少步驟，樣品多樣化。第八代INSTANTCHEKHIV1+22點（測試+控制）金標試劑：單人份、液體樣品：血清、血漿、全血、尿液第九~十二代研制中單一試劑ICA技術的發(fā)展1990年ABBOTT公司膠體硒標記ICA

Unipath公司CLEARVIEW立明衣原體彩色膠乳標記ICAROCHECardiacReader

TnT

定量0.1~3ng/ml

合成TnT質(zhì)控點IFA肌紅蛋白雙孔法

S：測定孔

C：定量質(zhì)控

100μg/LIFA微量白蛋白單孔法

T：測定孔

C1：定量質(zhì)控30mg/LC2：定量質(zhì)控200mg/L

結果判定：（-）<30（+）30~100、（++）

100～200（+++）>200mg/LICA甲胎蛋白（AFP）參考值：30μg/L肝癌診斷值：>400μg/L結果判定：（-）<30（+）30~200（++）200~400（+++）>400μg/LSCTC2C1測定線對照線半定量測定臨床應用及評價方法評價：

1.操作簡便、快捷、操作人員無需技術培訓、不需特殊設備、試劑穩(wěn)定、便于保存，特別符合“床邊檢驗”。

2.靈敏度不及酶標法和酶發(fā)光免疫測定法

3.不能準確定量，只能定性或半定量。

4.目前主要用于正常體液中不存在的物質(zhì)（傳染病抗原或抗體、毒品等）和正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)的檢測。如：HCG、AFP三、斑點酶免疫吸附試驗

——Dot-ELISA三、斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗斑點—酶聯(lián)免疫吸附試驗（dot-ELISA）屬于ELISA類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質(zhì)能力很強的硝酸纖維素（NC膜）作為固相載體。技術類型和方法要點1、間接法——測抗體NC膜+已知抗原干燥封閉加待測血清+酶標抗抗體洗滌加底物2、夾心法——測抗體NC膜+待測血清干燥封閉加特異性抗原+酶標抗體洗滌加底物3、雙抗體夾心法——測抗原NC膜+特異性抗體干燥封閉加待測血清+酶標抗體洗滌加底物4、直接法——測抗原NC膜+待測血清干燥封閉加酶標抗體洗滌加底物有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）無染色斑點（—）有染色斑點（+）無染色斑點（—）1~2ul2~5ul1~2ul2ul有染色斑點（+）無染色斑點（—）方法評價①操作簡便快速，結果判定不需特殊設備，適合基層使用。②特異性強，敏感性較ELISA高6~8倍③試劑用量少，較ELISA節(jié)約5~10倍④檢測結果可長期保存，利于復查；⑤本法只能做定性分析，不能做定量測定。四、酶聯(lián)免疫斑點試驗

——ELISPOT20世紀80年代，國外的科研工作者根據(jù)ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細胞和細胞因子分泌T細胞的酶聯(lián)免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。

ELISPOT檢測原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過CTL公司生產(chǎn)的ELISPOT酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結果。ELISPOT分析儀解決以下問題哪些斑點是抗原特異性T細胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關細胞產(chǎn)生的（此斑點沒有T細胞研究價值）斑點大小的意義在對不同細胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點最大和最小尺寸如何從單個細胞基礎上分析實驗精確度有多高？如果一個細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，在多大程度上會干擾分析結果？幾次重復實驗才能使結果更有意義？E