高中生物拓展：土壤中分離以尿素為碳源的微生物 高二下學(xué)期

土壤中分離以尿素為氮源的微生物張萍華2021.071、學(xué)習(xí)從土壤中分離細菌的方法。2、練習(xí)無菌操作技能。3、掌握微生物大分子水解試驗的原理與方法。實驗?zāi)康哪蛩厥且环N重要的農(nóng)業(yè)氮肥。但是，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當土壤中的細菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。

脲酶氨導(dǎo)致培養(yǎng)基pH升高。酚紅：pH6.8時為黃色；pH8.4時為粉紅色實驗原理CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3幽門螺桿菌（Helicobacterpylori）：Hp可產(chǎn)生高活性的尿素酶碳14、碳13呼氣試驗：碳13是穩(wěn)定同位素，無任何放射性

碳14檢測有微弱放射性菌落是指單個或少數(shù)細胞在固體培養(yǎng)基上大量生長繁殖時，所形成的肉眼可見的具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體。不同微生物形成的菌落具有不同的特征，是鑒定菌種的重要依據(jù)。

實驗原理培養(yǎng)基：是指人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。

用途：培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。

組成：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水

實驗原理種類：按照成分：天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)：固體、液體、半固體按照用途：培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物

配方：

LB培養(yǎng)基：蛋白胨1g,酵母提取物0.5g,氯化鈉1g,pH7.4-7.6，蒸餾水100mL（固體培養(yǎng)基加瓊脂粉2g）尿素培養(yǎng)基：葡萄糖1g,氯化鈉5g,磷酸氫二鉀5g,酚紅10mg瓊脂糖20g,脲80g總體積1000mL

實驗原理配制流程：

培養(yǎng)基的制備方法

稱量熔化調(diào)pH分裝加塞、包扎無菌檢查擱置斜面滅菌（121℃、20'）

實驗原理試管培養(yǎng)基的分裝實驗原理試管培養(yǎng)基的分裝實驗原理消毒與滅菌滅菌：是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。消毒：指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。1、加熱法：

干熱滅菌：火焰燒灼、熱空氣濕熱滅菌：高壓滅菌、常壓滅菌（煮沸消毒、巴氏消毒法、間歇消毒法）2、過濾除菌3、輻射滅菌4、化學(xué)藥品滅菌（環(huán)氧乙烷）

實驗原理高壓蒸汽滅菌基本原理

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，高于100℃，致使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。是濕熱滅菌中最好的方法，常用：1.05kg/cm2（溫度121oＣ），20－30min。

實驗原理高壓蒸汽滅菌步驟：1.加水；2.放置物品；3.加蓋和加熱；4.排凈冷空氣；5.滅菌：壓力0.103MPa，溫度121oＣ，20－30min；6.關(guān)閉、降壓0，打開；7.制成斜面。

1.土壤取樣2.制備培養(yǎng)基3.倒平板4.樣品稀釋5.微生物培養(yǎng)與觀察6.鑒定實驗方法與步驟1.土壤取樣取樣原因：土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”，含有大量微生物，而且種類最多。土壤要求：富含有機質(zhì)、pH接近中性且潮濕。取樣部位：距地表約3-8cm的土壤層。（可以增加液體培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)）實驗方法與步驟尿素：20%，過濾除菌115℃，30分鐘高壓蒸汽滅菌實驗方法與步驟2.制備培養(yǎng)基砂芯漏斗：漏斗的砂芯濾板由燒結(jié)玻璃料制成，可以過濾酸液和用酸類處理，也叫耐酸漏斗。根據(jù)其孔徑大小，砂芯濾板可分成G1~G6六種規(guī)格。G1:20-30μm濾除粗沉淀及膠狀沉淀物G2:10-15μm濾除粗沉淀及氣體洗滌G3:4.5-9μm濾除細沉淀，過濾水銀G4:3-4μm濾除細沉淀或極細沉淀物G5:1.5-2.5μm濾除體積較大的桿狀細菌和酵母G6:＜1.5μm濾除1.5~0.6um的病菌0.22μm脲：控制在1%-4%（1）將LB培養(yǎng)基熔化后冷卻到50

℃左右倒平板。（2）將尿素培養(yǎng)基熔化后冷卻到50℃左右，加入過濾除菌后的尿素溶液，混勻，倒平板。a皿疊法b手持法實驗方法與步驟3.倒平板實驗方法與步驟4.土壤稀釋液的制備1）每組取6支試管，每支試管先加4.5mL無菌水。2）稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約20min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。3）梯度稀釋法制備土壤稀釋液實驗方法與步驟4.土壤稀釋液的制備

用無菌吸管分別吸取相應(yīng)稀釋液各0.1mL，對號放入已寫好稀釋度的平板中，用無菌涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5~10min，使菌液吸附進培養(yǎng)基。尿素培養(yǎng)基：10-2、10-3LB培養(yǎng)基：10-6、10-7實驗方法與步驟5.涂布與培養(yǎng)：培養(yǎng)：倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)1天，尿素培養(yǎng)基培養(yǎng)4天。觀察與計數(shù)：取出后觀察，觀察尿素培養(yǎng)基平板與LB培養(yǎng)基平板上的菌落數(shù)及顏色變化，選擇菌落數(shù)在30~300之間，取平均值，進行計數(shù)。實驗方法與步驟6.培養(yǎng)與觀察10-2，培養(yǎng)3天10-3，培養(yǎng)3天10-4，培養(yǎng)3天10-2，培養(yǎng)4天10-3，培養(yǎng)4天10-4，培養(yǎng)4天實驗方法與步驟6.培養(yǎng)與觀察實驗方法與步驟6.培養(yǎng)與觀察

分別數(shù)出2個稀釋度下的菌落數(shù)（單位：CFU）。

CFU：colonyformingunit

活菌