醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院

微生物學(xué)教研室

第一次實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3.細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容4.染色標(biāo)本的制備一革藍(lán)染色

實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求

醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是該專業(yè)課程的重要組成部分，指導(dǎo)學(xué)生上好實(shí)驗(yàn)課是

教學(xué)過程中的重要環(huán)節(jié)，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)課的目的是：

1.使學(xué)生加深理解并鞏固理論知識，學(xué)習(xí)和掌握有關(guān)的實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)，為

以后的醫(yī)學(xué)專業(yè)課學(xué)習(xí)打好基礎(chǔ)：

2.在實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)學(xué)生觀察、思考和分析問題的能力，主動參與實(shí)驗(yàn)的動

手能力及獨(dú)立工作的能力。訓(xùn)練學(xué)生嚴(yán)格的科學(xué)作風(fēng)、嚴(yán)肅白的科學(xué)態(tài)度和嚴(yán)密

的工作方法。

3.培養(yǎng)學(xué)生在集體工作環(huán)境中互幫互讓，團(tuán)結(jié)協(xié)作，共同完成好實(shí)驗(yàn)的精

神品德。

為了達(dá)到上述目的，提高實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果，特提出以下要求：

1.實(shí)驗(yàn)課前做好預(yù)習(xí)，明確本次實(shí)驗(yàn)課的內(nèi)容及其原理、方法及注意事項(xiàng);

2.實(shí)驗(yàn)中要仔細(xì)認(rèn)真，注意分工與協(xié)作，操作實(shí)驗(yàn)要按操作步驟進(jìn)行。學(xué)

會正確操作手法、準(zhǔn)確記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。示教實(shí)驗(yàn)要注意觀察，并記錄好相關(guān)內(nèi)容;

3.詳細(xì)討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提倡同學(xué)之間互幫互學(xué)，并緊密聯(lián)系理論課內(nèi)容。

要注意不論實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論符合與否，都有討論的價(jià)值，并分析其原因，有可能

的話還應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)；

4.嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室規(guī)則，在微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課上，要樹立“有菌觀點(diǎn)”，嚴(yán)

格掌握和不斷完善無菌操作技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)室規(guī)則

一、進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室須穿工作服、戴工作帽。除必要的書籍文具外，其它個(gè)人物

品一律不得帶入實(shí)驗(yàn)室。

二、在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，禁止飲食、吸煙及與學(xué)習(xí)無關(guān)的其它活動，不得大聲喧嘩

或嘻戲。

三、未經(jīng)老師許可，不得擅自搬動實(shí)驗(yàn)器材及示教物品，不準(zhǔn)隨意擺弄和旋

轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)儀器上的開關(guān)及旋扭等。

四、按照實(shí)驗(yàn)要求，在老師的指導(dǎo)下，主動安排要進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，認(rèn)真進(jìn)行實(shí)

驗(yàn)操作，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，爭取順利地完成實(shí)驗(yàn)。

五、實(shí)驗(yàn)中使用完畢的器材和試劑，必須放回規(guī)定的位置。廢棄物必須按規(guī)

定進(jìn)行處理或歸放于指定的容器內(nèi)，不能隨便亂丟亂放。

六、實(shí)驗(yàn)中萬一有菌液打翻、有菌材料污染桌面或衣物、割破手指等意外情

況，應(yīng)及時(shí)報(bào)告老師進(jìn)行處理，切勿自作主張不按規(guī)定處理。

七、愛護(hù)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切設(shè)備、掛圖、儀器。注意節(jié)約使用消耗材料及藥品試

劑，注意用電安全及節(jié)約水電。

八、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，要清理桌面，將實(shí)驗(yàn)器材放回原處。值日同學(xué)要搞好實(shí)驗(yàn)室

的清潔衛(wèi)生，保持室內(nèi)整齊，離開實(shí)驗(yàn)室前要關(guān)好門窗、水、電，并將手洗干凈。

九、未經(jīng)許可，不得將實(shí)驗(yàn)室內(nèi)任何物品帶出實(shí)驗(yàn)室。

實(shí)驗(yàn)一細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察技術(shù)

將細(xì)菌培養(yǎng)物或含菌標(biāo)本材料制備的染色標(biāo)本片，置顯微鏡油鏡頭下,

可以觀察到細(xì)菌的形狀、大小、結(jié)構(gòu)、排列及染色特性等，了解這些特征有助于

鑒別各種細(xì)菌。

一、顯微鏡油鏡頭的使用與保護(hù)

【使用原理】

用油鏡觀察標(biāo)本、是在使用高倍鏡的基礎(chǔ)上，采用同玻璃折光率相似的

油狀物（如香柏油、液體石臘等），滴加在標(biāo)本與油鏡頭中間，以避免光線散射,

提高顯微鏡的清晰度和分辨能力。使觀察物象更加清楚明了。

【操作方法】

1.調(diào)試：打開電源，先采用低倍鏡，使視野達(dá)到清晰光亮。

2.加油：雙手向上轉(zhuǎn)動粗螺旋，使鏡筒上升，將標(biāo)本片固定于載物臺

上，使染色面對準(zhǔn)集光器央，加鏡油于標(biāo)本面，調(diào)換油鏡頭對準(zhǔn)標(biāo)本面。

3.調(diào)焦點(diǎn)：用左手向下輕轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒下降，同時(shí)眼睛從右側(cè)觀

察下降程度，待鏡頭入油后接觸上玻片，用眼觀目鏡，反轉(zhuǎn)粗螺旋，使鏡筒慢慢

上升，待看到模糊物象時(shí)，改用細(xì)螺旋上下調(diào)節(jié)，使物像達(dá)到完全清晰為宜（一

般轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)前后半圈）。

4.觀察：觀察時(shí)只使用細(xì)調(diào)。需改換視野時(shí)，右手操縱推進(jìn)器，左手

轉(zhuǎn)動細(xì)螺旋，做到配合自如。并養(yǎng)成左眼觀察，右眼繪圖的習(xí)慣。

【油鏡頭的保護(hù)】

油鏡頭使用完結(jié)后，必須用擦鏡紙滴加少量二甲苯將油擦洗干凈（二甲

苯用量宜少，以免鏡片間粘膠溶解）。下降集光器，半接物鏡轉(zhuǎn)成“八”字，再

下降鏡筒，輕觸鏡臺表面，雙手平持顯微放入鏡箱，避免直射日光，置于干燥處,

以防受潮。

【注意事項(xiàng)】

1.使用直筒顯微鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須兩眼同時(shí)睜開，訓(xùn)練使用左眼觀

察，右眼繪圖。如用油鏡頭觀察，勿將鏡身歪斜，避免鏡油流出片面。

2.觀察染色標(biāo)本時(shí)，光線宜強(qiáng)，可上升集光器，開大光圈。觀察不染

色標(biāo)本時(shí)，光源宜弱，可下降集光器，縮小光圈。

3.使用完畢，一定擦去鏡油。

二、細(xì)菌不染色標(biāo)本

不染色的細(xì)菌和標(biāo)本鏡檢，雖可觀察細(xì)菌在自然生活狀態(tài)下的大小、形

態(tài)、活動等，但主要用于觀察細(xì)菌的動力。

（一）懸滴法

【材料】

1.細(xì)菌：枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。

2.凹玻片，蓋玻片，凡士林等。

【方法】

1.取凹玻片一張，于凹窩周圍涂少許凡士林（見圖1）。

圖1懸滴法

2.用接種環(huán)沾取枯草桿菌8?12小時(shí)培養(yǎng)物，置于蓋玻片中央。

3.反轉(zhuǎn)凹玻片，使凹窩對準(zhǔn)蓋玻片中央，蓋于其上，輕壓后，迅速翻轉(zhuǎn)玻

片，使蓋破片面向上。

4.標(biāo)本片置于顯微鏡載物臺上，先用弱光線，低倍鏡找物象，再改換高倍

鏡觀察，密切注意，勿壓破蓋玻片。

5.觀察：細(xì)菌在鏡下為灰色半透明體，并呈現(xiàn)真運(yùn)動，如在明亮的海洋中,

深入淺出游來動去。

（二）壓滴法

用途同懸滴法。

【材料】

1.細(xì)菌：枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物。

2.載物玻片：蓋玻片等。

【方法】

1.取無油污物玻片1張。

2.用接種環(huán)沾取枯草桿菌8~12小時(shí)肉湯培養(yǎng)物置于載物玻片中央。

3.加蓋玻片于菌液表面，觀察方法同懸滴法。

三、細(xì)菌染色標(biāo)本片的制備（操作）

由于細(xì)菌個(gè)體微小，基本上無色透明，故將其用適當(dāng)染料染色觀察，方能

顯示它的形態(tài)、大小、構(gòu)造及染色特性等，在細(xì)菌和鑒別上有重要意義。

【材料】

1.葡萄球菌大腸桿菌18~24小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.革蘭染色液。

3.生理鹽水，載物玻片，接種環(huán)等。

【方法】

（一）細(xì)菌涂片的制作

1.涂片：取清潔無油污載物玻片一張，接種環(huán)沾取生理鹽水1~2環(huán)置于玻

片中央，再將接種環(huán)火焰滅菌待冷后，沾取葡萄球菌或大腸桿菌菌苔少許，混于

生理鹽水中，輕輕涂成均勻薄膜。

2.干燥：室溫自然干燥，也可將涂面向上，遠(yuǎn)離火焰上方微加溫干燥（切

勿加熱過度，以防將標(biāo)本燒枯）。

3.固定：標(biāo)本干燥后，通過酒精燈火焰三次（約2~3秒鐘），以殺死細(xì)菌

并使之固定于玻片上。

4.染色：可根據(jù)不同的染色要求，用相應(yīng)染色液進(jìn)行染色。

（二）革蘭染色法：涂片的制備方法同前，革蘭染色方法可分為四步。

1.初染：于涂抹面上滴加結(jié)晶紫染液數(shù)滴，覆蓋整個(gè)涂面，室溫作用一分

鐘。用自來水輕輕沖洗，甩干水分。

2.媒染：滴加魯戈碘液，室溫作用一分鐘，自來水沖洗，甩干水分。

3.脫色：將載物玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，邊提邊看，見涂面無

色素下流為止（約30秒鐘）。自來水沖洗，甩干水分。

4.復(fù)染：加稀釋復(fù)紅染液染30秒鐘，自來水沖洗，吸水紙吸干玻片水分。

5.加油鏡檢：染色片待干后，于油鏡下，調(diào)強(qiáng)光視野觀察，呈紫色的為革

蘭陽性菌，呈紅色的為革蘭陰性菌。

（三）美蘭染色法

【方法】

將涂片固定滴加美蘭染液于玻片上，染1~2分鐘，水洗、待干、鏡檢。

【結(jié)果】

此法為單染色法，菌體和細(xì)胞均染成藍(lán)色。常用于腦膜炎球菌及白喉?xiàng)U菌

等細(xì)菌染色。

四、細(xì)菌基本形態(tài)和特殊結(jié)構(gòu)觀察

（一）基本形態(tài)（示教）

1.球形：葡萄球菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體正園形，染成蘭紫色，呈現(xiàn)葡

萄串狀排列。G+球菌。

2.桿形：大腸桿菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體短桿狀，染成紅色，呈分散排

列。G桿菌。

3.螺形：霍亂弧菌革蘭染色標(biāo)本片一一菌體弧形，染成紅色，呈分散排列。

G-弧菌。

（二）特殊結(jié)構(gòu)示教

1.鞭毛：傷寒桿菌鞭毛染色片一一菌體較粗大桿狀，染成蘭灰色，單個(gè)或

成堆存在，周圍可見到波浪狀彎曲、較長、呈蘭灰色的鞭毛。

2.莢膜：肺炎雙球菌莢膜染色片一一視野背景為紅色，其中可見到染色呈

深紅色，矛頭狀菌體，縱向成雙排列，菌體周圍有未染上顏色的空白區(qū)，即莢膜。

3.芽胞：破傷風(fēng)梭菌芽胞染色片一一菌體為細(xì)長桿狀，頂端有染成紅色、

并大于菌體的球狀物即芽胞，呈“鼓槌狀”，其他散亂分布的紅色球體，為菌體

脫落的成熟芽胞。

《附錄》

革蘭（Gram）染液的配制

1.結(jié)晶紫染液

將1份結(jié)晶紫酒精飽和液與4份1%草酸鏤水溶液混合即成（14克結(jié)晶紫加

95%酒精100毫升即為酒精飽和溶液）。

2.魯戈（Lugol）碘液

碘1克碘化鉀2克蒸儲水300毫升

3.稀釋復(fù)紅液

1份磴性復(fù)紅飽和液（磴性復(fù)紅3.2克溶于95%酒精100毫升中。即為磴性復(fù)

紅飽和溶液）力口9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸復(fù)紅染液（抗酸染色用），

取1份石炭酸復(fù)紅染液加9份蒸儲水即為稀釋復(fù)紅染液。

第二次實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1;細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)（操作）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2；細(xì)菌的生化反應(yīng)檢測（示教）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象一《細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則》

實(shí)驗(yàn)二細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)

給細(xì)菌提供適宜的條件，細(xì)菌即可以生長繁殖，形成具有一定特征的培養(yǎng)

物，學(xué)習(xí)細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)可以純化細(xì)菌，了解細(xì)菌的生長特征，并能進(jìn)一步檢測細(xì)

菌生化反應(yīng)、變異性，制備細(xì)菌抗原，深入進(jìn)行分子生物學(xué)工作等。了解細(xì)菌的

培養(yǎng)特征也有助于鑒別細(xì)菌。

細(xì)菌培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基是用人工方法將適合細(xì)菌生長繁殖的各種營養(yǎng)物配制而成的營養(yǎng)

基質(zhì)，以供細(xì)菌培養(yǎng)使用。一般培養(yǎng)基的主要成份為蛋白質(zhì)、糖類、鹽類、水分

等。另外還有一些營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌，還必須加入血液或血清、雞蛋、維生素

等其他營養(yǎng)物質(zhì)。有時(shí)為了鑒別或抑制某些細(xì)菌，則可加入各種專用基質(zhì)（如某

種糖類、氨基酸等），指示劑，染料等。由于對培養(yǎng)基的使用目的不同，故在培

養(yǎng)基的選擇上有所不同。按其物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體

培養(yǎng)基。按其成分和用途可分為普通培養(yǎng)基，鑒別培養(yǎng)基，選擇培養(yǎng)基和專用培

養(yǎng)基等。培養(yǎng)基需加入小試管、中試管、三角瓶、平皿等內(nèi)使用。

培養(yǎng)基的種類很多，但一般制備原則有三條：

1.足夠和適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成份。籍以滿足細(xì)菌生長繁殖的要求，獲得典型細(xì)菌

培養(yǎng)物，達(dá)到研究細(xì)菌的形態(tài)，生化反應(yīng)，抗原結(jié)構(gòu)及致病力等方面的目的。

2.合適的酸磴度。培養(yǎng)基的酸磴度直接影響細(xì)菌的生長繁殖。一般細(xì)菌最

合適PH為7.2~7.6。測定的方法常用普通比色法或精密PH試紙來測定（見附錄）。

3.絕對無菌。培養(yǎng)基務(wù)必進(jìn)行除菌處理，由于培養(yǎng)基所含成份不同，除菌

的方法也不同。如普通培養(yǎng)基常用高壓蒸氣滅菌法。

一、常用培養(yǎng)基的制備

（一）普通肉湯培養(yǎng)基

【材料】

1.新鮮牛肉或牛肉膏，蛋白腺，氯化鈉，瓊脂，蒸儲水。

2.酚紅指標(biāo)劑，比色架及標(biāo)準(zhǔn)比色管或精密PH試紙。

3.漏斗，量筒，三角燒瓶，試管等。

【方法】

1.稱取去脂去腱絞碎的鮮牛肉500克，浸于1000毫升蒸儲水中，冰箱過夜，

次日煮沸30分鐘，紗布過濾，蒸儲水補(bǔ)足其量，（也可用牛肉膏3克加蒸儲水1000

毫升加熱溶化），即為肉浸液。

2.取肉浸液1000毫，氯化鈉5克，蛋白膝10克混合加熱溶化。

3.調(diào)整PH為7.6,用濾紙過濾分裝于中試管或三角燒瓶內(nèi)，塞緊棉塞。

【用途】

供基礎(chǔ)培養(yǎng)基用，營養(yǎng)比肉膏湯好，一般營養(yǎng)要求不高的菌均可生長。

（二）普通瓊脂培養(yǎng)基

瓊脂是石花菜等海藻類提取的膠體物質(zhì)，其化學(xué)成份主要是多糖。當(dāng)溫度

達(dá)到98℃以上可溶解于水，45℃以下則凝固。瓊脂對細(xì)菌一般無營養(yǎng)作用（除自

然界中極少數(shù)菌可利用瓊脂之外），純屬賦形劑。便于人們制做斜面、平板、高

層等不同類型的固體培養(yǎng)基。

【材料與方法】

普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，加入瓊脂2~3克，加熱溶化，用蒸儲水補(bǔ)足失

去水分，調(diào)整PH為7.6后分裝中試管、平皿等器皿，高壓蒸氣15磅滅菌20分鐘，

可制成普通瓊脂斜面和普通瓊脂平板。

【用途】

供一般細(xì)菌培養(yǎng)用，并可作無糖基培養(yǎng)基。

（三）半固體培養(yǎng)基

【材料與方法】

取普通肉湯培養(yǎng)基100毫升，力口入瓊脂0.5~0.7克，加熱溶化。調(diào)整PH為7.6,

分裝于小試管內(nèi)，每管1~5毫升，高壓蒸氣磅滅菌20分鐘，待冷后放入4℃冰箱

備用。

【用途】

保存一般菌種用，并可觀察細(xì)菌的動力及生化反應(yīng)。

（四）血液瓊脂培養(yǎng)基

【材料與方法】

將高壓滅菌后普通瓊脂培養(yǎng)基。冷至45℃~50℃時(shí)以無菌手續(xù)操作加入

5%~10%血液（人或動物脫纖維無菌血液）?？芍瞥裳桨搴脱泵?。

【用途】

供營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌分離培養(yǎng)用，亦可觀察細(xì)菌的溶血特征。

二、細(xì)菌接種技術(shù)及生長表現(xiàn)

由于細(xì)菌感染而致病的各種標(biāo)本及帶菌者所需檢查的各種標(biāo)本，往往并非單

一的細(xì)菌，而混有其它非致病菌（人體正常菌群）。因此當(dāng)對此標(biāo)本須作出細(xì)菌

鑒定時(shí)，就必須從標(biāo)本中分離出致病菌，稱為細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)。另外，對已

得到可疑病菌進(jìn)行細(xì)菌鑒定及菌種保存等培養(yǎng)，稱為純培養(yǎng)接種技術(shù)。

（一）平板劃線接種法（又稱分離培養(yǎng)法）

平板分離劃線的方法較多，其中以分區(qū)劃線法與曲線劃線法較為常用。其目

的都要使細(xì)菌呈現(xiàn)單個(gè)菌落生長，便于同雜菌菌落鑒別?，F(xiàn)只介紹分區(qū)劃線法。

【材料】

1.細(xì)菌：大腸桿菌、葡萄球菌18~24小時(shí)普通瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.酒精燈，接種環(huán)等。

【方法】

1.右手持接種環(huán)，經(jīng)火焰滅菌，待涼后，挑取大腸桿菌（或葡萄球菌）培

養(yǎng)物少許。

2.左手斜持瓊脂平板，皿蓋留在桌上，于火焰近處將菌涂于瓊脂平板上端,

來回劃線，涂成薄膜（約占平板總表面積的1/10）,劃線時(shí)接種環(huán)與平板表面成

30~40°角，輕輕接觸，以腕力在平板表面行輕快地滑移動作，接種環(huán)不應(yīng)劃破

培養(yǎng)基表面。

3.燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留細(xì)菌，待冷（是否冷卻，可先在培養(yǎng)基邊緣

處試觸，若瓊脂溶化，表示未涼，稍等再試），從薄膜處取菌作連續(xù)平行劃線（見

圖3）,約占平板表面1/5左右，再次燒灼接種環(huán)，等三次平行劃線……以同樣方

法作第四次，第五次劃線，將平板表面劃完。

4.劃線完畢，蓋上平皿蓋，底面向上，用標(biāo)簽或臘筆注明菌名檢驗(yàn)號碼，

接種者班級，姓名，組別等，置37℃孵育培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果（見圖4）。

（二）純培養(yǎng)細(xì)菌接種法

1.斜面培養(yǎng)基接種法：用于培養(yǎng)，保存菌種及其它實(shí)驗(yàn)用。

【材料】

（1）大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

（2）普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。

（3）接種環(huán)，接種針，酒精燈等。

【方法】

（1）取一支斜面培養(yǎng)基及一支純菌種管，并排傾斜放在左手四指中拇指壓

住并以手掌支住兩試管底部。右手將白金環(huán)于火焰上滅菌、冷卻。并拔起兩試管

的棉塞。（勿放置桌上，如棉塞太緊時(shí)應(yīng)預(yù)先松動）。

（2）試管口部于火焰上往返通過2~3次滅菌，將滅菌白金環(huán)伸入有菌試管

中，取少量細(xì)菌（一般應(yīng)從斜面底部沾?。?，然后小心移至準(zhǔn)備接種的試管中。

（3）接種方法是自管底向上連續(xù)平劃線，若以保存菌為目的時(shí)可自管底上

劃一粗直線即可。

（4）取出接種環(huán)，將試管上部再經(jīng)火焰滅菌，塞好棉塞，接種環(huán)滅菌后放

回原處。

（5）若自平皿培養(yǎng)物中取菌時(shí)，只應(yīng)沾取一個(gè)單個(gè)菌落。

（6）接種菌應(yīng)作好標(biāo)記，標(biāo)明菌種名稱，日期等，置37℃溫箱中培養(yǎng)，次

日觀察結(jié)果。

2.液體培養(yǎng)基接種法：用于增菌及鑒定細(xì)菌生長特點(diǎn)，如表面生長，沉淀

生長，均勻混濁生長等。

【材料與方法】

操作技術(shù)基本與上法相同，只是接種時(shí)應(yīng)將沾菌之接種環(huán)沿接近液體表面之

管內(nèi)壁輕輕摩擦（勿用力振蕩）使細(xì)菌混入培養(yǎng)基內(nèi)，置37℃溫箱中培養(yǎng)，次日

觀察結(jié)果。

3.半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)法

用于保存菌種及間接觀察細(xì)菌之動力（無動力之細(xì)菌僅沿穿刺線生長，清晰

可見；有動力的細(xì)菌使培養(yǎng)基呈現(xiàn)混濁樣，穿刺線甚至難以看出）。

用無菌操作技術(shù)，滅菌穿刺針沾取細(xì)菌后，垂直刺入半固體培養(yǎng)基中央直達(dá)

近管底處，再沿原穿刺線抽出即可，置37℃溫箱培養(yǎng)，次日觀察結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2；實(shí)驗(yàn)三細(xì)菌的生化反應(yīng)檢測（示教）

不同細(xì)菌由于所含的酶系統(tǒng)不完全相同，因而對營養(yǎng)物質(zhì)的分解能力及代謝

產(chǎn)物亦不一致，據(jù)此，可用以鑒別細(xì)菌的種類。

一、單糖發(fā)酵試驗(yàn)

【原理】

單糖發(fā)酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白陳水培養(yǎng)基內(nèi)，使其最

終濃度為0.75~1%。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發(fā)酵管，接種

細(xì)菌經(jīng)37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，若能分解糖產(chǎn)酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解

甲酸有C02和H2等氣體形成，小倒管內(nèi)則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖發(fā)酵管，乳糖發(fā)酵管等。

【方法】

1.將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發(fā)酵

管內(nèi)。

2.置37℃孵箱培養(yǎng)18~24小時(shí)。

3.觀察結(jié)果：由于一些細(xì)菌能分解某種糖類產(chǎn)酸，所以培養(yǎng)基中PH下降到

7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養(yǎng)基顏色由紅變黃。產(chǎn)酸者以“+”表示，

如果同時(shí)產(chǎn)生氣體，則培養(yǎng)基中小倒管內(nèi)有氣泡出現(xiàn)，此乃產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，以“十”

表示，不分解，則指示劑不變色，用“-”表示。

【結(jié)果】

傷寒桿菌大腸桿菌

葡萄糖+十

乳糖-?

二、V-P（Voges-Proskauer）試驗(yàn)

【原理】

有些細(xì)菌如產(chǎn)氣桿菌，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫峻，生成乙酰甲基

甲醇，在堿性環(huán)境中被氧化為二乙酰，再與培養(yǎng)基內(nèi)股基結(jié)合，生成紅色化合物,

V—P試驗(yàn)陽性。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基。

3.試劑：V-P試劑［40%氫氧化鉀水溶液（內(nèi)含0.3%肌酸）和6%a-奈酚酒精

溶液］。

【方法】

1.分別接種大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌于兩支葡萄糖蛋白陳水中。

2.置37℃培養(yǎng)48小時(shí)后，取出分別加入KOHlml和a一奈酚溶液1ml,搖勻，

靜置試管架上5~15分鐘。

3.觀察結(jié)果：培養(yǎng)液變?yōu)榧t色為陽性，不變色為陰性。

【結(jié)果】

大腸桿菌：-；產(chǎn)氣桿菌：+

三、甲基紅（M、R）試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳

酸等，使培養(yǎng)基PH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應(yīng)；

若產(chǎn)酸量少或產(chǎn)生的酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為醇、醛、氣體和水等，則培養(yǎng)基的酸堿度仍

在PH6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現(xiàn)黃色，為陰性反應(yīng)。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基。

3.試劑：甲基紅試劑。

【方法】

1.分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)基中。

2.置37℃培養(yǎng)2~3天取出，分別滴加甲基紅試劑2~3滴，混勻，觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

大腸桿菌：+,產(chǎn)氣桿菌：-0

四、枸椽酸鹽利用試驗(yàn)

【原理】

枸椽酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸椽酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫鏤

為唯一氮源。一般細(xì)菌能利用磷酸二氫鏤作為氮源，但不一定能分解枸椽酸鹽取

得碳源。因此，根據(jù)可否利用枸椽酸鹽來鑒別細(xì)菌，如產(chǎn)氣桿菌可利用枸椽鹽作

為碳源，細(xì)菌生長繁殖，形成菌苔，分解枸椽酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養(yǎng)基

PH上升到7.0以上，由綠色變?yōu)樯钐m色，為枸椽酸鹽利用試驗(yàn)陽性；而大腸桿菌

則不能分解枸椽酸鹽，得不到碳源，不能生長，無菌苔形成，培養(yǎng)基顏色不發(fā)生

變化，為枸椽酸鹽利用試驗(yàn)陰性。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：枸椽酸鹽斜面。

【方法】

1.分別將大腸桿菌，產(chǎn)氣桿菌接種于兩支枸椽酸鹽斜面培養(yǎng)基。

2.置37℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

產(chǎn)氣桿菌：+（有菌苔生長，培養(yǎng)基變色）

大腸桿菌：-（無菌苔生長，培養(yǎng)基不變色）

五、靛基質(zhì)（IndoD試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白陳水培養(yǎng)基中

的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（無色吧跺），再與歐立希試劑（對二甲基氨基苯甲醛）

反應(yīng)，形成紅色化合物一玫瑰喝I口朵，即為陽性反應(yīng)。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：蛋白陳水培養(yǎng)基。

3.試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對二甲基氨基苯甲醛）

【方法】

1.分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白陳水培養(yǎng)基中。

2.置37℃培養(yǎng)2~3天后，每管沿管壁各加歐立希試劑于培養(yǎng)液面上,

待1-2分鐘后觀察結(jié)果：在交界面出現(xiàn)玫瑰紅色環(huán)即為嗎|躲試驗(yàn)陽性，無紅色環(huán)

即為陰性。

【結(jié)果】

大腸桿菌：+;傷寒桿菌：-。

六、硫化氫（H2S）產(chǎn)生試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化

氫。硫化氫遇到培養(yǎng)基中的鉛鹽（醋酸鉛）或鐵鹽（硫酸亞鐵），則形成黑褐色

硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。培養(yǎng)基內(nèi)含有還原劑硫代硫酸鈉，使形成的硫化氫不

再氧化。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，傷塞桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：醋酸鉛培養(yǎng)基。

【方法】

1.分別以半固體穿刺接種法將大腸桿菌，傷寒桿菌穿刺接種地兩支醋酸鉛

培養(yǎng)基內(nèi)。

2.置37℃培養(yǎng)48-72小時(shí)（2-3天）。

3.觀察結(jié)果：取出后對光觀察，若沿穿刺線有黑褐色沉淀物，即表示該菌

能產(chǎn)生硫化氫（H2S）,否則反之。

【結(jié)果】

大腸桿菌：-（無黑色沉淀線生成）

傷寒桿菌：+（有黑色沉淀線生成）

七、尿素分解試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如變形桿菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而產(chǎn)生氨，氨溶于水變

成氫氧化鏤，使培養(yǎng)基變堿而呈紅色即為陽性。

【材料】

1.菌種：變形桿菌，傷寒桿菌18-24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：尿素培養(yǎng)基。

【方法】

1.分別以斜面接種法將變形桿菌，傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養(yǎng)基上。

2.置37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)。

3.取出觀察結(jié)果，培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，即尿素分解試驗(yàn)陽性，若不變色，即

為尿素分解試驗(yàn)陰性。

【結(jié)果】

變形桿菌：+；傷寒桿菌：-。

八、氧化酶試驗(yàn)

【原理】

某些細(xì)菌如奈瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶（靛基酚氧化酶），能將氧化酶

試劑（鹽酸二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺）氧化成紅色的醍類化合物，即為

氧化酶試驗(yàn)陽性。

【材料】

1.菌種：淋球菌或腦膜炎球菌，白色葡萄球菌18-24小時(shí)巧克力斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：巧克力平板。

3.試劑：0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺（或鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸對氨基

二甲苯胺）水溶液。

【方法】

1.將腦膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分別接種于巧克力平板；

2.置37℃培養(yǎng)24小時(shí)后取出；

3.滴加新鮮配制的0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺水溶液于固體培養(yǎng)基上；

4.觀察結(jié)果：加試劑后，若菌落出現(xiàn)紅色一深紅色一紫黑色變化均為陽性;

反之陰性。

【結(jié)果】

腦膜炎球菌和淋球菌：+;白色葡萄球菌：-。

【注意事項(xiàng)】

1.此項(xiàng)試驗(yàn)應(yīng)避免含鐵物質(zhì)，因遇鐵會出現(xiàn)假陽性。

2.試劑在空氣中易氧化，故應(yīng)新鮮配制。冰箱保存使用不超過兩周。

3.若要分離培養(yǎng)腦膜炎球菌，應(yīng)在菌落變成紫黑色之前立即轉(zhuǎn)種。否則細(xì)

菌容易死亡。

《附錄》

1.V-P試驗(yàn)劑的配制

甲液：a一祭酚6g95%灑精100ml

乙液：KOH40g肌酸0.3g蒸儲水100ml

2.甲基紅試劑的配制

甲基紅0.04g95%酒精60ml蒸儲水40ml

先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸儲水，混合，搖勻即成。

3.歐立希(Ehrlich)試劑的配制

對位二甲基氨基苯甲醛4g

95%酒精380ml

濃硫酸或濃鹽酸80nli

三種成分混合即成，瓶口要嚴(yán)密，以免揮發(fā)。

4.蛋白陳水培養(yǎng)基的制備

成分：蛋白陳10g氯化鈉5g蒸儲水1000ml

制法：

(1)先用少量蒸儲水將蛋白月東和氯化鈉相混合溶解，再加足蒸儲水量。

(2)調(diào)節(jié)pH至7.6、用濾紙過濾。

(3)分裝中試管，每管約3-4ml,加塞滅菌后備用。

用途：供嗎I口朵試驗(yàn)用

5.單糖發(fā)酵管的制備

成分：蛋白陳水培養(yǎng)基100ml

0.2%酚紅1ml

所需糖(葡萄糖或乳糖)0.75-lg

制法：

(1)將上述成分溶化，混勻分裝于內(nèi)含有倒置小玻璃管的小試管中，每

管約2ml,加塞。

（2）小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存?zhèn)溆谩?/p>

用途：供單糖發(fā)酵試驗(yàn)用。

附注：0.2%酚紅配制法

酚紅（phenolred）0.2g

1/10N苛性鈉（NaOH）8ml

蒸播水92ml

將酚紅入研缽徐徐加入苛性鈉研磨，再補(bǔ)足蒸儲水即成。若需長時(shí)間保存,

可高壓滅菌后貯存?zhèn)溆谩?/p>

6.葡萄糖蛋白陳水培養(yǎng)物

成分：蛋白膝5g葡萄糖5g

制法：

（1）將上述成分溶解于蒸儲水中。

（2）調(diào)節(jié)pH至7.6,用濾紙過濾除渣。

（3）分裝中試管，每管約3-4ml,滅菌后備用。

用途：供甲基紅及V-P試驗(yàn)用。

7.枸椽酸鹽斜面培養(yǎng)基的制備

成分：磷酸二氫鏤0.1g磷酸氫二鉀0.1g

硫酸鎂0.02g枸椽酸鈉0.23g

氯化鈉0.5g瓊脂2g

蒸播水100ml0.5%漠麝香草酚藍(lán)酒精溶液2ml

制法：

（1）先將上述各種鹽類溶解于蒸儲水中，使其完全溶解。

（2）矯正pH至6.8,然后加入瓊脂和指標(biāo)劑。

（3）搖勻，脫脂棉過濾，分裝中試管，每管約3-5面。

（4）滅菌后置成斜面?zhèn)溆茫ɡ浜鬄榫G色）

用途：供枸椽酸鹽利用試驗(yàn)用。

8.醋酸鉛培養(yǎng)基的制備

成分：2%肉湯瓊脂200ml硫代硫酸鈉0.05g

醋酸鉛10g蒸儲水100ml

制法：

(1)先將10g醋酸鉛加入100ml蒸儲水中融化，間歇滅菌或低壓菌后備

用(10%醋酸鉛溶液)。

(2)加熱溶化2%肉湯瓊脂200ml,加入硫代硫酸鈉0.05g,混合后高壓

滅菌。

(3)從高壓滅菌鍋取出，待冷卻至45℃左右時(shí)。無菌操作加入無菌的10%

醋酸鉛溶液1毫升，搖勻。

(4)分裝小試管，每管約2mL直立待冷凝后備用。

用途：供硫代氫生成試驗(yàn)用。

說明：醋酸鉛與硫代硫酸鈉不宜久然。

9.尿素培養(yǎng)基的制備

成分：蛋白月東1g氯化鈉5g

葡萄糖1g蒸儲水900ml

瓊脂15~20g0.1%酚紅12ml

20%尿素水溶液(無菌)100ml

制法：(1)除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯

正pH至6.8~6.9。

(2)加入瓊脂和酚紅，8~10磅10分鐘滅菌。

(3)冷卻至60℃后加入無菌尿素溶液，搖勻。

(4)分裝中試管(無菌)，每管3~4ml,置成斜面?zhèn)溆谩?/p>

用途：供尿素分解試驗(yàn)用。

說明：(1)尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。

(2)無菌尿素溶液制備：稱取尿素20g,混合于100ml蒸儲水中,

充分搖勻，用G6濾菌器過濾除菌，以達(dá)到無菌的目的。

10.巧克力色瓊脂平板的制備

成分：肉湯瓊脂100ml無菌脫纖維羊或兔血10ml。

制法：

(1)將肉湯瓊脂加熱溶化，趁熱加入脫纖維血，搖勻。

(2)傾注平板，待冷卻成巧克力色，備用。

用途：用于培養(yǎng)腦膜炎雙球菌或淋球菌。

說明：加血一定要趁熱加。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容3：播放錄象一《細(xì)菌感染的檢查方法和防治原則》

第三次實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)四細(xì)菌分布及外界因素對細(xì)菌影響的檢測

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：L課堂上全部操作；

2.次日預(yù)約看結(jié)果

一、自然沉降法檢查空氣中的細(xì)菌

【材料】

普通瓊脂平板。

【方法】

取普通瓊脂平板一個(gè)，打開皿蓋，讓培養(yǎng)基直接暴露于空氣中，置于實(shí)

驗(yàn)臺上或需要測定的地方15~30分鐘。蓋上皿蓋，用記號筆或蠟筆注明放置地點(diǎn)、

實(shí)驗(yàn)日期和實(shí)驗(yàn)者班級、姓名等，放入37℃溫箱培養(yǎng)18~24小時(shí)，觀察細(xì)菌的生

長情況和數(shù)量。并分析其意義。

二、傾注法檢查水中的細(xì)菌

【材料與方法】

1.用無菌吸管吸取勝0.5ml水樣加入肉湯培養(yǎng)基中。

2.另取一支未接種的肉湯管做對照，與上管一起置于37℃溫箱培養(yǎng)

18~24小時(shí)，觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

對照管應(yīng)透明清亮，試驗(yàn)管變混濁，說明水樣中有活菌存在。并可通過

比濁法估計(jì)細(xì)菌生長繁殖后的數(shù)量。

三、人體體表及各種物品表面的細(xì)菌檢查一拭子法和涂抹法

【材料】普通瓊脂平板。

【方法】

取普通瓊脂平板一個(gè)，在平板底面用記號筆或蠟筆將平板分成若干等

份，于每份培養(yǎng)基表面分別用手指、衣物、書本、筆等輕輕涂抹（不要擦破培養(yǎng)

基）。也可用無菌生理鹽水擦洗衣物等，用無菌棉拭子涂于培養(yǎng)基表面，蓋上皿

蓋，分別標(biāo)記清楚。置37℃溫箱培養(yǎng)18~24小時(shí)觀察結(jié)果。觀察各種物品中細(xì)菌的

數(shù)量及類別，并分析其意義。

【注意事項(xiàng)】

本實(shí)驗(yàn)檢出的除細(xì)菌外，尚可能有真菌、放線菌等，請注意加以區(qū)別。

四、人咽喉部位的細(xì)菌檢查

【材料】血液瓊脂平板。

【方法】

1.咳碟法

取血液瓊脂平板一個(gè)，打開皿蓋，將培養(yǎng)基面置于口腔前約10厘米處,

用力咳嗽數(shù)次（讓飛沫落在培養(yǎng)基表面），然后蓋上皿蓋，注明被檢查者姓名、

實(shí)驗(yàn)日期等。置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的數(shù)量、種類等，注意

是否有溶血環(huán)，并分析其意義。

2.試子法

用無菌棉簽涂取扁桃腺兩旁的分泌物，在血瓊脂平板表面涂布成線，然

后改用接種環(huán)，作分區(qū)劃線接種，置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)觀察結(jié)果。觀察細(xì)菌的

數(shù)量、種類等。注意是否有溶血環(huán)，并分析其意義。

五、化學(xué)因素對細(xì)菌的影響（化學(xué)消毒劑的殺菌試驗(yàn)）

【材料】

1.菌種：葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.化學(xué)消毒劑：5%石炭酸、2%碘酒、70%酒精、0.1%升汞。

4.其他：直徑0.6cm無菌圓形濾紙片、小鑲子、接種環(huán)等。

【方法】

1.將瓊脂平板分為四等分，并在其底面做標(biāo)記。

2.用接種環(huán)取葡萄球菌瓊脂斜面培養(yǎng)物，密涂于整個(gè)瓊脂培養(yǎng)基表面。

3.用小鏡子夾取無菌小濾紙片，分別蘸取上述消毒劑（消毒劑不宜蘸得

過多，防止外流）。平貼于各相應(yīng)分區(qū)的中央，蓋上皿蓋，標(biāo)明日期和試驗(yàn)者。

4.置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后觀察各種化學(xué)消毒劑的殺菌作用。紙片周圍無

細(xì)菌生長的區(qū)域，稱為抑菌圈，分別測量四種消毒劑抑菌圈的直徑，以毫米為單

位記錄之。

六、細(xì)菌的藥物敏感試驗(yàn)

【材料】

1.菌種：大腸桿菌，葡萄球菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.分別含各種抗生素的直徑0.6cm的圓形紙片（青霉素、鏈霉素、紅霉素、

慶大霉素、卡那霉素）、小鏡子等。

【方法】

1.取瓊脂平板兩個(gè)，每個(gè)平板分為五等份，并做相應(yīng)標(biāo)記。

2.用接種環(huán)分別密涂大腸桿菌及葡萄球菌于兩個(gè)瓊脂平板培養(yǎng)基表面。

3.用小鑲子以無菌操作技術(shù)先夾取一無菌不含抗生素的濾紙片平貼于平板

中央，再分別夾取含抗生素的各種濾紙片平貼于各相應(yīng)區(qū)中央，蓋上皿蓋。注明

班級、姓名、日期等。

4.置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，觀察各種抗生素的抑菌情況。

5.抑菌程度判定：

抑菌程度的判定是依照濾紙片周圍細(xì)菌的生長與抑菌圈直徑大小來判定。

對藥物的敏感程度抑菌環(huán)直徑（mm）

不敏感無抑菌環(huán)

輕度敏感<10

中度敏感10-15

高度敏感>15

《附錄》

抗生素濾紙片的制備方法

1.取直徑0.6cm園形濾紙片，每100片置于一小平皿中，15磅滅菌20分鐘，

再置于烤箱（60~100℃）烘干。

2.取一定濃度的不同抗生素（見表1）分別注入裝有無菌濾紙片的小平皿內(nèi)，

每100片加入1ml抗菌素，浸泡半小時(shí)后，再置37℃溫箱中2~3小時(shí)干燥。干燥后

保存冰箱備用。有效期約一年左右。

表1常用幾種抗生素的濃度表_________________________________________

抗生素名稱濃度（每毫升）標(biāo)記字樣/符號

青霉素200P青（P）

鏈霉素Img鏈(S)

紅霉素Img紅（E）

卡那霉素200H卡（K）

慶大霉素40U慶（G）

七、噬菌體的噬菌作用

噬菌體（bacteriophage）具有嚴(yán)格寄生性，對相應(yīng)的易感細(xì)胞，具有高度的

種特異性和型特異性。感染細(xì)胞后，或者裂解宿主細(xì)胞，或者處于溶原狀態(tài)?？?/p>

應(yīng)用噬菌體作細(xì)菌的鑒定、分型、檢查未知細(xì)菌和防治某些疾病。

【材料與方法】

1.噬菌體的溶菌現(xiàn)象

（1）取4支肉湯管，2支接種金黃色葡萄球菌，2支接種大腸桿菌。

（2）將上述兩種菌肉湯管各取1支，分別加入金黃色葡萄球菌噬菌體肉湯液

0.2mlo

（3）將上述4支肉湯管，置37℃培養(yǎng)6~12小時(shí)后觀察結(jié)果。

2.噬菌體的溶菌斑

（1）取普通瓊脂平板1只，分為4等分，注明①、②、③、④。

（2）用無菌棉簽在①、②處涂布接種痢疾桿菌，在③處接種大腸桿菌，在

④處接種白色葡萄球菌。

（3）在②、③、④處各加1小滴痢疾桿菌噬菌體肉泌液，在①處加1滴肉湯。

（4）置37℃培養(yǎng)16~18小時(shí)后觀察結(jié)果。

圖5噬菌體的溶菌斑

【結(jié)果】

1.溶菌現(xiàn)象加有噬菌體的金黃色葡萄球菌肉湯管清亮，其余均混濁。

2.溶菌斑如圖5,在②處的中央有一無菌生長的空斑，即溶菌斑（或蝕斑），

其余部位無此現(xiàn)象。

八、紫外線的殺菌試驗(yàn)

【原理】

波長240nm~280nm的紫外線，因與DNA吸收光譜一致，而具有明顯的殺菌

作用。其機(jī)制是使細(xì)菌DNA鏈中兩個(gè)相鄰的胸腺喀咤形成二聚體，從而破壞DNA

構(gòu)型，干擾其正常復(fù)制，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

【材料】

1.菌種：大腸桿菌18~24小時(shí)瓊脂斜面培養(yǎng)物。

2.培養(yǎng)基：普通瓊脂平板。

3.無菌黑色圖案紙片，紫外線燈，消毒液。

【方法】

1.用接種環(huán)取大腸桿菌瓊脂斜面培養(yǎng)物，密涂于普通瓊脂平板培養(yǎng)基表面。

2.火焰滅菌小鑲子、待稍涼后，打開平皿蓋，取無菌黑紙片一片平貼于涂

有細(xì)菌的平板培養(yǎng)基表面中間。

3.將平板暴露于距紫外燈管20~30cm處，打開紫外線燈照射30分鐘。

4.照射完畢，無菌操作取出黑紙片，投入消毒液中，蓋上皿蓋，做標(biāo)記，

注明日期，試驗(yàn)者等。

5.置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)，觀察培養(yǎng)基表面細(xì)菌生長情況、并分析其結(jié)果。

【結(jié)果】

黑紙片遮蓋處細(xì)菌生長形成灰白色菌苔，形狀同黑紙片形狀。直接暴露在紫

外線燈下的培養(yǎng)基表面無生長或僅有少量的細(xì)菌生長，形成菌落。

【應(yīng)用】

紫外線的殺菌力雖強(qiáng)，但穿透力弱，故僅用于實(shí)驗(yàn)室、手術(shù)室空氣及物體表

面的消毒滅菌。

【注意事項(xiàng)】

殺菌波長的紫外線對人體皮膚，眼睛有損傷作用，使用時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。

九、濾過除菌

【原理】

濾過是一種機(jī)械除菌法，主要用于一些不耐高溫液體的除菌，例如：血清、

毒素、抗毒素、藥物等。但濾過不能除去病毒、支原體和L型細(xì)菌。

【材料】

1.待濾的血清肉湯（燒瓶分裝、有菌）。

2.肉湯管

3.濾器（已滅菌）和過濾裝置、無菌刻度吸管和試管等。

【方法】

1.無菌取一環(huán)待濾血清肉湯接種于肉湯管內(nèi)。

2.將燒瓶中的血清肉湯倒入濾斗，啟動抽氣機(jī)，減壓抽濾。濾畢，關(guān)閉抽

氣機(jī)。迅速以無菌刻度吸管吸取瓶中濾液，移置于無菌試管中。

3.無菌取一環(huán)濾液接種于另1管肉湯。

4.將2管肉湯置37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。

【結(jié)果】

接種待濾血清肉湯的管呈混濁，接種已濾血清肉湯的管澄清。

第四次實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1:血漿凝固酶試驗(yàn)（操作）

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2：腸桿菌科細(xì)菌的檢測（綜合實(shí)驗(yàn)一）

1）糞便材料的分離、培養(yǎng)一鑒別培養(yǎng)基；

2）次日，雙糖鐵培養(yǎng)基接種初步鑒定。

實(shí)驗(yàn)七病原性球菌的檢測

一、主要病原性球菌的形態(tài)、培養(yǎng)特征

【形態(tài)示數(shù)】

1.葡萄球菌（革蘭染標(biāo)本）：革蘭染色陽性，為正圓形，呈葡萄串狀排列，

亦有單個(gè)散在分布。

2.鏈球菌（革蘭染色標(biāo)本）：革蘭染色陽性，圓形或卵圓形，呈鏈狀排列。

3.肺炎雙球菌（小鼠腹腔液涂片，HiSS染色）：革蘭陽性球菌，矛頭狀成

雙排列，平端相對，尖端相背。莢膜染色片中，菌體呈紅色，菌體周圍的莢膜呈

淡紅色或無色。

4.腦膜炎雙球菌（腦脊液涂片，美蘭染色）：革蘭陰性球菌，腎形成雙排

列，凹面相對，菌體呈淺蘭色，多位于中性粒細(xì)胞漿內(nèi)，胞漿外也有少數(shù)散在分

布。

【培養(yǎng)特征】

1.葡萄球菌在血液瓊脂平板上的生長表現(xiàn)：菌落為圓形，中等大小，表面

光滑，邊緣整齊，不透明；金黃色葡萄球菌菌落呈現(xiàn)金黃色，而白色葡萄球菌,

檸檬色葡萄球菌菌落呈白色或檸檬色（如菌落色素不易區(qū)別時(shí)，用白紙片沾菌落

少許有助觀察）；金黃色葡萄球菌的菌落周圍多有透明溶血環(huán)，而其他葡萄球菌

一般無溶血環(huán)（僅少數(shù)新分離白色葡萄球菌可呈現(xiàn)微溶血現(xiàn)象）。

2.鏈球菌在血液瓊脂平板上的生長表現(xiàn)：除丙型鏈球菌外，菌落均較微小,

如針尖大，圓形，灰色，半透明。根據(jù)溶血性將鏈球菌分為三類。甲型鏈球菌的

菌落周圍有小的草綠色溶血環(huán)，乙型鏈球菌有較大的透明溶血環(huán)，丙型鏈球菌不

溶血。

二、葡萄球菌血漿凝固酶試驗(yàn)（操作）

【原理】

血漿凝固酶試驗(yàn)是區(qū)別致病性葡萄球菌與非致病葡萄球菌的最重要指標(biāo)。致

病性葡萄球能產(chǎn)生血漿凝固酶，此酶的作用類似凝血酶原，在血漿中激活劑的作

用下，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白，從而導(dǎo)致血漿凝固（呈

現(xiàn)塊狀或顆粒狀）。非致病性葡萄球菌不產(chǎn)生此酶，因而不能凝固血漿。此酶有

兩種存在形式：結(jié)合于細(xì)胞壁上血漿凝固酶，采用玻片法測；游離形式的血漿凝

固酶，采用試管法檢測。

【材料】

1.金黃色、白色葡萄球菌瓊脂斜面18~24小時(shí)培養(yǎng)物。

2.1:2人或兔血漿。

3.生理鹽水、玻片、接種環(huán)等。

【方法】

1.取載玻片一張，用蠟筆分成三等份。

2.于第一、二格內(nèi)滴加入血漿各1滴，于第三格內(nèi)滴加生理鹽水1滴。

3.取金黃色葡萄球菌斜面培養(yǎng)物少許，分別混懸于第三格及第一格內(nèi)，取

白色葡萄菌混懸于第二格內(nèi)，分別研磨混勻。靜置2~3分鐘。

【結(jié)果】

第三格和第二格中細(xì)菌呈出均勻混濁，而第一格中細(xì)菌呈現(xiàn)塊裝或顆粒狀凝

固現(xiàn)象，即判定為血漿凝固酶陽性。

三、抗鏈球菌溶血素“0”試驗(yàn)

【原理】

鏈球菌“0”溶血素是A族溶血性鏈球菌的代謝產(chǎn)物之一，能溶解人或兔的

紅細(xì)胞，對氧敏感，如與空氣中的氧接觸；能使蛋白質(zhì)上的-SH基氧化成-S-S基,

失去溶血活性。在實(shí)驗(yàn)中可借還原劑的作用，使它重新恢復(fù)溶血活力。

溶血素“0”具有很強(qiáng)的抗原性，人感染該菌后，2~3周產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，

此種抗體能中和溶血素“0”的溶血活力。因此，測定患者血清中抗鏈球菌溶血

素“0”抗體的效價(jià)，可作為風(fēng)濕熱等疾病的輔助診斷。抗“0”試驗(yàn)的效價(jià)是

指完全不溶血之血清最高稀釋度。

【材料】

1.患者血清：1：50稀釋

2.溶血素“0”及還原劑片劑（按說明配制）

3.1%兔紅細(xì)胞

4.生理鹽水，試管、吸管，37℃水浴箱等。

【方法】

1.取清潔小試管5支，依次排列編號。

2.于第一管注入生理鹽水1.8ml,第二管0.1mL第三管0.2ml,第四管0.3ml,

第五管0.5ml。

3.于第一管注入0.2ml1：50稀釋的患者的血清，反復(fù)吹吸三次，混勻。吸

出0.4注入第二管，吸出0.3ml注入第三管，吸出0.2ml注入第四管，吸出0.6ml棄

去，第五管不加，作為對照管，此時(shí)，各管的血清稀釋度為1:500、1:625、1:833、

l:1250o

4.于每管注入還原溶血素“O”0.25ml,置37℃水浴15分鐘。

5.取出后于每管注入1%紅細(xì)胞懸液0.25ml,置37℃水浴45分鐘，觀察結(jié)果。

抗“O”試驗(yàn)操作表

材12345

管號

生理鹽水1.80.10.20.30.5（棄去0.6）

1：50稀釋血清(ml)0.20.40.30.2-

血清稀釋度1:5001:6251:8331:1250對照

還原溶血素“0”0.250.250.250.250.25

置37℃水浴45分鐘

1%紅血球0.250.250.250.250.25

置37℃水浴45分鐘

【結(jié)果】

先觀察對照管，再依次觀察試驗(yàn)管，溶血者上清呈透明紅色為抗“O”抗體

陰性。不溶血者呈均勻混濁為抗“O”抗體陽性。以完全不溶血之血清最高稀釋

度作為抗體的效價(jià)。

效價(jià)在1：500單位以上者表示病人曾經(jīng)受過溶血性鏈球菌感染，多次試驗(yàn)逐

步增高者可作為活動性風(fēng)濕病的輔助診斷。逐漸下降者，多處于緩解期。；恒定

不變者，多為非活動期。

四、肺炎雙球菌小鼠毒力試驗(yàn)

肺炎球菌中，有少數(shù)菌不產(chǎn)生莢膜，故無致病力，具有莢膜的肺炎球菌致病

力強(qiáng)，小白鼠對肺炎球菌很敏感，故可用作肺炎球菌的毒力鑒定，同時(shí)可用以純

化肺炎球菌。

【材料與方法】

1.取20g左右重的健康小白鼠1只，腹腔或皮下注射肺炎菌菌液0.2ml,飼養(yǎng)

觀察。

2.待瀕臨死亡時(shí)，及時(shí)解剖，取心血接種血平板作細(xì)菌培養(yǎng)。

3.取其腹腔液涂片，作莢膜染色鏡檢。

【結(jié)果】

1.有毒力的肺炎球菌，能使小白鼠在注射菌液后12~36小時(shí)瀕臨死亡。

2.血培養(yǎng)可獲得肺炎球菌純培養(yǎng)物。

3.有毒力的肺炎球菌，莢膜染色鏡檢，可見有明顯的莢膜。

【注意事項(xiàng)】

1.在實(shí)驗(yàn)中要特別注意無菌操作。

2.實(shí)驗(yàn)中，可用無毒力的肺炎球菌作對照實(shí)驗(yàn)。

五、臨床標(biāo)本中化膿性球菌的分離鑒定

從臨床標(biāo)本中分離鑒別化膿性球菌時(shí)，可根據(jù)各種化膿球菌不同的生物學(xué)特

征，直接涂片鏡檢、分離培養(yǎng)等方法，鑒定出未知的化膿球菌，不僅可為化膿性

感染的臨床診斷提供依據(jù)，而且可進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，為臨床選用有效的抗菌藥

物提供參考。

1.標(biāo)本的采集和處理

(1)膿標(biāo)本用無菌棉簽，蘸取患處深部膿液少許，置入無菌小試管內(nèi)，

送檢。

(2)痰標(biāo)本、用無菌棉簽，挑取病人膿稠痰塊，置放無菌小試管內(nèi)，送檢。

(3)咽喉部標(biāo)本令病人把口張大，用壓舌板壓住舌根部，用無菌棉簽，

迅速蘸取咽喉部分泌物，置入無菌小試管，送檢。

(4)血標(biāo)本疑為化膿性球菌敗血癥患者，在嚴(yán)格無菌操作下，靜脈采血

5n11,直接加入50ml的肉湯瓶內(nèi)，立即搖勻，送檢。

(5)腦脊液標(biāo)本在嚴(yán)格無菌操作下，作腰椎穿刺取腦脊液，送檢。

2.檢驗(yàn)程序根據(jù)檢查的目的要求，按下圖所示，進(jìn)行檢查。

「形態(tài)

排列

（涂片染色鏡檢

結(jié)構(gòu)

、染色性

一菌落特點(diǎn)

膿、痰、咽喉拭子\，觀察生長情況Y溶血性

病灶分泌物標(biāo)本\

、色素

涂片染色鏡檢

直接《

轉(zhuǎn)種液體,定向性

接種

【血平板培養(yǎng)基特殊試驗(yàn)

'生化反應(yīng)

TI挑選可疑菌落轉(zhuǎn)種血

Y動物試驗(yàn)

斜面

、血清學(xué)試驗(yàn)

血液i（直接接種）、內(nèi)L

------------?肉湯瓶I藥敏試驗(yàn)

穿刺液J

（培養(yǎng)生長后）

涂片染色鏡檢

【注意事項(xiàng)】

1.上面只表明一般的檢查原則，在實(shí)驗(yàn)檢查中，還需